CN108459119B - 一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法，包括步骤：S1.样品前处理，S2.标准溶液和衍生试剂的配制，S3.在线衍生和分离；S4.定性和定量分析。本发明通过结合在线衍生技术和高效液相色谱/荧光检测技术实现了简便、灵敏、准确地测定大气中以氨基酸和有机胺为代表的极性有机含氮化合物。

Description

一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法

技术领域

本发明属于大气化学领域，特别涉及一种测定大气中的极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法。

背景技术

氮是全球生物体所必需的营养元素，大气中的氮对全球生物地球化学循环有重要贡献。虽然氮气是大气中氮的主要组成，但是惰性的氮气仅能被少数具有固氮功能的生物所吸收利用，而多数生物吸收利用的是化合态氮。

目前对大气中化合态氮的研究主要集中在无机含氮化合物，而对有机含氮化合物的研究相对较少。但越来越多的研究表明，大气中的有机含氮化合物普遍存在于大气环境中，在全球大气总氮的平均占比约为1/3，随地区不同而不同。比如，Miyazaki et al.(2014)发现日本北部的落叶阔叶林大气中水溶性有机氮对水溶性总氮的年平均贡献为20±11%；Mace et al. (2003)发现亚马逊地区PM₁₀中存在较高浓度的水溶性有机氮，其水溶性有机氮对总氮在湿季和干季的贡献分别为43%和45%。

为准确评价大气有机氮的环境效应，对其化学组成进行准确的定性和定量研究是十分必要的。大气中有机含氮化合物的种类繁多，其中氨基酸和有机胺较为常见和重要。目前同时测定大气中氨基酸和有机胺的方法较少，主要有以下两种：一种是利用氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯作为衍生试剂，利用高效液相色谱法对其进行分析。该方法最早于1993年Cohen et al.(1993)报道，通过合成氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯，利用高效液相色谱对氨基酸进行检测。Mader et al.(2004)将氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯作为氨基酸和有机胺的衍生试剂，应用于亚洲太平洋上空大气中有机含氮化合物的测定，但该研究中并未对其色谱条件和方法的可靠性进行说明。另外，以氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯作为衍生试剂虽是一种较为成熟的方法，具有准确、灵敏等优点，但其操作复杂、成本较高。另一种是利用邻苯二甲醛作为氨基酸和有机胺的共同衍生试剂。最早邻苯二甲醛也是仅作为氨基酸的衍生试剂被报道，后来先后被Mopper et al.(1987)、Gorzelska et al.(1992)、Zhang et al.(2003)、Yang et al.(2005)和Ho et al.(2015)直接应用于大气中氨基酸和有机胺的检测，但都采用邻苯二甲醛离线衍生的方式，而且并未对该方法进行详细的描述和验证，同时存在色谱峰共流出等问题。Zhang et al. (2003)利用邻苯二甲醛作为衍生试剂，但并未实现甘氨酸和苏氨酸的分离，未对两者进行准确定量，而甘氨酸是大气中普遍存在且浓度较高的氨基酸，对其准确定量很有必要。可见，上述两种用于同时测定大气中有机胺和氨基酸的方法，其仪器条件均未详细描述，其方法的可靠性也未被验证，而且存在分离度欠佳、分析时间长和重现性差等问题，并且所采用的离线衍生方式操作繁琐且存在不可避免的人为误差。

鉴于此，本发明人结合在线衍生技术和高效液相色谱/荧光检测技术建立了一种简便、灵敏、准确、同时测定大气中以氨基酸和有机胺为代表的极性有机含氮化合物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时、简便、灵敏、准确地测定大气中极性有机含氮化合物的在线衍生/高效液相色谱法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法，包括以下步骤：

S1. 样品前处理

取采样过的石英滤膜作为样品，先剪碎，加入30 mL甲醇，在0 ℃下超声萃取45min，萃取液经0.45 µm PTFE滤膜过滤，氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，得样品溶液；同时，取同批次的空白石英滤膜与样品同步进行样品前处理，得空白样品溶液；

S2. 标准溶液和衍生试剂的配制

S21. 标准溶液的配制

有机胺标准品，其含2.0 mol/L甲胺、2.0 mol/L乙胺、纯度≥99%的丙胺、丁胺、戊胺、己胺和苯乙醇胺，先将所述有机胺标准品配制成浓度为1000 mg/L的混合标准溶液，再用甲醇稀释得到浓度为10 mg/L的有机胺混合标准溶液，并保存在-20 ℃冰箱中待用；

氨基酸标准品：含丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、络氨酸、缬氨酸和赖氨酸，浓度均为2.5 µmol/mL，先将所述氨基酸标准品用甲醇稀释成浓度为250 µmol/L氨基酸标准储备液，再将250 µmol/L氨基酸标准储备液与浓度为10 mg/L的有机胺标准溶液按1：1体积混合，得到氨基酸和有机胺的混合标准溶液，再用甲醇将混合标准溶液逐级稀释成多个浓度梯度的标准曲线溶液及其构成的标准曲线，其中氨基酸和有机胺的标准曲线范围分别为：0.125-125 μM/L和2.5-5000 μg/L；

S22. 衍生试剂配制

硼酸盐缓冲液：0.1 M Na₂B₄O₇·10 H₂O，pH调至10.2；

OPA衍生试剂：7.5 mM 邻苯二甲醛和225 mM 3-巯基丙酸溶于0.1 M硼酸缓冲液；

进样稀释液：1 M 醋酸溶液；

S3. 在线衍生和分离

S31. 在线衍生

将前述标准曲线溶液、样品溶液及空白样品溶液分别通过高效液相色谱仪上自动进样器的自动混合和控温功能，实现邻苯二甲醛与目标化合物的在线衍生；

S32.分离

衍生反应完后衍生物通过自动进样器自动进样至色谱柱进行分离，分离的目标化合物后流入分析柱，由分析柱进行色谱分析后，进入荧光检测器进行定量检测；

S4. 定性和定量分析

S41. 定性分析：当目标化合物在所优化的检测条件下完全分离，且当样品溶液中目标化合物的保留时间和混合标准溶液的保留时间误差在5%之内，则判断样品中含有目标化合物；

S42. 定量分析

当连续九次进样浓度为100 µg/L的混合标准溶液，得到目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于5%，各个目标化合物色谱图的标准曲线具有良好的线性，且方法回收率在70-130%范围内且目标化合物不受样品基质影响，则认为该测定方法适用于大气中极性有机含氮化合物的测定，当某一目标化合物在样品中的信噪比≥10，则判定该目标化合物在该样品中有检出。

进一步，高效液相色谱仪的仪器条件如下：

进样体积：10 µL；

自动进样器温度：25 ℃

保护柱：ThermoScientific C18，5 µm，4.6 mm*10 mm；

分析柱：ThermoScientific Hypersil Gold，5 µm，4.6 mm*150 mm；

柱温： 35 ℃ ；

流动相：流动相A：50 mM KH₂PO₄溶液，pH4.6；流动相B：ACN：MeOH：H₂O体积比为45：45：10；

流动相梯度：0-3 min， 28% B； 3-22 min， 28-80% B； 22-27 min， 80% B； 27-27.5 min， 80-28% B； 27.5-30 min， 28% B；

流速：1.5 mL/min；

检测波长：激发波长：230 nm； 发射波长：450 nm。

采用上述方案后，本发明有益效果为：本发明利用在线衍生技术的简便性、荧光技术的选择性以及高效液相色谱技术的高效分离能力，建立了有效、同时测定以氨基酸和有机胺为代表的极性有机含氮化合物的方法，该方法具有简便、灵敏、准确以及分离度佳等优点，对研究有机胺对二次气溶胶、人类健康的影响以及有机含氮化合物对生物地球化学循环的贡献有重要意义。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是本发明一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法的流程简图；

图2是氨基酸(1.25μmol/L)和有机胺(50μg/L)混合标准溶液的色谱分离图；

图3是样品溶液的色谱分离图。

具体实施方式

如图1所示，本实施例揭示的一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法，包括以下步骤：

S1. 样品前处理

取采样过的石英滤膜作为样品，先剪碎，加入30 mL甲醇，在0 ℃下超声萃取45min，萃取液经0.45 µm PTFE滤膜过滤，氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，得样品溶液；同时，取同批次的空白石英滤膜与样品同步进行样品前处理，得空白样品溶液；

S2. 标准溶液和衍生试剂的配制

S21. 标准溶液的配制

有机胺标准品，其含2.0 mol/L甲胺、2.0 mol/L乙胺、丙胺（纯度≥99%）、丁胺（纯度≥99%）、戊胺（纯度≥99%）、己胺（纯度≥99%）和苯乙醇胺（纯度≥99%），先将所述有机胺标准品配制成浓度为1000 mg/L的混合标准溶液，再用甲醇稀释得到浓度为10 mg/L的有机胺混合标准溶液，并保存在-20 ℃冰箱中待用；

氨基酸标准品：含丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、络氨酸、缬氨酸和赖氨酸，浓度均为2.5 µmol/mL，先将所述氨基酸标准品用甲醇稀释成浓度为250 µmol/L氨基酸标准储备液，再将250 µmol/L氨基酸标准储备液与浓度为10 mg/L的有机胺标准溶液按1：1体积混合，得到氨基酸和有机胺的混合标准溶液，再用甲醇将混合标准溶液逐级稀释成多个浓度梯度的标准曲线溶液及其构成的标准曲线，标准曲线溶液保存在-20 ℃冰箱中待用，其中氨基酸和有机胺的标准曲线范围分别为：0.125-125 μM/L和2.5-5000 μg/L；

S22. 衍生试剂配制

硼酸盐缓冲液：0.1 M Na₂B₄O₇·10 H₂O，pH调至10.2；

OPA衍生试剂：7.5 mM 邻苯二甲醛和225 mM 3-巯基丙酸溶于0.1 M硼酸缓冲液，每次实验所需的OPA溶液应在上机前新鲜配制；

进样稀释液：1 M 醋酸溶液；

S3. 在线衍生和分离

S31. 在线衍生

将前述标准曲线溶液、样品溶液及空白样品溶液分别通过高效液相色谱仪上自动进样器的自动混合和控温功能，实现邻苯二甲醛与目标化合物的在线衍生；在线衍生的条件包括：（1）氨基酸和有机胺具有相同的功能团，可与同种衍生试剂（邻苯二甲醛）发生反应，因此本发明的测定方法有望推广至于氨基酸和有机胺具有类似功能团的极性含氮化合物的检测；（2）邻苯二甲醛可同时与氨基酸、有机胺发生反应，且所需的衍生条件较为温和（在室温下5min内即可完成反应）；（3）高效液相色谱系统的自动进样器具有控温和自动混合功能，且该衍生所需的温度在温控范围内。

S32.分离

衍生反应完后衍生物通过自动进样器自动进样至色谱柱进行分离，分离的目标化合物后流入分析柱，由分析柱进行色谱分析后，进入荧光检测器进行定量检测；

本实施例采用的高效液相色谱仪的仪器条件如下：

进样体积：10 µL；

自动进样器温度：25 ℃

保护柱：ThermoScientific C18，5 µm，4.6 mm*10 mm；

分析柱：ThermoScientific Hypersil Gold，5 µm，4.6 mm*150 mm；

柱温： 35 ℃ ；

流动相：流动相A：50 mM KH₂PO₄溶液，pH4.6；流动相B：ACN：MeOH：H₂O体积比为45：45：10；

流动相梯度：0-3 min， 28% B； 3-22 min， 28-80% B； 22-27 min， 80% B； 27-27.5 min， 80-28% B； 27.5-30 min， 28% B；

流速：1.5 mL/min；

检测波长：激发波长：230 nm； 发射波长：450 nm。

参见图2，1.25 μmol/L氨基酸和50 μg/L有机胺混合标准溶液的色谱分离图；其中1-22分别表示，1-组氨酸，2-天冬氨酸，3-丝氨酸，4-精氨酸，5-谷氨酸，6-甘氨酸，7-苏氨酸，8-丙氨酸，9-酪氨酸，10-乙醇胺，11-蛋氨酸，12-缬氨酸，13-苯丙氨酸，14-甲胺，15-异亮氨酸，16-亮氨酸，17-乙胺，18-赖氨酸，19-丙胺，20-丁胺，21-戊胺，22-己胺；

参见图3为样品溶液的色谱分离图，其中1-14分别表示，1-丝氨酸，2-精氨酸，3-甘氨酸，4-苏氨酸，5-丙氨酸，6-乙醇胺，7-蛋氨酸，8-苯丙氨酸，9-甲胺，10-乙胺，11-精氨酸，12-丙胺，13-丁胺，14-戊胺；

S4. 定性和定量分析

S41. 定性分析：当目标化合物在所优化的检测条件下完全分离，且当样品溶液中目标化合物的保留时间和混合标准溶液的保留时间误差在5%之内，则判断样品中含有目标化合物；

S42. 定量分析

当连续九次进样浓度为100 µg/L的混合标准溶液，得到目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于5%，各个目标化合物色谱图的标准曲线具有良好的线性，且方法回收率在70-130%范围内且目标化合物不受样品基质影响，则认为该测定方法适用于大气中极性有机含氮化合物的测定，当某一目标化合物在样品中的信噪比≥10，则判定该目标化合物在该样品中有检出。

以上仅为本发明的具体实施例，并非对本发明的保护范围的限定。

凡依本案的设计思路所做的等同变化，均落入本案的保护范围。

Claims (1)

1.一种测定极性有机含氮化合物的在线衍生高效液相色谱法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 样品前处理

取采样过的石英滤膜作为样品，先剪碎，加入30 mL甲醇，在0 ℃下超声萃取45 min，萃取液经0.45 µm PTFE滤膜过滤，氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，得样品溶液；同时，取同批次的空白石英滤膜与样品同步进行样品前处理，得空白样品溶液；

S2. 标准溶液和衍生试剂的配制

S21. 标准溶液的配制

有机胺标准品，其含2.0 mol/L甲胺、2.0 mol/L乙胺、纯度≥99%的丙胺、丁胺、戊胺、己胺和苯乙醇胺，先将所述有机胺标准品配制成浓度为1000 mg/L的混合标准溶液，再用甲醇稀释得到浓度为10 mg/L的有机胺混合标准溶液；

氨基酸标准品：含丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、络氨酸、缬氨酸和赖氨酸，浓度均为2.5 µmol/mL，先将所述氨基酸标准品用甲醇稀释成浓度为250 µmol/L氨基酸标准储备液，再将250 µmol/L氨基酸标准储备液与浓度为10 mg/L的有机胺标准溶液按1：1体积混合，得到氨基酸和有机胺的混合标准溶液，再用甲醇将混合标准溶液逐级稀释成多个浓度梯度的标准曲线溶液及其构成的标准曲线，其中氨基酸和有机胺的标准曲线范围分别为：0.125-125 μM/L和2.5-5000 μg/L；

S22. 衍生试剂配制

硼酸盐缓冲液：0.1 M Na₂B₄O₇·10 H₂O，pH调至10.2；

OPA衍生试剂：7.5 mM 邻苯二甲醛和225 mM 3-巯基丙酸溶于0.1 M硼酸缓冲液；

进样稀释液：1 M 醋酸溶液；

S3. 在线衍生和分离

S31. 在线衍生

将前述标准曲线溶液、样品溶液及空白样品溶液分别通过高效液相色谱仪上自动进样器的自动混合和控温功能，实现邻苯二甲醛与目标化合物的在线衍生；

其中高效液相色谱仪的仪器条件如下：

进样体积：10 µL；

自动进样器温度：25 ℃

保护柱：ThermoScientific C18，5 µm，4.6 mm*10 mm；

分析柱：ThermoScientific Hypersil Gold，5 µm，4.6 mm*150 mm；

柱温： 35 ℃ ；

流动相：流动相A：50 mM KH₂PO₄溶液，pH4.6；流动相B：ACN：MeOH：H₂O体积比为45：45：10；

流动相梯度：0-3 min， 28% B； 3-22 min， 28-80% B； 22-27 min， 80% B； 27-27.5min， 80-28% B； 27.5-30 min， 28% B；

流速：1.5 mL/min；

检测波长：激发波长：230 nm； 发射波长：450 nm；S32.分离

衍生反应完后衍生物通过自动进样器自动进样至色谱柱进行分离，分离的目标化合物后流入分析柱，由分析柱进行色谱分析后，进入荧光检测器进行定量检测；

S4. 定性和定量分析

S41. 定性分析：当目标化合物在所优化的检测条件下完全分离，且当样品溶液中目标化合物的保留时间和混合标准溶液的保留时间误差在5%之内，则判断样品中含有目标化合物；

S42. 定量分析

当连续九次进样浓度为100 µg/L的混合标准溶液，得到目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于5%，各个目标化合物色谱图的标准曲线具有良好的线性，且方法回收率在70-130%范围内且目标化合物不受样品基质影响，则认为该测定方法适用于大气中极性有机含氮化合物的测定，当某一目标化合物在样品中的信噪比≥10，则判定该目标化合物在该样品中有检出。

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