CN111141856A - 同时检测发酵液中l-高丝氨酸和游离氨基酸的hplc方法 - Google Patents

同时检测发酵液中l-高丝氨酸和游离氨基酸的hplc方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时检测发酵液中L‑高丝氨酸和游离氨基酸的HPLC方法。所述方法是先对发酵液样品进行预处理，接着采用DEEMM衍生化试剂对发酵液样品进行衍生化处理之后，再通过高效液相色谱和通用型C18色谱柱对发酵液中的L‑高丝氨酸和其他游离氨基酸进行分离和测定。本发明的方法使用的配置是高效液相色谱系统的标准液相配置，除了适用于氨基酸分析之外，还可用于其他物质的分析工作，普适性更强，具有检测灵敏度高、样品处理简单、分析时间短、分析结果稳定、重复性好等优点，适用于常规实验室。

Description

同时检测发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸的HPLC方法
(一)技术领域
本发明属于氨基酸检测技术领域，具体为一种同时检测发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸的HPLC方法。
(二)背景技术
氨基酸是构成生物体蛋白的最基本的物质，也是生物体内活性肽、酶和其他生物活性分子的重要组成成分，与生命活动有着密切的关系。迄今为止，自然界以发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸有20多种，被称为基本氨基酸。L-高丝氨酸是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是一种具有多种用途的平台化合物，可用于合成L-蛋氨酸、γ-丁内酯和其他具有高附加值的化学物质。在这些化学物质中，医药级L-蛋氨酸可用于治疗肝脏疾病和其他相关疾病。
现有的氨基酸检测方法多数使用阳离子交换色谱于柱后茚三酮衍生，采用氨基酸分析仪进行氨基酸分析。国家标准GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》用于食品中16种氨基酸(不包括色氨酸和(半)胱氨酸)，GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》能够检测全部18种水解氨基酸。但传统的氨基酸分析仪结构复杂，价格昂贵，且一般不能用作其他物质的检测分析。
随着高效液相色谱(HPLC)技术的发展，使用HPLC技术分析氨基酸也获得了迅速发展，由于HPLC无需特殊反应装置，具有高效、简便、快速、准确的价格低廉的优点，已在许多实验室部分或全部替代氨基酸分析仪，广泛应用于医药行业、化工行业、生物发酵行业的氨基酸检测分析。
吕艳等在《浙江农业科学》2006年第2期的“反向高效液相色谱定量分析多肽中的氨基酸组成”公布了蛋白质氨基酸的检测方法。2010年，李大祥建立了能够检测天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸等18种蛋白质氨基酸的高效液相色谱检测方法。而关于非蛋白质氨基酸和蛋白质氨基酸同时进行检测的高效液相色谱方法却鲜有报道。
(三)发明内容
本发明目的是建立一种能对发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸同时检测的方法。此方法样品前处理简单，成本低，实现了发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸的同时检测分析。
本发明采用的技术方案是：
一种同时检测发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸的HPLC方法，所述方法是先对发酵液样品进行预处理，接着采用DEEMM衍生化试剂对发酵液样品进行衍生化处理之后，再通过高效液相色谱和通用型C18色谱柱对发酵液中的L-高丝氨酸和其他游离氨基酸进行分离和测定；
所述预处理方法为：取发酵液样品于离心管中，10000～12000r/min离心2～3min，收集上清液，用于下一步衍生化；
所述衍生化处理方法为：将上清液稀释5～10倍取稀释液，加入硼酸盐缓冲液和0.5％的DEEMM甲醇溶液，温度60～70℃下衍生化1～2h后，用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液进行下一步分离和测定；每200μL稀释液加入350μL的硼酸盐缓冲液和150μL的0.5％DEEMM甲醇溶液。
优选的，所述高效液相色谱检测条件为：
检测仪器：AgilentTechnologies1260InfinityⅡ高效液相色谱系统；
色谱柱：J&KScientificHPLCC-18Column(4.6×250mm，5μm)；
流动相：流动相A为色谱级甲醇；流动相B为25mmol/L乙酸铵溶液，A:B＝40％：60％，流速0.6mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：250nm。
所述硼酸缓冲液按如下方法配制：称取6.183g硼酸，加入70mL超纯水溶解，用1mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，加超纯水定容至100mL。
所述DEEMM甲醇溶液按如下方法配制：吸取0.5mLDEEMM于100mL容量瓶中，用色谱级甲醇定容至100mL。
以上为定性检测，也可为定量检测，具体方法如下：先配制梯度浓度目标物质(L-高丝氨酸或游离氨基酸)标准品，按照前述相应方法进行预处理、衍生化和高效液相色谱检测后，以色谱峰峰面积为横坐标、标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线，测得待测样品中目标物质色谱峰面积后，对照标准曲线获得待测样品中目标物质的浓度值。通常L-高丝氨酸为定量检测，游离氨基酸为定性检测，根据需要，游离氨基酸也可按前述方法进行定量检测。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的方法使用的配置是高效液相色谱系统的标准液相配置，除了适用于氨基酸分析之外，还可用于其他物质的分析工作，普适性更强，具有检测灵敏度高、样品处理简单、分析时间短、分析结果稳定、重复性好等优点，适用于常规实验室。
(四)附图说明
图1为实施例1中L-高丝氨酸盐酸盐标准品液相色谱图；图1中的数字代表每种氨基酸或杂质的出峰时间；
图2为实施例1中L-高丝氨酸标准曲线，横坐标为L-高丝氨酸色谱峰峰面积，纵坐标为L-高丝氨酸浓度；
图3为实施例2中11种氨基酸混合标品液相色谱图，其中的数字代表每种氨基酸或杂质的出峰时间；
图4为实施例3中发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸色谱图，其中的数字代表每种氨基酸或杂质的出峰时间；
图5为实施例3中丝氨酸标准曲线，横坐标为丝氨酸色谱峰峰面积，纵坐标为丝氨酸浓度。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
L-高丝氨酸盐酸盐标准品的高效液相色谱检测，包括以下步骤：
(1)称取2.75mgL-高丝氨酸盐酸盐标准品，加入1mL超纯水溶解，制成2.75g/L的L-高丝氨酸盐酸盐溶液，并依次稀释为1.375g/L、0.55g/L、0.275g/L的L-高丝氨酸盐酸盐溶液；
(2)将上述L-高丝氨酸盐酸盐溶液各取200μL，加入350μL硼酸缓冲液和150μL的0.5％的DEEMM甲醇溶液，然后在70℃衍生化2h；
所述硼酸缓冲液按如下方法配制：称取6.183g硼酸，加入70mL超纯水溶解，用1mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，加超纯水定容至100mL。
所述DEEMM甲醇溶液按如下方法配制：吸取0.5mLDEEMM于100mL容量瓶中，用纯甲醇定容至100mL。
(3)将上述衍生化后的溶液使用高效液相色谱进行检测，检测方法为：
检测仪器：AgilentTechnologies1260InfinityⅡ高效液相色谱系统；
色谱柱：J&KScientificHPLCC-18Column(4.6×250mm，5μm)；
流动相：流动相A为纯甲醇；流动相B为25mmol/L乙酸铵溶液，A:B＝40％：60％，流速0.6mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：250nm。
(4)按照液相色谱检测结果计算标准曲线，液相色谱图见图1，标准曲线见图2。图1中的数字代表每种氨基酸或杂质的出峰时间，具体的出峰时间对应的氨基酸及其缩写如下表：
出峰时间(min) 氨基酸名称 缩写
8.368 L-高丝氨酸 L-HOM
18.458 杂质
实施例2：
11种氨基酸混合标品液相色谱的高效液相色谱检测，包括以下步骤：
(1)吸取氨基酸混标溶液200μL，加入350μL硼酸缓冲液和150μL的0.5％的DEEMM甲醇溶液，然后在70℃衍生化2h；
(2)将上述衍生化后的溶液使用高效液相色谱进行检测，检测方法为：
检测仪器：AgilentTechnologies1260InfinityⅡ高效液相色谱系统；
色谱柱：J&KScientificHPLCC-18Column(4.6×250mm，5μm)；
流动相：流动相A为纯甲醇；流动相B为25mmol/L乙酸铵溶液，A:B＝40％：60％，流速0.6mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：250nm。
11种氨基酸混合标品液相色谱图参见图3，图3中的数字代表每种氨基酸或杂质的出峰时间，具体的出峰时间对应的氨基酸及其缩写如下表：
出峰时间(min) 氨基酸名称 缩写
2.716 天门冬氨酸 ASP
4.078 苏氨酸 THR
4.677 丝氨酸 SER
5.024 谷氨酸 GLU
7.397 丙氨酸 ALA
9.282 缬氨酸 VAL
13.922 异亮氨酸 ILE
15.674 亮氨酸 LEU
16.415 酪氨酸 TYR
19.798 组氨酸 HIS
实施例3：
发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸色谱检测，包括以下步骤：
(1)取1mL发酵液样品于离心管中，12000r离心2min，收集上清液，用于衍生化。
(2)吸取上清液100μL和氨基酸混标溶液各100μL，加入350μL的1mol/L的硼酸缓冲液，加入150μL的0.5％的DEEMM(乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯)甲醇溶液，温度70℃衍生化2h后，用0.22μm有机滤膜过滤。
(3)将上述衍生化后的溶液使用高效液相色谱进行检测，检测方法为：
检测仪器：AgilentTechnologies1260InfinityⅡ高效液相色谱系统；
色谱柱：J&KScientificHPLCC-18Column(4.6×250mm，5μm)；
流动相：流动相A为纯甲醇；流动相B为25mmol/L乙酸铵溶液，A:B＝40％：60％，流速0.6mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：250nm。
L-高丝氨酸和游离氨基酸色谱图参见图4，图4中的数字代表每种氨基酸或杂质的出峰时间，具体的出峰时间对应的氨基酸及其缩写如下表：
出峰时间(min) 氨基酸名称 缩写
2.716 天门冬氨酸 ASP
4.078 苏氨酸 THR
4.677 丝氨酸 SER
5.024 谷氨酸 GLU
7.397 丙氨酸 ALA
8.394 L-高丝氨酸 L-HOM
9.282 缬氨酸 VAL
13.922 异亮氨酸 ILE
15.674 亮氨酸 LEU
16.415 酪氨酸 TYR
18.568 杂质
19.798 组氨酸 HIS
(4)按照L-高丝氨酸标准曲线对发酵样品中的L-高丝氨酸浓度进行计算，结算结果为发酵液中L-高丝氨酸浓度为11.88g/L。
本实施例对于除L-高丝氨酸的其他氨基酸是定性分析，因为实际实验或者生产过程中，发酵液中不会有如此多种类的其他氨基酸，而且氨基酸的量应该也不会像本实施例中那么多，不一样的实验室或者工厂因为生产菌株或者培养基成分不同，可能会有11种其他氨基酸中的某几种；即便发酵液中氨基酸种类多并且含量高，但是根据附图4可以明显看出来发酵液中各种氨基酸分离程度和峰形依旧良好。当需要对L-高丝氨酸之外的其他氨基酸进行定量分析时，应当首先对这种氨基酸进行标准品检测，绘制标准曲线，然后进行计算。本实施例以丝氨酸为例，按照实施例1方法绘制了标准曲线(参见图5)，并计算了丝氨酸浓度，其浓度为0.55g/L。

Claims (5)

1.一种同时检测发酵液中L-高丝氨酸和游离氨基酸的HPLC方法，其特征在于先对发酵液样品进行预处理，接着采用DEEMM衍生化试剂对发酵液样品进行衍生化处理之后，再通过高效液相色谱和通用型C18色谱柱对发酵液中的L-高丝氨酸和其他游离氨基酸进行分离和测定；
所述预处理方法为：取发酵液样品于离心管中，10000～12000r/min离心2～3min，收集上清液，用于下一步衍生化；
所述衍生化处理方法为：将上清液稀释5～10倍取稀释液，加入硼酸盐缓冲液和0.5％的DEEMM甲醇溶液，温度60～70℃下衍生化1～2h后，用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液进行下一步分离和测定；每200μL稀释液加入350μL的硼酸盐缓冲液和150μL的0.5％DEEMM甲醇溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测为定量检测，先配制梯度浓度目标物质标准品，按照相应方法进行预处理、衍生化和高效液相色谱检测后，以色谱峰峰面积为横坐标、标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线，测得待测样品中目标物质色谱峰面积后，对照标准曲线获得待测样品中目标物质的浓度值。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱检测条件为：检测仪器：AgilentTechnologies1260InfinityⅡ高效液相色谱系统；
色谱柱：J&KScientificHPLCC-18Column(4.6×250mm，5μm)；
流动相：流动相A为色谱级甲醇；流动相B为25mmol/L乙酸铵溶液，A:B＝40％：60％，流速0.6mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：250nm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述硼酸缓冲液按如下方法配制：称取6.183g硼酸，加入70mL超纯水溶解，用1mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，加超纯水定容至100mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述DEEMM甲醇溶液按如下方法配制：吸取0.5mLDEEMM于100mL容量瓶中，用色谱级甲醇定容至100mL。
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