CN110530999A

CN110530999A - 一种驯鹿角的真伪鉴别方法

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Publication number: CN110530999A
Application number: CN201910879610.6A
Authority: CN
Inventors: 王玉团; 邢晟; 杭宝建; 陈晓; 由鹏飞; 石峰
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明涉及中药鉴别技术领域,特别涉及一种驯鹿角的真伪鉴别方法：将待检样品使用胰蛋白酶酶解后，使用超高效液相色谱仪和高分辨质谱仪进行检测。采用精准离子和相对保留时间两种方式相结合的方法来判断质谱峰的有无，进而来判断驯鹿角的真伪，提高了检测方法的准确度，优于采用单一方式的方法。

Description

一种驯鹿角的真伪鉴别方法

技术领域

本发明涉及中药鉴别技术领域,特别涉及一种驯鹿角的真伪鉴别方法。

背景技术

驯鹿角为鹿科空齿鹿亚科驯鹿属驯鹿动物的角，具有温补肝肾、消肿祛瘀之功效，用于治疗乳痈初起、阴疽疮痛、淤血肿痛、腰脊冷痛等症。本品在国内应用较为广泛，但一直缺乏有效的真伪检测方法。

驯鹿角现行的质量标准收载于2001年版《黑龙江省中药材标准》，标准中仅收载了整支鹿角的外观性状项描述内容，无其它有效检验项目。因本品作为药用需经过镑片、锯成小段、劈成小钉、磨成粉末或熬制成胶等，性状发生了根本性变化，已经无法用肉眼根据外观性状对其进行真伪判断。相关文献有采用理化、薄层或荧光等鉴别方法的报道，但无法对来源于鹿科的不同鹿角进行准确鉴别。

2015年版《中国药典》一部鹿角胶鉴别项下有采用三重四级杆质谱，电喷雾正离子模式，多反应监测，选择质荷比(m/z)765.4(双电荷)→554.0和(m/z)765.4(双电荷)→733.0检测条件用来鉴别鹿角，该检测条件主要基于多肽GYPGNAGPVGTAGAPGPQGPVGPTGK或其多种修饰的多肽，该类多肽在鹿科动物角中普遍存在，不能区分驯鹿角与其他鹿角。另文献《光谱学与光谱分析》2008年第28卷第10期中“高效液相色谱质谱鉴别龟甲胶与鹿角胶”一文采用特征多肽GPSGPQGPSGPPGPK及其检测离子(m/z)667.4进行鉴别鹿角胶，该多肽在鹿科动物角中普遍存在，但此方法不能区分驯鹿角与其他鹿角。CN201710316859一种梅花鹿鹿茸与鹿角的鉴别方法公布了一种鉴别梅花鹿茸与鹿角的肽聚糖蛋白的检测方法，该方法同样也无法用于区分驯鹿角与其他鹿角。CN201710042388用于检测龟甲胶、鹿角胶、阿胶及其伪品胶中驴皮源成分含量的组合物、试剂盒及检测方法公布的方法，仅能用于上述几种胶共有多肽的定量检测方法，该方法无法用于区分驯鹿角与其他鹿角。

因不同来源的驯鹿角与其它鹿角其功效和价格存在明显差异，故急需建立驯鹿角专属性的检验方法，以确保临床用药的安全性和有效性。

发明内容

为了解决以上现有技术中无法将驯鹿角与其他鹿角有效区分的问题，本申请公开了一种驯鹿角的真伪鉴别方法，可以将驯鹿角与其他鹿角有效区分。

高分辨质谱方法具有样品用量少、检测速度快等优点，目前广泛应用于药品检测领域，特别是对痕量物质检测及真伪检测方面具有很大优势，特别是与三重四级杆质谱相比较具有更高的检测灵敏度，其检测结果更加可靠准确。驯鹿角及鹿科驼鹿角、水鹿角、狍鹿角、马鹿角和梅花鹿角等角的化学组成均主要为胶原蛋白，故一般的物理、化学等方法很难将其区分开来，但不同鹿角的胶原蛋白种类存在差异，故可以将胶原蛋白进行适当酶解，通过超高效液相串联高分辨质谱仪对酶解后样品进行分离和m/z全扫描，然后提取适当的m/z，通过m/z质谱峰的有无来进行真伪判断，并进一步通过计算参照物中参照峰的相对保留时间来定位质谱峰以减少供试品中杂峰的干扰。该方法具有很强的专属性，解决了驯鹿角与其它常见鹿角的真伪检验这一技术难题。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种驯鹿角的真伪鉴别方法,将待检样品使用蛋白酶酶解后，使用超高效液相色谱仪和高分辨质谱仪进行检测，

超高效液相色谱条件：Thermo Hypersil GOLD色谱柱(100×2.1mm，3μm)，柱温40℃，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱：0-2min，流动相A95％，流动相B 5％；2-75min，流动相A 95％→55％，流动相B 5％→45％；75-80min，流动相A 55％→0％，流动相B 45％→100％；80-85.9min，流动相A 0％，流动相B100％；85.9-86min，流动相A 0％→95％，流动相B100％→5％；86-90min，流动相A 95％，流动相B 5％；进样量为5μL，流速0.3mL·min^-1；高分辨质谱选择m/z(双电荷，正离子)575.822±0.005作为检测离子。

所述的真伪鉴别方法,优选采用Thermo Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，ESI离子源，正离子模式，喷雾电压为2.1kV，离子传输毛细管温度为320℃，S-Lens传输效率设置为60％。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为120 000(m/z 400)，采集范围为350～1550Th；二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE设置为40％。

所述的真伪鉴别方法,优选若检测离子575.822±0.005检测后出现质谱峰,其保留时间为6.20×(2.16±0.1)min,则待检样品中含有驯鹿角；若检测离子575.822±0.005检测后未出现质谱峰，则待检样品中不含有驯鹿角；若检测离子575.822±0.005检测后出现质谱峰,其保留时间不在6.20×(2.16±0.1)min范围内,则待检样品中不含有驯鹿角。

所述的真伪鉴别方法,优选以高分辨质谱m/z(双电荷，正离子)451.731±0.005作为参照检测离子，对应的质谱峰为参照峰，检测离子575.822±0.005相对于参照检测离子451.731±0.005的相对保留时间为2.16±0.1。

所述的真伪鉴别方法,优选最小检出限为0.17mg·mL^-1。

所述的真伪鉴别方法,优选将待检样品加入变性缓冲液，然后加入DTT溶液，置于90℃保温处理4h，取出，放冷至室温，加入IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，上清液离心，截留物中加入碳酸氢铵溶液和胰蛋白酶，酶解，过滤，使用超高效液相色谱仪和高分辨质谱仪进行检测。

所述的真伪鉴别方法,优选变性缓冲液中含6mol·L^-1盐酸胍、1.3mol·L^-1Tris和2.4mmol·L^-1EDTA。

所述的真伪鉴别方法,优选精密称取待检样品粉末20mg，加1ml变性缓冲液，加50μL的0.5mol·L^-1DTT溶液，置于90℃保温处理4h，取出，放冷至室温，加入120μl的0.55mol·L^-1IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，取上清液200μL置于10k超滤管中，离心，截留物加200μL的1％碳酸氢铵溶液和5μL胰蛋白酶溶液，涡旋2min，置于37℃恒温培养箱中酶解30min，0.22μm滤膜过滤，即得。

所述的真伪鉴别方法,优选蛋白酶为胰蛋白酶,溶液浓度为10mg·mL^-1。

本发明的有益效果：

(1)基于特征多肽的离子化结构，直接提取基于多肽精准分子量的质荷比m/z，可以用于驯鹿角的真伪检验，省去了使用昂贵对照品的费用，建立的检验方法更加经济合理；

(2)575.822离子只在驯鹿角中检测到峰，其它非驯鹿角中均未检测到峰，说明该离子能够区分驯鹿角与非驯鹿角，该离子具有专属性；

(3)采用精准离子和相对保留时间两种方式相结合的方法来判断质谱峰的有无，进而来判断驯鹿角的真伪，提高了检测方法的准确度，优于采用单一方式的方法。

附图说明

图1为最小检出限图，

图2为驯鹿角(样1)的质谱图，

图3为马鹿角对照药材(中检院)的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1仪器与材料

1.1仪器

Thermo Ultimate 3000超高效液相色谱仪串联Thermo Scientific公司Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪；Thermo Hypersil GOLD色谱柱(100×2.1mm，3μm)

1.2材料

Sartorius-10K超滤管(批号：170700SVS)；胰蛋白酶(Sigma公司，批号：SLBG6452V)；驯鹿角(5批)、水鹿角(2批)、驼鹿角(2批)、狍鹿角(2批)、马鹿角(2批)、梅花鹿角(2批)，上述样品为本单位标本馆留存样品或市场收集样品，马鹿角对照药材(中国食品药品检定研究院，简称中检院；批号：121487-200501)；盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯；甲酸、乙腈为质谱纯。

2实验方法

2.1色谱及质谱条件

2.1.1超高效液相色谱条件

Thermo Hypersil GOLD色谱柱(100×2.1mm，3μm)，柱温40℃。流动相A为0.1％甲酸，流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱程序见表1，进样量为5μL，流速0.3mL·min^-1。

表1超高效液相色谱梯度洗脱程序

时间/min	A/(％)	B/(％)
			0	95	5
2	95	5
			75	55	45
80	0	100
			85.9	0	100
86	95	5
			90	95	5

2.1.2高分辨质谱条件

采用ThermoFusion-Orbitrap高分辨质谱仪，ESI离子源，正离子模式，喷雾电压为2.1kV，离子传输毛细管温度为320℃，S-Lens传输效率设置为60％。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为120 000(m/z 400)，采集范围为350～1 550Th；二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE设置为40％。选择m/z(双电荷，正离子)451.731和575.822作为检测离子。

2.2供试品溶液的制备精密称取上述各鹿角粉末20mg，分别加1ml变性缓冲液(含6mol·L^-1盐酸胍、1.3mol·L^-1Tris和2.4mmol·L^-1EDTA)，加50μL的0.5mol·L^-1DTT溶液，置于90℃保温处理4h，取出，放冷至室温。加入120μl的0.55mol·L^-1IAA溶液，摇匀，避光反应60min。离心，取上清液200μL置于10k超滤管中，离心，截留物加200μL的1％碳酸氢铵溶液和5μL胰蛋白酶溶液(10mg·mL^-1)，涡旋2min，置于37℃恒温培养箱中酶解30min，0.22μm滤膜过滤，即得。

2.3检测离子的选择

将上述供试品溶液按上述液相及质谱方法进行分析，将采集的不同鹿角的质谱数据运用PEAKS软件进行比对，从几万个检测离子中找出具有鉴别意义且响应较强的m/z，最终选择上述鹿科6种鹿角中均有的m/z(双电荷)451.731和驯鹿角特有的m/z(双电荷)575.822作为检测离子。

2.4参照物及参照峰的选择

因目前没有驯鹿角对照药材，为保证检验方法的可行性，应选取合适的参照物来代替相应的对照药材。故选择相对价廉易得的马鹿角对照药材作为参照物。精密称取马鹿角对照药材20mg，按上述供试品溶液的制备方法，制得参照物溶液。按上述液相-质谱方法进行检测，并选择鹿科鹿角中共有的m/z(双电荷)451.731对应的质谱离子峰作为参照峰，再根据参照峰的保留时间来计算驯鹿角特有的m/z(双电荷)575.822质谱离子峰的相对保留时间。

2.5检测离子精度的选择

质谱的分辨率越高，仪器性能越好，检测到的目标离子越有可能为单一化合物离子。因高分辨质谱的分辨率一般都在10万以上，故离子451.731的检测精度为±0.0045，离子575.822的检测精度为±0.0058。因离子检测精度范围太大，则失去了高分辨质谱的优势，检测离子精度范围太小，有时仪器性能微小变化会影响到检验结果的准确性和重现性，故确定离子的检测精度控制在±0.005范围内。

2.6精密度试验

取驯鹿角(样1)供试品溶液连续进样6针，以离子451.731对应的质谱峰为参照峰，计算离子575.822对应质谱峰的相对保留时间，具体结果见表2。

表2精密度试验结果

6针样品中离子575.822相对保留时间的RSD为0.31％，峰面积的RSD为3.90％，精密度良好。

2.7稳定性试验

取驯鹿角(样1)供试品溶液分别在0、2、4、8、12和24h进样，以离子451.731对应的质谱峰为参照峰，计算离子575.822对应质谱峰的相对保留时间，具体结果见表3。

表3稳定性试验结果

24h内离子575.822相对保留时间的RSD为0.58％，峰面积的RSD为6.73％，供试品溶液在24h内相对稳定。

2.8重现性试验

精密称取驯鹿角(样1)20.01、20.15、20.22、20.19、20.44和20.37mg，共6份，按上述供试品溶液的制备方法，分别制得供试品溶液，进样分析，以离子451.731对应的质谱峰为参照峰，计算离子575.822对应质谱峰的相对保留时间，具体结果见表4。

表4重现性试验结果

6份样品中离子575.822相对保留时间的RSD为0.37％，峰面积与称样量比值的RSD为4.07％，重现性良好。

2.9检出限

精密称取驯鹿角(样1)0.5、0.2、0.1mg，按上述供试品溶液的制备方法，分别制得供试品溶液，进样量为5μL，结果0.2mg的样品制得的供试品溶液可以作为最低检出限溶液(见图1)，检测离子575.822的保留时间为13.16min，相对保留时间为2.15，信噪比S/N为69，即在该方法条件下(定容体积约1.17ml)，驯鹿角的最小检出限为0.17mg·mL^-1。

2.10样品的检测

根据上述建立的液相-质谱方法，对15批样品及1批中检院提供的对照药材进行测试，结果16批样品均检出离子451.731，5批驯鹿角均检出离子575.822，11批其它鹿角均未检出离子575.822，5批驯鹿角样品的具体检测结果见表5：

表5 5批驯鹿角的检测结果

3结果与讨论

16批各种鹿角中均检出离子451.731，说明该离子对应的多肽物质稳定存在于各种鹿角中，故可以取常见的马鹿对照药材作为参照物，该离子峰可以作为参照峰。575.822离子只在驯鹿角中检测到，其它非驯鹿角中均未检测到，说明该离子能够区分驯鹿角与非驯鹿角，该离子具有专属性。

选定的检测离子m/z(双电荷，正离子)451.731和575.822来自对应多肽的一级质谱信号，该信号的有无即相应多肽的有无。因多肽对照品非常昂贵，若采用两种多肽为对照品，则建立的检测方法不够经济合理。基于特征多肽的离子化结构，直接提取基于多肽精准分子量的质荷比m/z，可以用于驯鹿角的真伪检验，省去了使用昂贵对照品的费用，使建立的检验方法更加经济合理。

虽然可以采用高分辨质谱的二级离子谱图对相应离子451.731和575.822进行结构验证，但因鹿角中含有的蛋白种类非常复杂且结构相近，为避免引起结果误判，故不采用二级质谱信号结果对质谱峰进行确认。采用精准离子和相对保留时间两种方式相结合的方法来判断质谱峰的有无，进而来判断驯鹿角的真伪，提高了检测方法的准确度，优于采用单一方式的方法。但因引入了相对保留时间，该方式对色谱柱的型号、柱温、流速、流动相组成等因素要求严格，故应确保在该试验规定的色谱条件下进行检测。

为确保方法的可行性和准确性，在该试验色谱和质谱条件下，5批样品的离子451.731平均保留时间为6.20min，离子575.822质谱峰的相对保留时间应控制在±5％范围内，5批样品的相对保留时间平均值为2.16，故确定范围为2.16±0.1，即离子575.822质谱峰的保留时间范围为6.20×(2.16±0.1)min。相应的m/z精度控制在±0.005范围内，即451.731±0.005和575.822±0.005范围内，只有在规定相对保留时间内检出离子575.822，视为样品为驯鹿角，否则视为该样品不是驯鹿角。如果参照物马鹿角对照药材中无法检测到离子451.731的质谱峰，应采取校正质谱仪器等措施，以确保参照物中能够检测到该参照峰。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种驯鹿角的真伪鉴别方法,其特征在于将待检样品使用蛋白酶酶解后，使用超高效液相色谱仪和高分辨质谱仪进行检测，

超高效液相色谱条件：Thermo Hypersil GOLD 色谱柱（100×2.1mm，3μm），柱温40℃，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱：0-2min，流动相A 95%，流动相B 5%；2-75min，流动相A 95%→55%，流动相B 5%→45%；75-80min，流动相A 55%→0%，流动相B 45%→100%；80-85.9min，流动相A 0%，流动相B 100%；85.9-86min，流动相A 0%→95%，流动相B 100%→5%；86-90min，流动相A 95%，流动相B 5%；进样量为5 μL，流速0.3mL·min^-1；高分辨质谱选择m/z（双电荷，正离子）575.822±0.005作为检测离子。

2.根据权利要求1所述的真伪鉴别方法,其特征在于采用Thermo Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，ESI离子源，正离子模式，喷雾电压为2.1 kV，离子传输毛细管温度为320℃，S-Lens传输效率设置为60%；

一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为120 000（m/z 400），采集范围为350～1550 Th；二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，采用HCD碎裂模式，碎裂能量NCE设置为40%。

3.根据权利要求1所述的真伪鉴别方法,其特征在于若检测离子575.822±0.005检测后出现质谱峰,其保留时间为6.20×（2.16±0.1）min,则待检样品中含有驯鹿角；若检测离子575.822±0.005检测后未出现质谱峰，则待检样品中不含有驯鹿角；若检测离子575.822±0.005检测后出现质谱峰,其保留时间不在6.20×（2.16±0.1）min范围内,则待检样品中不含有驯鹿角。

4.根据权利要求3所述的真伪鉴别方法,其特征在于以高分辨质谱m/z（双电荷，正离子）451.731±0.005作为参照检测离子，对应的质谱峰为参照峰，检测离子575.822±0.005相对于参照检测离子451.731±0.005的相对保留时间为2.16±0.1。

5.根据权利要求3所述的真伪鉴别方法,其特征在于最小检出限为0.17mg·mL^-1。

6.根据权利要求1所述的真伪鉴别方法,其特征在于所述蛋白酶为胰蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的真伪鉴别方法,其特征在于将待检样品加入变性缓冲液，然后加入DTT溶液，置于90℃保温处理4 h，取出，放冷至室温，加入IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，上清液离心，截留物中加入碳酸氢铵溶液和胰蛋白酶，酶解，过滤，使用超高效液相色谱仪和高分辨质谱仪进行检测。

8.根据权利要求7所述的真伪鉴别方法,其特征在于变性缓冲液中含6mol·L^-1盐酸胍、1.3 mol·L^-1Tris和2.4 mmol·L^-1EDTA。

9.根据权利要求7或8所述的真伪鉴别方法,其特征在于精密称取待检样品粉末20 mg，加1 ml变性缓冲液，加50 μL的 0.5 mol·L^-1 DTT溶液，置于90℃保温处理4 h，取出，放冷至室温，加入120 μl的0.55 mol·L^-1 IAA溶液，摇匀，避光反应60min，离心，取上清液200μL置于10k超滤管中，离心，截留物加200μL的1%碳酸氢铵溶液和5μL胰蛋白酶溶液，涡旋2min，置于37℃恒温培养箱中酶解30 min，0.22μm滤膜过滤，即得。

10.根据权利要求9所述的真伪鉴别方法,其特征在于胰蛋白酶溶液浓度为10mg·mL^-1。