CN106841473B - 一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：将蔬菜鲜样粉碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90℃水浴下浸提20min，离心过滤后，以6‑氨基喹啉‑N‑羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用XBridge C18色谱柱梯度洗脱，用高效液相色谱‑荧光检测器分离检测。该方法样品制备快速简单、成本低、测定快，精密度、准确度、稳定性以及线性关系良好，整个分析过程快速、灵敏且重现性好，适用于蔬菜鲜样中游离氨基酸的快速分析，易于推广应用，为蔬菜品质鉴定及其开发利用提供了理想的分析方法。

Description

一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种蔬菜中游离氨基酸含量的快速分析方法，该快速分析方法能够同时分离、分析蔬菜鲜样中17种游离氨基酸。
背景技术
蔬菜在人们的日常膳食结构中占有重要地位，它们可为人体提供丰富的维生素、胡萝卜素、矿质元素及膳食纤维等营养成分，深受消费者的喜爱。氨基酸是蔬菜中的重要营养成分，各种氨基酸含量及组成直接影响其营养价值，并与人类味觉密切相关。而且对于蔬菜而言，不同种类的氨基酸是其生长发育中必不可少的成分，在蔬菜的氮同化、蛋白质的合成、抵御病虫害等方面具有重要的作用。因此，分析研究蔬菜中游离氨基酸种类和含量对蔬菜品质鉴定具有十分重要的意义，可为今后蔬菜的进一步研究及其开发利用提供依据。
目前，对蔬菜中游离氨基酸分析方法的研究中大多先将蔬菜样品烘干、除去水分至恒重后、加酸进行消解再用于氨基酸含量的测定。由于干样通常经烘干、粉碎而成，高温过程中蛋白质变性，其蛋白酶的生物活性丧失，易造成蛋白质降解导致游离氨基酸含量增加，同时烘干等步骤可能会引起蔬菜各种生化成分的转化，使得测定的数据并不能反应样品中氨基酸的真实水平，从而产生检测误差。而且蔬菜样品加酸进行水解，可能造成某些氨基酸如色氨酸被破坏而无法检测。
蔬菜干样中氨基酸的分析方法有很多，主要有茚三酮比色法、气相色谱及其质谱联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。经典的氨基酸分析方法一般采用氨基酸分析仪，使用茚三酮作为衍生试剂柱后衍生测定。但氨基酸分析仪价格昂贵，分析时间长，专属性强，只能用于分析氨基酸，限制了其广泛应用。相对于其他几种方法，柱前衍生-高效液相色谱法无需特殊反应装置，具有仪器普及率高、分析时间短、方法灵活多样、灵敏度高、易于推广的优点，近年来逐渐成为氨基酸检测的常规手段。
发明内容
本发明提供一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其目的在于解决现有的蔬菜中氨基酸分析方法中存在的速度慢、效率低、精确度不够以及基础应用推广难的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；
步骤（2），分别配制0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：
天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；
酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0mL/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；
第二部分，测定蔬菜鲜样中所述第一部分中的17种游离氨基酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取蔬菜鲜样搅碎并混合均匀，向蔬菜鲜样中加入超纯水，所述蔬菜鲜样与所述超纯水的投入比为向每1g茶叶鲜样中投入20mL超纯水，在98~102℃条件下浸提28~32min，冷却至室温后，4500~5500r/min离心2~4min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后得到蔬菜样品溶液；
步骤（2），对所述蔬菜样品溶液进行衍生化反应；
移取10μL蔬菜样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述蔬菜样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算蔬菜样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定蔬菜样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，在所述第一部分的步骤（2）中，0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；
0.8mg/mL的AQC衍生液的配制方法为：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。AQC 即指6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯，Waters公司生产，乙腈为色谱纯。
氨基酸标准溶液的配制：精密称取各氨基酸标准品适量，置于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得氨基酸单一标准溶液，于-20℃冰箱保存。
取17种氨基酸混合标液40 µL，用超纯水定容到1mL，其中胱氨酸为50μmol/L，其余各氨基酸浓度均为100μmol/L，得到氨基酸混合标准母液。再用所述氨基酸混合标准母液配制成上述6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液。
2、上述方案中，蔬菜鲜样主要指叶类蔬菜鲜样。
本发明设计特点：本发明针对现有的蔬菜中氨基酸分析方法中存在的速度慢、效率低、精确度不够以及基础应用推广难的问题，通过技术创新，建立了一种快速、实用、高效、准确的蔬菜鲜样中17种游离氨基酸的分离分析方法。将蔬菜鲜样粉碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90℃水浴下浸提20min，离心过滤后，以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用XBridge C18色谱柱梯度洗脱，用高效液相色谱-荧光检测器分离检测。传统方法均以蔬菜干样作为样品来检测氨基酸含量，这是由于蔬菜鲜样比蔬菜干样含有更多的水分、色素、水溶性灰分等干扰物质，容易造成后续分离困难，也就是说，现有的测定蔬菜干样中游离氨基酸的检测方法，不适用于蔬菜鲜样的测定。本发明以蔬菜鲜样代替蔬菜干样作为样品，为了解决分离困难的难题，创造性、针对性地选用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂，联合利用XBridge C18色谱柱以及高效液相色谱-荧光检测器分离分析，发现能够快速、高效、准确地分离分析蔬菜鲜样中17种游离氨基酸。尤其是选用规格为4μm的高效XBridge C18色谱柱与AQC柱前衍生法联用，在保证分析速度更快的同时，能够很好地分离蔬菜鲜样中的各种游离氨基酸组分，从而保证了对蔬菜鲜样中17 种游离氨基酸的定性定量分析。
与现有蔬菜氨基酸分析技术相比，本发明有益效果：
①首次建立了针对蔬菜鲜样中17种游离氨基酸的快速定量分析方法，优点在于以蔬菜鲜样作为样品，代替了传统方法中以蔬菜干样作为样品来检测氨基酸含量，避免了高温、烘干等步骤可能引起的茶叶各种生化成分间的转化、导致游离氨基酸含量变化而产生的检测误差，测定数据更加精准可靠，可真实地反应蔬菜中氨基酸的含量水平；
②选用XBridge C18色谱柱，代替氨基酸专用分析柱，对氨基酸进行分离分析，通过技术优化，成功实现了氨基酸组分的分离，达到了定量检测蔬菜鲜样中17种游离氨基酸的目的，而且整个分析周期只有23分钟，大大提高了对氨基酸的分析效率，适用于大批样品的测定。同时，XBridge C18色谱柱价格相对便宜，专属性不强，可以用于其他物质的检测，在节省分析成本的前提下，弥补了目前基于高效液相色谱不能准确对蔬菜中17种游离氨基酸进行快速分析的空缺，特别适合在广大基层检测机构和单位推广使用。
总之，本发明的样品制备快速简单、成本低，精密度、准确度、稳定性以及线性关系良好，整个分析过程快速、灵敏且重现性好，适用于蔬菜鲜样中游离氨基酸的快速分析，易于推广应用，为蔬菜品质鉴定及其开发利用提供了理想的分析方法。
附图说明
附图1为本发明氨基酸混合标准工作溶液中17种氨基酸的HPLC图谱，按照出峰顺序依次标号，数字标号分别表示：1.天冬氨酸；2.丝氨酸；3.谷氨酸；4.组氨酸；5.甘氨酸；6.精氨酸；7.苏氨酸；8.丙氨酸；9.脯氨酸；10.胱氨酸；11.酪氨酸；12.缬氨酸；13.蛋氨酸；14.赖氨酸；15.异亮氨酸；16.亮氨酸；17.苯丙氨酸。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例：一种白菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法
所述快速分析方法包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；
准备仪器与设备：2695高效液相色谱仪，配2475 荧光检测器（Waters公司）；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器公司）；K600粉碎机（德国博朗公司）；LE-3000电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械公司）；Direct-Q 5 UV超纯水机（美国Millipore公司）。
步骤（2），0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；
0.8mg/mL的AQC衍生液的配制：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。
氨基酸标准溶液的配制：精密称取各氨基酸标准品适量，置于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得氨基酸单一标准溶液，于-20℃冰箱保存。
取17种氨基酸混合标液40 µL，用超纯水定容到1mL，其中胱氨酸为50μmol/L，其余各氨基酸浓度均为100μmol/L，得到氨基酸混合标准母液。再用所述氨基酸混合标准母液配制成6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液。6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：
天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；
酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在55℃下加热10min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm，Waters公司）；柱温37℃；流速2.0mL/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；
第二部分，测定白菜鲜样中所述第一部分中的17种游离氨基酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取白菜鲜样粉碎并混合均匀，称取0.5g，加入10mL超纯水，在100℃的水浴锅中浸提30min，冷却至室温后，5000r/min离心3min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后白菜样品溶液；
步骤（2），对所述白菜样品溶液进行衍生化反应；
移取10μL白菜样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合10～20s，静置1min后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述白菜样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算白菜样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定白菜样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。
本实施例的试验结果：
1、氨基酸混合标准工作溶液的色谱分离
从附图1中可以看出，氨基酸各组分之间的分离度良好，出峰紧凑且峰形对称，分析周期为23分钟，在保证了分离效果的同时，实现了快速分析的目的和效果。
17种氨基酸的出峰顺序依次为：天冬氨酸-丝氨酸-谷氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-胱氨酸-酪氨酸-缬氨酸-蛋氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸。
2、方法的回归方程、相关系数及检出限
配制浓度分别为5、10、50、100、200、250μmol/L的氨基酸混标溶液，衍生化后进样测定，以氨基酸溶液浓度（X）为横坐标、对应峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，并进行线性回归分析，计算相关系数。结果表明，在5～250μmol/L范围内，氨基酸的浓度与其峰面积的线性关系良好，相关系数为0.9956～0.9999。以3倍信噪比计算方法的检出限，结果见表1。
表1 17种氨基酸的线性方程、相关系数和检出限
Figure 584835DEST_PATH_IMAGE001
3、方法回收率
精密称取0.5g已知氨基酸含量的白菜样品5份，向其中加入一定体积的氨基酸混和标液，进行样品制备、衍生反应后测定，采用外标法定量，计算各氨基酸的回收率和相对标准偏差（RSD）（表2）。17种氨基酸的回收率在87.1%～102.7%之间，RSD在5.5%～10.2%之间，说明本方法准确度高，重现性好，方法可靠。
表2 白菜鲜样加标回收结果
Figure 353202DEST_PATH_IMAGE002
4、方法精密度
取适量含17种氨基酸的混合标液，按上述方法衍生后进样分析，连续进样5次，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察其精密度。各氨基酸保留时间RSD在0.5%～1.1%，峰面积RSD在2.0%～3.2%，说明本方法精密度较高。
5、方法重复性
取同一白菜样品5份，按上述方法提取、衍生、测定，以色谱峰峰面积超过1%的氨基酸的保留时间和峰面积为指标分别计算RSD，考察方法的重复性。白菜样品中所含氨基酸峰保留时间RSD在0.4%～1.3%之间，峰面积RSD在2.6%～3.7%之间，重复性较好。
6、方法稳定性
取同一白菜样品供试溶液，按照上述方法衍生，分别在0、4、8、12、24h进样，以色谱峰峰面积超过1.0%的氨基酸的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察白菜样品中氨基酸衍生化溶液的稳定性。
各氨基酸衍生化产物保留时间RSD在0.6%～2.2%（n=5），峰面积RSD在2.0%～4.1%(n=5)。表明氨基酸衍生化溶液在室温下可以稳定24 h。
7、方法应用
应用建立的方法，对取自江苏太湖地区农业科学研究所试验田的白菜样品进行测定，结果如表3所示。
表3 白菜鲜样中游离氨基酸测定结果
氨基酸 含量(mg/g)
天冬氨酸 3.60
丝氨酸 0.54
谷氨酸 4.74
组氨酸 0.31
甘氨酸 1.01
精氨酸 0.65
苏氨酸 0.49
丙氨酸 1.34
脯氨酸 0.91
胱氨酸 0.20
酪氨酸 0.52
缬氨酸 0.72
蛋氨酸 0.11
赖氨酸 0.75
异亮氨酸 0.55
亮氨酸 0.89
苯丙氨酸 0.63
上述实施例以白菜鲜样作为检测对象，其他叶类蔬菜也能用本发明的快速分析方法检测鲜样中游离氨基酸含量，例如芥菜、菠菜、芹菜、苋菜、结球甘蓝、莴苣、韭菜以及茴香等。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；
步骤（2），分别配制0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：
天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；
酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；
0.8mg/mL的AQC衍生液的配制方法为：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解；
步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：XBridge C18色谱柱，规格为3.9mm×15cm，4μm；柱温37℃；流速2.0mL/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%； 9.0min，96.5%A+3.5%B； 9.5min，95.0%A+5.0%B； 11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，保持100%A；进样量10μL；
第二部分，测定蔬菜鲜样中所述第一部分中的17种游离氨基酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取蔬菜鲜样搅碎并混合均匀，向蔬菜鲜样中加入超纯水，所述蔬菜鲜样与所述超纯水的投入比为向每1g鲜样中投入20mL超纯水，在98~102℃条件下浸提28~32min，冷却至室温后，4500~5500r/min离心2~4min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后得到蔬菜样品溶液；所述蔬菜鲜样为白菜鲜样；
步骤（2），对所述蔬菜样品溶液进行衍生化反应；
移取10μL蔬菜样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述蔬菜样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算蔬菜样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定蔬菜样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。
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