CN107091898A - 一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：将茶叶鲜样搅碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90℃条件下浸提20min，离心过滤后，以6‑氨基喹啉‑N‑羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用XBridge C18色谱柱梯度洗脱，用高效液相色谱‑荧光检测器分离检测。该方法样品制备快速简单、成本低，精密度、准确度、稳定性以及线性关系良好，整个分析过程快速、灵敏且重现性好，适用于茶叶鲜样中游离氨基酸的快速分析。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，该快速分析方法能够同时分离、分析茶叶鲜样中18种游离氨基酸。
背景技术
茶是世界三大天然饮料之一，具有独特的香气、丰富的营养和保健功效，深受消费者喜爱。茶叶中含有丰富的氨基酸，它们是构成茶叶滋味的重要成分，直接影响茶叶的品质。茶叶中的氨基酸主要有两种存在形式，一种以游离态形式存在；另一种以结合态存在于肽和蛋白质中。其中，游离氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸等，是茶叶中一类重要的含氮物质，它们不仅是合成茶叶蛋白的基本单位，还是合成许多与代谢有关的生理活性物质的基质，其组成、含量及在加工过程中的降解产物和转化产物以及这些组分间的含量变化均直接影响到茶叶香气和滋味，对茶叶的品质具有重要作用。因此，茶叶中游离氨基酸的分析研究对茶叶的开发利用、工艺控制、品质鉴定和营养价值评价都具有十分重要的意义。
现今对茶叶中游离氨基酸分析方法的研究中以干样较多和较为成熟，如国标GB/T8303-2013中规定，茶样需磨碎后在电热恒温干燥箱中加热、除去水分至恒重后再用于氨基酸含量的测定。由于干样通常经高温杀青、烘干和粉碎而成，高温过程中蛋白质变性，其蛋白酶的生物活性丧失，易造成蛋白质降解导致游离氨基酸含量增加，同时烘干等步骤可能会引起茶叶各种生化成分的转化，使得测定的数据并不能反应茶叶中氨基酸的真实水平，从而产生检测误差。
目前，茶叶中氨基酸的分析方法有很多，主要有茚三酮比色法、气相色谱及其质谱联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。经典的氨基酸分析方法一般采用氨基酸分析仪，使用茚三酮作为衍生试剂柱后衍生测定。但氨基酸分析仪价格昂贵，分析时间长，专属性强，只能用于分析氨基酸，限制了其广泛应用。相对于其他几种方法，柱前衍生-高效液相色谱法无需特殊反应装置，具有仪器普及率高、分析时间短、方法灵活多样、灵敏度高、易于推广的优点，逐渐成为氨基酸检测的常规手段。中国发明专利“利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法”（CN104678044A）以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂，使用氨基酸专用分析柱进行梯度洗脱，结合反相高效液相色谱，实现了对茶叶中谷氨酰胺等19种氨基酸的定量分析。但该发明采用氨基酸分离专用色谱柱，需要进行复杂的梯度分离，使用成本高，运行周期长（1h左右），在大量样品分析过程中，十分的费时，不利于氨基酸的快速分析和推广普及。更重要的是，该发明没有对方法的准确性、灵敏性、精密性等进行必要的方法学检验，技术效果无法得到有效保障。
发明内容
本发明提供一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其目的在于解决现有的茶叶氨基酸分析方法中存在的速度慢、效率低、成本高、基础应用推广难等问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；
步骤（2），分别配制0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：
天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
茶氨酸25μmol/L、50μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1250μmol/L；
胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；
酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0mL/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；
第二部分，测定茶叶鲜样中所述第一部分中的18种游离氨基酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，向茶叶鲜样中加入沸水，所述茶叶鲜样与所述沸水的投入比为向每1g茶叶鲜样中投入40mL沸水，在88~92℃条件下浸提18~22min，冷却至室温后，2500~3500r/min离心4~6min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后得到茶鲜叶样品溶液；
步骤（2），对所述茶鲜叶样品溶液进行衍生化反应；
移取10μL茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，在所述第一部分的步骤（2）中，0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；
0.8mg/mL的AQC衍生液的配制方法为：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。AQC 即指6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯，Waters公司生产，乙腈为色谱纯。
氨基酸标准溶液的配制：精密称取各氨基酸标准品适量，置于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得氨基酸单一标准溶液，其中茶氨酸浓度为12.5 μmol/L，于-20℃冰箱保存。
取17种氨基酸混合标液（除胱氨酸浓度为1.25mmol/L外，其余浓度均为2.5 mmol/L）40 µL，再加入40 µL浓度为12.5 μmol/L 的茶氨酸标准溶液，用超纯水定容到1mL，得到含茶氨酸的氨基酸混合标准母液，其中，茶氨酸浓度为500μmol/L、胱氨酸为50μmol/L，其余各氨基酸浓度均为100μmol/L。再用所述氨基酸混合标准母液配制成上述6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液。
本发明设计特点：本发明针对现有茶叶氨基酸分析技术中存在的速度慢、效率低、成本高、推广难等问题，通过技术创新，建立了一种快速、实用、高效、准确、经济的茶叶鲜样中18种游离氨基酸的分离分析的方法。将茶叶鲜样搅碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90℃条件下浸提20min，离心过滤后，以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用XBridge C18色谱柱梯度洗脱，用高效液相色谱-荧光检测器分离检测。传统方法均以茶叶干样作为样品来检测氨基酸含量，这是由于茶叶鲜样比茶叶干样含有更多的水分、色素、水溶性灰分、茶多酚等干扰物质，容易造成后续分离困难，也就是说，现有的测定茶叶干样中游离氨基酸的检测方法，不适用于茶叶鲜样的测定。本发明以茶叶鲜样代替茶叶干样作为样品，为了解决分离困难的难题，创造性、针对性地选用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂，联合利用XBridge C18色谱柱以及高效液相色谱-荧光检测器分离分析，发现能够快速、高效、准确地分离分析茶叶鲜样中18 种游离氨基酸。尤其是选用规格为4μm的高效XBridge C18色谱柱与AQC柱前衍生法联用，在保证分析速度更快的同时，能够很好地分离茶叶鲜样中的各种游离氨基酸组分，从而保证了对茶叶鲜样中18 种游离氨基酸的定性定量分析。
与现有茶叶氨基酸分析技术相比，本发明有益效果：
①首次建立了针对茶叶鲜样中18种游离氨基酸的快速定量分析方法，优点在于以茶叶鲜样作为样品，代替了传统方法中以茶叶干样作为样品来检测氨基酸含量，避免了高温、烘干等步骤可能引起的茶叶各种生化成分间的转化、导致游离氨基酸含量变化而产生的检测误差，测定数据更加精准可靠，可真实地反应茶叶中氨基酸的含量水平；
②选用XBridge C18色谱柱，代替氨基酸专用分析柱，对氨基酸进行分离分析，通过技术优化，成功实现了氨基酸组分的分离，达到了定量检测茶叶中茶氨酸等18游离氨基酸的目的，而且整个分析周期只有23分钟，大大提高了对氨基酸的分析效率，可满足大批量样品分析对进度的要求。同时，XBridge C18色谱柱价格相对便宜，专属性不强，可以用于其他物质的检测，在节省分析成本的前提下，弥补了目前基于高效液相色谱不能准确对茶叶中茶氨酸等18种游离氨基酸进行快速分析的空缺，特别适合在广大基层检测机构和单位推广使用。
总之，本发明的样品制备快速简单、成本低，精密度、准确度、稳定性以及线性关系良好，整个分析过程快速、灵敏且重现性好，适用于茶叶鲜样中游离氨基酸的快速分析，为开展茶叶质量评价、等级评定、指纹图谱构建提供了理想的方法，易于推广应用。
附图说明
附图1为本发明氨基酸混合标准工作溶液中18种氨基酸的HPLC图谱，按照出峰顺序依次标号，数字标号分别表示：1.天冬氨酸；2.丝氨酸；3.谷氨酸；4.组氨酸；5.甘氨酸；6.精氨酸；7.苏氨酸；8.丙氨酸；9.脯氨酸；10.茶氨酸；11.胱氨酸；12.酪氨酸；13.缬氨酸；14.蛋氨酸；15.赖氨酸；16.异亮氨酸；17.亮氨酸；18.苯丙氨酸。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例：一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法
所述快速分析方法包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；
准备仪器与设备：2695高效液相色谱仪，配2475 荧光检测器（Waters公司）；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器公司）；K600粉碎机（德国博朗公司）；LE-3000电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械公司）；Direct-Q 5 UV超纯水机（美国Millipore公司）。
步骤（2），0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；
0.8mg/mL的AQC衍生液的配制：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。
氨基酸标准溶液的配制：精密称取各氨基酸标准品适量，置于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得氨基酸单一标准溶液，其中茶氨酸浓度为12.5 μmol/L，于-20℃冰箱保存。
取17种氨基酸混合标液（除胱氨酸浓度为1.25mmol/L外，其余浓度均为2.5 mmol/L）40 µL，再加入40 µL浓度为12.5 μmol/L 的茶氨酸标准溶液，用超纯水定容到1mL，得到含茶氨酸的氨基酸混合标准母液，其中，茶氨酸浓度为500μmol/L、胱氨酸为50μmol/L，其余各氨基酸浓度均为100μmol/L。再用所述氨基酸混合标准母液配制成6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液。6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：
天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
茶氨酸25μmol/L、50μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1250μmol/L；
胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；
酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合10～20s，静置1min后在55℃下加热10min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm，Waters公司）；柱温37℃；流速2.0mL/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水（18.4 MΩ）稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；
第二部分，测定茶叶鲜样中所述第一部分中的18种游离氨基酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，称取0.25g，加入10mL沸水，在90℃的水浴锅中浸提20min，冷却至室温后，3000r/min离心5min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后备用得到茶鲜叶样品溶液；
步骤（2），对所述茶鲜叶样品溶液进行衍生化反应；
移取10μL茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合10～20s，静置1min后在55℃下加热10min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。
本实施例的试验结果：
1、氨基酸混合标准工作溶液的色谱分离
从附图1中可以看出，氨基酸各组分之间的分离度良好，出峰紧凑且峰形对称，分析周期为23分钟，在保证了分离效果的同时，实现了快速分析的目的和效果。18种氨基酸的出峰顺序依次为：天冬氨酸-丝氨酸-谷氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-茶氨酸-胱氨酸-酪氨酸-缬氨酸-蛋氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸。
2、方法的回归方程、相关系数及检出限
将所述氨基酸混合标准工作溶液衍生化后进样测定，以氨基酸溶液浓度（X）为横坐标、对应峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，并进行线性回归分析，计算相关系数。结果表明，在5～250μmol/L范围内，氨基酸的浓度与其峰面积的线性关系良好，相关系数为0.9978～0.9999。以3倍信噪比计算方法的检出限，结果见表1。
表1 18种氨基酸的线性方程、相关系数和检出限
3、方法回收率
精密称取0.25g已知氨基酸含量的茶鲜叶样品5份，向其中加入一定体积的氨基酸混和标液，进行样品制备、衍生反应后测定，采用外标法定量，计算各氨基酸的回收率和RSD（相对标准偏差）（表2）。
18种氨基酸的回收率在86.25%～109.05%之间，RSD在6.03%～10.56%之间，说明本方法准确度高，重现性好，方法可靠。
表2 茶叶鲜样加标回收结果
4、方法精密度
取适量含18种氨基酸的混合标液，按上述方法衍生后进样分析，连续进样5次，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察其精密度。各氨基酸保留时间RSD在0.09%～0.55%，峰面积RSD在1.12%～2.15%，说明本方法精密度较高。
5、方法重复性
取同一茶鲜叶样品5份，按上述方法提取、衍生、测定，以色谱峰峰面积超过1%的氨基酸的保留时间和峰面积为指标分别计算RSD，考察方法的重复性。茶鲜叶所含氨基酸峰保留时间RSD在0.55%～1.98%之间，峰面积RSD在2.08%～3.71%之间，重复性较好。
6、方法稳定性
取同一茶鲜叶样品供试溶液，按照上述方法衍生，分别在0、4、8、12、24h进样，以色谱峰峰面积超过1.0%的氨基酸的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察茶鲜叶中氨基酸衍生化溶液的稳定性。各氨基酸衍生化产物保留时间RSD在0.23%～2.01%（n=5），峰面积RSD在1.18%～3.91% (n=5)。表明氨基酸衍生化溶液在室温下可以稳定24 h。
7、方法应用
应用建立的方法，分别对取自苏州洞庭东山和洞庭西山的2个碧螺春茶叶鲜样中的游离氨基酸进行测定，结果如表3所示，ND表示该种氨基酸含量低于检出限。
表3 茶叶鲜样中游离氨基酸测定结果
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；
步骤（2），分别配制0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：
天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
茶氨酸25μmol/L、50μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1250μmol/L；
胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；
酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；
步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0mL/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；
第二部分，测定茶叶鲜样中所述第一部分中的18种游离氨基酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，向茶叶鲜样中加入沸水，所述茶叶鲜样与所述沸水的投入比为向每1g茶叶鲜样中投入40mL沸水，在88~92℃条件下浸提18~22min，冷却至室温后，2500~3500r/min离心4~6min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后得到茶鲜叶样品溶液；
步骤（2），对所述茶鲜叶样品溶液进行衍生化反应；
移取10μL茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。
2.根据权利要求1所述的一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：在所述第一部分的步骤（2）中，0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；
0.8mg/mL的AQC衍生液的配制方法为：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。
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|---|---|
| CN (1) | CN107091898A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108195656A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-06-22 | 河北省农林科学院粮油作物研究所 | 单子叶植物不同存在形式氨基酸的分离提取方法 |
| CN108982688A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-11 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法 |
| CN110018260A (zh) * | 2019-02-25 | 2019-07-16 | 山东越品检验认证集团有限公司 | 一种茶叶中游离氨基酸的测定方法 |
| CN110646267A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-03 | 福建农林大学 | 一种武夷肉桂茶等级及烘焙程度判别方法 |
| CN112557532A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-03-26 | 北京康立生医药技术开发有限公司 | 一种含茶氨酸组合物的检测方法 |
| CN113030338A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-25 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 一种测定烟丝中氨基酸的方法 |
| CN114965745A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-08-30 | 武汉轻工大学 | 一种茶叶中氨基酸的检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102323341A (zh) * | 2011-06-09 | 2012-01-18 | 山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法 |
| CN103558311A (zh) * | 2013-11-13 | 2014-02-05 | 安徽农业大学 | 一种基于茶叶生化成分的绿茶苦涩味判别方法 |
| CN103645266A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-03-19 | 光明乳业股份有限公司 | 乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法 |
| CN104678044B (zh) * | 2015-03-12 | 2016-03-30 | 安徽农业大学 | 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 |
-
2017
- 2017-04-11 CN CN201710231647.9A patent/CN107091898A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102323341A (zh) * | 2011-06-09 | 2012-01-18 | 山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法 |
| CN103558311A (zh) * | 2013-11-13 | 2014-02-05 | 安徽农业大学 | 一种基于茶叶生化成分的绿茶苦涩味判别方法 |
| CN103645266A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-03-19 | 光明乳业股份有限公司 | 乳基料中游离态手性氨基酸的检测方法 |
| CN104678044B (zh) * | 2015-03-12 | 2016-03-30 | 安徽农业大学 | 利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 曹静亚等: "柱前衍生反相高效液相色谱法测定绞股蓝茶叶中17种游离氨基酸含量", 《氨基酸和生物资源》 * |
| 苗虹等: "柱前衍生高效液相色谱法测定食物中氨基酸含量", 《分析化学》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108195656A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-06-22 | 河北省农林科学院粮油作物研究所 | 单子叶植物不同存在形式氨基酸的分离提取方法 |
| CN108982688A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-11 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法 |
| CN110018260A (zh) * | 2019-02-25 | 2019-07-16 | 山东越品检验认证集团有限公司 | 一种茶叶中游离氨基酸的测定方法 |
| CN110646267A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-03 | 福建农林大学 | 一种武夷肉桂茶等级及烘焙程度判别方法 |
| CN112557532A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-03-26 | 北京康立生医药技术开发有限公司 | 一种含茶氨酸组合物的检测方法 |
| CN113030338A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-25 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 一种测定烟丝中氨基酸的方法 |
| CN114965745A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-08-30 | 武汉轻工大学 | 一种茶叶中氨基酸的检测方法 |
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