CN108982688A

CN108982688A - 一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法

Info

Publication number: CN108982688A
Application number: CN201810696226.8A
Authority: CN
Inventors: 朱荫; 林�智; 康受姈; 吕海鹏; 戴伟东; 谭俊峰; 张悦; 郭丽; 施江; 彭群华
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108982688B

Abstract

本发明属于茶叶分析检测技术领域，具体涉及一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法。其包括以下步骤：a)氨基酸混合消旋体标准品溶液的配制；b)氨基酸混合消旋体标准品的衍生化反应；c)氨基酸对映异构体定性参数的确定及定量标准工作曲线的绘制；d)茶叶中游离氨基酸对映异构体的定性定量分析。本发明方法在极广的浓度范围内（12.5‑2500 nmol）呈现较好的线性关系，相关系数高达0.9987，检测限低至2.5 nmol，相对标准偏差值介于3.26‑11.48%，可实现对茶叶中15对常见游离氨基酸对映异构体的同时精确定性定量检测。

Description

一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法

技术领域

本发明属于茶叶检测分析技术领域，具体涉及一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法。

背景技术

氨基酸是茶叶中的主要化学成分之一，与茶叶的滋味及香气形成均有密切的关系。目前在茶叶中发现并鉴定的氨基酸约有26种，其中茶氨酸是茶汤鲜味的主要呈味因子；谷氨酸和天冬氨酸是茶叶中重要且含量高的一类氨基酸，是构成茶叶鲜爽滋味的重要成分；苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸等则呈现甜味的口感，对茶汤滋味有益。

天然氨基酸除甘氨酸外都具有手性中心，存在L和D两种构型，它们的生理活性及呈味特性往往截然不同。L型氨基酸被称作天然氨基酸，普遍存在于生命体中，早期的研究甚至认为自然界存在的氨基酸均为L型。而D型氨基酸则在20世纪70年代被科学家在人体中发现，到80年代后期才被广泛研究，虽然不是构成蛋白质的基本结构单元，但在许多植物、微生物和高等动植物中均发现了它们的存在。研究发现，部分的D构型氨基酸有着十分理想而特别的滋味，而其相应的L构型氨基酸却有着令人不悦的滋味。其中D-色氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-酪氨酸及D-亮氨酸分别呈现出高于蔗糖35、7、7、6及4倍的甜味。由此可知，如果茶叶中存在D构型氨基酸，那它们对茶汤滋味的影响应该与相应的L构型有较大差异，因此开发一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法不仅在理论基础上有着重要的意义，而且在茶汤滋味的调控上也有着潜在的应用价值。

多年来，研究者们对茶叶中游离氨基酸的组成及其与茶叶品质的关系进行了详细而深入的研究，已经取得了不错的进展。然而，由于分析手段上的限制，尽管氨基酸的检测方法已经十分成熟，但往往仅停留在平面结构层面，茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法除茶氨酸对映异构体外尚未有报道。研究表明绿茶、乌龙茶及部分红茶中均存在较高含量的D-茶氨酸，D-茶氨酸的比例与大吉岭红茶的等级存在一定的相关性，且白茶萎调、储藏过程以及碱化处理可促进D-茶氨酸的生成。以上的研究有力地证明了D-氨基酸对茶叶风味品质具有较为显著的影响，然而目前尚无针对茶叶中其它重要游离氨基酸对映异构体的检测方法，因此也无法查明其他游离氨基酸对映异构体对茶叶滋味形成的具体影响，严重制约了人们对茶叶滋味成分的科学认知。

另一方面，在检测手段上，茶叶中茶氨酸对映异构体多数采用高效液相色谱法进行分离，然而，高效液相色谱法需要耗费大量的洗脱剂，将对环境造成较大负担，且由于氨基酸在反相流动相体系中的洗脱速度十分快，小分子量的氨基酸往往在5分钟内已洗脱完毕，这不仅导致氨基酸对映异构体分离效果不佳，更会导致不同化学结构氨基酸色谱峰严重重叠的现象。因此，采用该方法分离茶汤复杂化学体系中的多种游离氨基酸具有较大的难度，针对茶氨酸对映异构体的检测方法并不适用于其他游离氨基酸对映异构体的检测分析。气相色谱-质谱分析具有柱效高、分析速度快、易于定量且具有可供参考的标准谱图库等优点，在氨基酸常规检测中也有一定应用，针对氨基酸对映异构体，可采用衍生化法将样品中的氨基酸衍生成易汽化的衍生物后，进入气相色谱系统与手性固定相作用从而将对映异构体分离。由于氨基酸的分子量及沸点各异，而化合物在GC-MS的出峰时间与沸点呈正比关系，因此各氨基酸在GC-MS上的分离度较好，较少出现峰重叠现象。目前，该方法尚未被应用于茶叶中多种游离氨基酸的对映异构体检测中。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，前处理简单，容易操作，定量精确，重复性好，能够实现对茶叶中多种游离氨基酸对映异构体的同时检测。

本发明采用的技术方案如下：

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征包括以下步骤：

1）氨基酸混合消旋体标准品溶液的配制

将消旋化氨基酸标准品配制成2.5 μmol/mL的盐酸溶液，-20 ºC低温保存待用；

2）氨基酸混合消旋体标准品的衍生化反应

精确吸取5 μL-1000 μL不同梯度体积的步骤1）所述氨基酸混合消旋体标准品溶液，采用酯化-五氟丙酸酐酰化衍生法将各氨基酸标准品衍生化为易汽化的氨基酸PFP异丙酯衍生物，除去多余反应试剂后用四氢呋喃溶解，静置待用；

3）氨基酸对映异构体定性参数的确定及定量标准工作曲线的绘制

将步骤2）所述氨基酸对映异构体混合衍生物进行手性气相色谱-质谱联用分析，以各氨基酸对映异构体衍生物的保留时间、质谱特征峰离子作为定性参数，并以氨基酸对映异构体标准品浓度为横坐标、氨基酸对映异构体衍生物定量离子峰为纵坐标，绘制氨基酸对映异构体的标准工作曲线；

4）茶叶中游离氨基酸对映异构体的定性定量分析

称取茶粉样1.0 g，加入50 mL沸纯净水，充分浸提并高速离心后，取1 mL上层清液进行酯化-五氟丙酸酐酰化衍生化，除去多余反应试剂后用四氢呋喃溶解；

采用与步骤3）相同的手性气相色谱-质谱联用分析方法对获得的氨基酸衍生物进行分析，根据步骤3）中标准品的保留时间及定性离子对茶汤中的游离氨基酸对映异构体进行定性，根据步骤3）中获得的氨基酸对映异构体标准工作曲线，计算出茶叶中各游离氨基酸对映异构体的含量。

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤1）中消旋化氨基酸标准品包含DL-丙氨酸、DL-缬氨酸、DL-苏氨酸、DL-异亮氨酸、DL-亮氨酸、DL-脯氨酸、DL-丝氨酸、DL-半胱氨酸、DL-天冬氨酸、DL-蛋氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、DL-赖氨酸、DL-色氨酸及DL-谷氨酸。

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤2）具体包括以下步骤：

用适合量程的移液枪分别吸取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL及1000 μL混合标准品溶液置于15 mL离心管中，加入100 μL 4 mol/L的盐酸/异丙醇溶液，在100 ºC下恒温反应105 min，反应完毕后，将剩余的试剂旋干浓缩，-56 ºC下真空冷冻至绝对干燥状态；在反应物中加入200 μL四氢呋喃并转移至特制回流冷凝试管中，继而向试管中加入100 μL五氟丙酸酐，用回流冷凝管密封试管，在100 ºC下恒温反应10 min，反应完毕冷却至室温后，用50 ºC旋转蒸发仪将多余的试剂除去，最后用150 μL四氢呋喃溶解转移至含200 μL内插管的2.0 mL液相进样瓶中，静置待用。

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤3）中手性气相色谱-质谱联用分析条件为：

GC条件：Agilent 7890A-5975C，Chirasil-L-Val 25 m×0.22 mm×0.12 μm手性气相色谱柱；进样口温度为250 ºC；分流进样，分流比为10:1，载气为高纯度氦气，纯度≥99.99%；柱箱温度采用程序升温：80 ºC保持3 min，然后以3 ºC·min^-1升到200 ºC保持10min，流速为1.2 mL·min^-1，进样量为1.0 μL。MS条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；传输线温度 250 ºC；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33-600 u。

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤3）中所述定量离子为各氨基酸对映异构体质谱离子碎片峰中丰度最高或特异性最强的离子。

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤4）中茶汤中游离氨基酸对映异构体的具体提取及衍生化步骤为：

称取茶粉样1.0 g，加入50 mL沸纯净水，100 ºC浸提5分钟后，用离心机低温离心20分钟；用移液枪取1 mL上层清液置于15 mL离心管中，加入100 μL 4 mol/L的盐酸/异丙醇溶液，100 ºC下恒温反应105 min，反应完毕后，将剩余的试剂旋干浓缩，-56 ºC下真空冷冻至绝对干燥状态（24 h）；在反应物中加入200 μL四氢呋喃并转移至特制回流冷凝试管中，继而向试管中加入100 μL五氟丙酸酐，用回流冷凝管密封试管，100 ºC恒温反应10 分钟，反应完毕冷却至室温后，用50 ºC旋转蒸发仪将多余的试剂除去，最后用150 μL四氢呋喃溶解转移至含200 μL内插管的2.0 mL液相进样瓶中，静置待用。

所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤4）中茶叶中各游离氨基酸对映异构体的含量具体计算方法为将检测到的各氨基酸对映异构体的定量离子峰面积代入步骤2）中标准工作曲线所获得的线性方程中，经计算获得浓度数值。

采用本发明提供的方法能够同时鉴定出茶叶样品中的15种游离氨基酸对映异构体，其中各化合物的定性参数如表1所示。

表1 挥发性萜类化合物对映异构体定性参数表

采用本发明提供的方法在极广的浓度范围内（12.5-2500 nmol）呈现较好的线性关系，相关系数高达0.9987，检测限低至2.5 nmol，RSD值介于3.26-11.48%，可实现对茶叶中15对常见游离氨基酸对映异构体的同时精确定性定量检测。

本发明采用气相色谱-质谱联用法结合手性色谱技术首次将茶叶中15种常见的游离氨基酸对映异构体成功分离，该方法可实现15种游离氨基酸对映异构体的同时精确定量检测，线性浓度范围广，相关系数高，检测限、定量限及相对标准偏差均较为理想。本方法溶剂使用量少，前处理简单，容易操作，且可以极大避免其他检测方法中难以避免的“峰重叠”现象，在茶叶品质化学理论研究及茶叶滋味品质的调控方面均具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为氨基酸衍生化步骤（以苯丙氨酸为例）；

图2为15种氨基酸对映异构体标准品总离子流图；

图3为绿茶中各游离氨基酸对映异构体的含量分布；

图4为不同绿茶中游离氨基酸的含量总和比较；

图5为红茶中各游离氨基酸对映异构体的含量分布；

图6为不同红茶中游离氨基酸的含量总和比较。

具体实施方式

以下结合实例及附图来对本发明做进一步的解释说明。本实例仅用于具体说明该方法，而并非对本发明的范围进行限制，任何依照本发明的教导所做出的改动或改进，均属于本发明的保护范围。

实施例1：绿茶混合茶样中15种游离氨基酸的对映异构体分离

茶样制备：西湖龙井、碧螺春、信阳毛尖、恩施玉露、日照绿茶及抹茶的等量混合样，用研磨机磨粉过40目筛备用。

酯化/PFP酰化衍生化氨基酸混合标准品步骤（以苯丙氨酸为例，氨基酸衍生化反应方程式如图1所示）：分别称取各氨基酸消旋标准品0.1 mmol于100 mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度线，摇匀，静置；用移液枪取100 μL溶液置于15 mL离心管中，加入100μL 4 mol/L的盐酸/异丙醇溶液，90 ºC下恒温反应30 min（酯化步骤），反应完毕后，将剩余的试剂旋干浓缩，-56 ºC下真空冷冻至绝对干燥状态（24 h）；在反应物中加入200 μL二氯甲烷并转移至特制回流冷凝试管中，继而向试管中加入100 μL五氟丙酸酐，用回流冷凝管密封试管，90 ºC恒温反应20 分钟（酰化步骤），反应完毕冷却至室温后，用50 ºC旋转蒸发仪将多余的试剂除去，最后用150 μL二氯甲烷溶解转移至含150 μL内插管的2.0 mL液相进样瓶中，静置待用。获得的氨基酸对映异构体标准品GC-MS总离子流图如图2所示。

酯化/PFP酰化衍生化绿茶茶汤中游离氨基酸步骤：称取混合茶粉样1.0 g，加入50mL沸纯净水，100 ºC浸提5分钟后，用离心机低温离心20分钟；用移液枪取1 mL上层清液置于15 mL离心管中，加入100 μL 4 mol/L的盐酸/异丙醇溶液，90 ºC下恒温反应30 min（酯化步骤），反应完毕后，将剩余的试剂旋干浓缩，-56 ºC下真空冷冻至绝对干燥状态（24 h）；在反应物中加入200 μL二氯甲烷并转移至特制回流冷凝试管中，继而向试管中加入100 μL五氟丙酸酐，用回流冷凝管密封试管，90 ºC恒温反应20 分钟（酰化步骤），反应完毕冷却至室温后，用50 ºC旋转蒸发仪将多余的试剂除去，最后用150 μL二氯甲烷溶解转移至含200μL内插管的2.0 mL液相进样瓶中，静置待用。

GC条件：Agilent 7890A-5975C（美国Agilent公司），Chirasil-L-Val（25 m×0.22mm×0.12 μm）手性气相色谱柱；进样口温度为250 ºC；分流进样，分流比为10:1，载气为高纯度氦气，纯度≥99.99%；柱箱温度采用程序升温：80 ºC保持3 min，然后以3 ºC·min^-1升到200 ºC保持10 min，流速为1.2 mL·min^-1，进样量为1.0 μL。MS条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；传输线温度 250 ºC；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33—600 u。

混合茶样中可检测到的游离氨基酸对映异构。实验结果表明，在混合茶粉样中可检测到L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、D-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸及L-色氨酸等。其中苏氨酸L/D比值为1.49:1，苯丙氨酸L/D比值为37.22:1，谷氨酸混合物L/D比值为306.8:1。

实施例2：茶叶中游离氨基酸对映异构体定量分析方法的建立

具体操作步骤：

1）游离氨基酸对映异构体混合标准品溶液的配制

将消旋化（即D型、L型氨基酸对映异构体等量混合物）氨基酸标准品：DL-丙氨酸、DL-缬氨酸、DL-苏氨酸、DL-异亮氨酸、DL-亮氨酸、DL-脯氨酸、DL-丝氨酸、DL-半胱氨酸、DL-天冬氨酸、DL-蛋氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、DL-赖氨酸、DL-色氨酸及DL-谷氨酸配制成2.5μmol/mL的盐酸溶液，-20 ºC低温保存待用。

2）外标法建立各氨基酸对映异构体标准曲线

用适合量程的移液枪分别吸取5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL及1000μL混标溶液置于15 mL离心管中，加入100 μL 4 mol/L的盐酸/异丙醇溶液，在100 ºC下恒温反应105 min，反应完毕后，将剩余的试剂旋干浓缩，-56 ºC下真空冷冻至绝对干燥状态（24 h）；在反应物中加入200 μL四氢呋喃并转移至特制回流冷凝试管中，继而向试管中加入100 μL五氟丙酸酐，用回流冷凝管密封试管，在100 ºC下恒温反应10 min，反应完毕冷却至室温后，用50 ºC旋转蒸发仪将多余的试剂除去，最后用150 μL四氢呋喃溶解转移至含200 μL内插管的2.0 mL液相进样瓶中，静置待用。对每个浓度的标准品进行GC-MS分析后，以各氨基酸的浓度为横坐标，以相应定量离子峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立线性方程。

手性GC-MS分析条件： GC条件：Agilent 7890A-5975C（美国Agilent公司），Chirasil-L-Val（25 m×0.22 mm×0.12 μm）手性气相色谱柱；进样口温度为250 ºC；分流进样，分流比为10:1，载气为高纯度氦气，纯度≥99.99%；柱箱温度采用程序升温：80 ºC保持3 min，然后以3 ºC·min-1升到200 ºC保持10 min，流速为1.2 mL·min-1，进样量为1.0μL。MS条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；传输线温度 250 ºC；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33—600 u。

3）游离氨基酸定量方法的重复性、检测限及定量限测定

取100 μL混标溶液按上述的衍生化方法重复衍生化5次，根据各氨基酸的5次定量离子峰面积分别计算RSD值。各氨基酸的检测限（limit of detection, LOD）为相应定量离子峰信噪比约等于3.0时对应的氨基酸浓度，定量限（limit of quantitation, LOQ）为相应定量离子峰信噪比约等于10.0时对应的氨基酸浓度。

各氨基酸对映异构体的线性浓度范围、定性限、定量限及RSD值如表2所示。

表2 游离氨基酸对映异构体定量参数及方法学考察结果

实施例3：茶叶中游离氨基酸对映异构体的定性定量分析

绿茶样品10个：西湖龙井（XHLJ）、日照绿茶（RZ）、信阳毛尖（XYMJ）、恩施玉露（ESYL）、碧螺春（BLC）、抹茶（MC）、不同品种炒青绿茶4个：龙井43（LJ43）、中茶108（ZC108）、中茶302（ZC302）、中茶102（ZC102）

红茶样品8个：英德红茶（YH）2个、祁门红茶（QH）、九曲红梅（QQHM）、滇红（DH）、阿萨姆红茶（ASM）、印度大吉岭红茶（DJL）、斯里兰卡锡兰红茶（CL）

称取茶粉样1.0 g，加入50 mL沸纯净水，100 ºC浸提5分钟后，用离心机低温离心20分钟；用移液枪取1 mL上层清液置于15 mL离心管中，加入100 μL 4 mol/L的盐酸/异丙醇溶液，100 ºC下恒温反应105 min，反应完毕后，将剩余的试剂旋干浓缩，-56 ºC下真空冷冻至绝对干燥状态（24 h）；在反应物中加入200 μL四氢呋喃并转移至特制回流冷凝试管中，继而向试管中加入100 μL五氟丙酸酐，用回流冷凝管密封试管，100 ºC恒温反应10 分钟，反应完毕冷却至室温后，用50 ºC旋转蒸发仪将多余的试剂除去，最后用150 μL四氢呋喃溶解转移至含200 μL内插管的2.0 mL液相进样瓶中，静置待用。每个茶样均重复三次。

GC条件：Agilent 7890A-5975C（美国Agilent公司），Chirasil-L-Val（25 m×0.22mm×0.12 μm）手性气相色谱柱；进样口温度为250 ºC；分流进样，分流比为10:1，载气为高纯度氦气，纯度≥99.99%；柱箱温度采用程序升温：80 ºC保持3 min，然后以3 ºC·min^-1升到200 ºC保持10 min，流速为1.2 mL·min^-1，进样量为1.0 μL。MS条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；传输线温度 250 ºC；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33-600 u。

绿茶和红茶中游离氨基酸对映异构体组成及含量表如表3所示。实验结果表明，在绿茶或红茶样品中均可以检测到大部分目标游离氨基酸的1-2个对映异构体。在各氨基酸的组成分布上，以各绿茶中游离氨基酸对映异构体的含量中位数为指标，结果如图3所示。L-谷氨酸的含量远高于其它氨基酸，L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸及D-天冬氨酸的含量也显著高于其它氨基酸对映异构体。接下来，对绿茶间的氨基酸总量进行比较，结果如图4所示。10种绿茶的氨基酸总量介于19.20-41.18 mg/g，其中抹茶中游离氨基酸对映异构体总量最高，日照绿茶中氨基酸总量最低，而其它8个绿茶的氨基酸总量相差不大。

8个红茶样品的定量分析结果表明，大部分氨基酸可以检测到1-2个对映异构体，但亮氨酸的两个对映异构体、D-蛋氨酸、D-酪氨酸及D-色氨酸在所有红茶样品中均未到达检测限。在各氨基酸的组成上，以各红茶中各游离氨基酸对映异构体含量的中位数为指标，结果如图5所示。L-谷氨酸的含量远高于其它氨基酸，含量介于3.56-9.76 mg/g。在大部分红茶中L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、D-天冬氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸的含量也相对较高。此外，D构型的谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸及赖氨酸在红茶中也可被检测到，但含量相对较低。8种红茶的游离氨基酸总量介于14.19-31.26 mg/g（图6），其中滇红中游离氨基酸总量最高，英德红茶、九曲红梅及祁红次之，而来自国外的三种红茶中氨基酸总量较为接近且含量最低。

表3 绿茶和红茶中游离氨基酸对映异构体组成及含量表

。

综上所述，采用本发明所述方法，溶剂使用量少，前处理简单，容易操作，即可实现对茶叶中15种重要游离氨基酸对映异构体的精确定性定量。本发明实例中仅对部分绿茶及红茶中游离氨基酸对映异构体的含量进行测定，若需测定更多其他类别茶叶或更多种类氨基酸对映异构体，可以依照本发明的指导进行检测或采用适当的方法优化后进行检测，以上延伸内容均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征包括以下步骤：

1）氨基酸混合消旋体标准品溶液的配制

2）氨基酸混合消旋体标准品的衍生化反应

4）茶叶中游离氨基酸对映异构体的定性定量分析

2.根据权利要求1所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤1）中消旋化氨基酸标准品包含DL-丙氨酸、DL-缬氨酸、DL-苏氨酸、DL-异亮氨酸、DL-亮氨酸、DL-脯氨酸、DL-丝氨酸、DL-半胱氨酸、DL-天冬氨酸、DL-蛋氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、DL-赖氨酸、DL-色氨酸及DL-谷氨酸。

3.根据权利要求1所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤2）具体包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤3）中手性气相色谱-质谱联用分析条件为：

GC条件：Agilent 7890A-5975C，Chirasil-L-Val 25 m×0.22 mm×0.12 μm手性气相色谱柱；进样口温度为250 ºC；分流进样，分流比为10:1，载气为高纯度氦气，纯度≥99.99%；柱箱温度采用程序升温：80 ºC保持3 min，然后以3 ºC·min^-1升到200 ºC保持10min，流速为1.2 mL·min^-1，进样量为1.0 μL；

MS条件：电子轰击离子源；电子能量-70 eV；传输线温度 250 ºC；离子源温度220 ºC；质量扫描范围m/z 33-600 u。

5.根据权利要求1所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤3）中所述定量离子为各氨基酸对映异构体质谱离子碎片峰中丰度最高或特异性最强的离子。

6.根据权利要求1所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤4）中茶汤中游离氨基酸对映异构体的具体提取及衍生化步骤为：

7.根据权利要求1所述的一种茶叶中游离氨基酸对映异构体的检测方法，其特征在于所述步骤4）中茶叶中各游离氨基酸对映异构体的含量具体计算方法为将检测到的各氨基酸对映异构体的定量离子峰面积代入步骤2）中标准工作曲线所获得的线性方程中，经计算获得浓度数值。