CN108445102B - 一种高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵产物分析技术领域，具体涉及一种高盐稀态酿造酱油中3‑甲硫基丙醇的定量分析方法：利用3‑²H₃‑甲硫基丙醇作为内标物，采用气相色谱‑质谱联用仪对高盐稀态酿造酱油中提取的3‑甲硫基丙醇进行定量分析。由于内标物3‑²H₃‑甲硫基丙醇与被定量的3‑甲硫基丙醇分子量只相差3，且二者的理化性质完全相同，所以所得定量结果更准确，不仅如此，本发明克服现有分析方法中的缺陷，同时操作简单。

Description

一种高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法

技术领域

本发明属于发酵产物分析技术领域，具体涉及一种高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法。

背景技术

3-甲硫基丙醇是一种非常重要的香气成分，它具有酱油和肉汤的特征香气，以及微弱的甜洋葱香气；作为重要的挥发性香成分，它存在于酱油、白酒、啤酒、腐乳等发酵制品以及苹果、西红柿、扇贝等天然产物中。如何对其进行准确定量，对于改进产品加工工艺，提高产品品质具有重要的应用价值。

由于3-甲硫基丙醇曾经被认为是芝麻香型白酒的重要香成分之一，所以关于食品中3-甲硫基丙醇的定量分析方法中，目前文献报道比较多的是如何定量分析白酒中的3-甲硫基丙醇；主要的方法有：(1)以乙酸正戊酯为内标，利用注射器直接进样，采用装有氢火焰离子化检测器(FID)的气相色谱仪进行定量分析(GB/T 10345-2007)；(2)首先用3-甲硫基丙醇建立标准曲线，然后用有机溶剂萃取酒样中的3-甲硫基丙醇，再用注射器进样，采用装有火焰光度检测器(FPD)的气相色谱仪进行定量分析(①孙啸涛，张锋国，董蔚，等.芝麻香白酒中3-甲硫基丙醇的GC-FPD分析[J].食品科学技术学报，2014，32(5):27-34.②唐晖慧，金美东.分散液液微萃取结合气相色谱-火焰光度检测器法测定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇[J].食品与发酵工业，2016，42(5):210-216.)；(3)首先用3-甲硫基丙醇建立标准曲线(有内标或无内标)，然后用有机溶剂萃取酒样中的3-甲硫基丙醇，再用注射器进样，采用气相色谱-质谱联用仪/选择离子扫描模式进行定量分析(①孙啸涛，张锋国，董蔚，等.GC-MS/SIM法测定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇[J].中国食品学报，2015，15(2):214-222.②赵东瑞，柳金龙，张锋国，等.GC-MS/SIM内标法定量分析两种类型酒中的3-甲硫基丙醇[J].中国食品学报，2016，16(5):196-204.)。

这些方法存在的主要问题是：(1)需要用有机溶剂萃取样品中的3-甲硫基丙醇，然后对萃取物进行浓缩；既用到了有机溶剂，浓缩过程中也会有部分3-甲硫基丙醇损失。(2)对于白酒，可以采用直接进样法分析样品，但是直接进样的方法不适合分析高盐稀态酿造酱油中的3-甲硫基丙醇，因为酱油中会有一些不挥发或难挥发的成分；如果采用有机溶剂萃取，也会将高盐稀态酿造酱油中自身存在的色素、糖、小分子的肽等不挥发或难挥发的成分萃取出来，为了去除这些成分还需要采用其他的处理方法。(3)采用的内标乙酸正戊酯(分子量为130)或4-甲硫基丁醇(分子量为120)为内标时，由于它们的分子量和结构与3-甲硫基丙醇(分子量为106)的分子量和结构不同，分析仪器对它们的响应存在较大差异，分析所得3-甲硫基丙醇的定量分析结果与样品中实际存在的量存在较大的差异。

本发明的目的是提供一种可克服现有分析方法中的缺陷，同时操作简单，准确度较高的定量分析高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可克服现有分析方法中的缺陷，同时操作简单，准确度较高的定量分析高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的方法。

上述目的是通过如下技术方案实现：一种高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，利用3-²H₃-甲硫基丙醇作为内标物，采用气相色谱-质谱联用仪对高盐稀态酿造酱油中提取的3-甲硫基丙醇进行定量分析。由于内标物3-²H₃-甲硫基丙醇与被定量的3-甲硫基丙醇分子量只相差3，且二者的理化性质完全相同，所以所得定量结果更准确。

作为优选，进一步的技术方案是：具体包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：称取预定量的3-甲硫基丙醇和3-²H₃-甲硫基丙醇，采用无水甲醇作为溶剂，分别配制预定浓度的3-甲硫基丙醇和3-²H₃-甲硫基丙醇的标准溶液，取不同体积的3-甲硫基丙醇的标准溶液和3-²H₃-甲硫基丙醇的标准溶液进行混合，得到3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的不同浓度比的溶液，对所述3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇不同浓度的溶液采用气相色谱-质谱联用仪进行检测分析，以3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比为横坐标，以质核比为109和106的离子峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，并得到曲线方程；

(2)酱油中3-甲硫基丙醇的提取：取预定量的待测高盐稀态酿造酱油，加入预定量的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇，采用固相微萃取法提取高盐稀态酿造酱油中的3-甲硫基丙醇以及加入的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇；

(3)样品检测：将步骤(2)中的提取物采用气相色谱-质谱联用仪进行检测分析，分别提取质核比为109和106的碎片离子的峰面积；

(4)结果计算：根据步骤(3)的检测结果，按照步骤(1)得到的标准曲线的曲线方程计算检测物中3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比，并根据步骤(2)中取的待测高盐稀态酿造酱油的量以及加入的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的量计算出待测高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的量。

作为优选，进一步的技术方案是：内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的合成路线为：以3-巯基丙酸乙酯和氘代碘甲烷为原料，在相转移催化剂四丁基硫酸氢铵的作用下，合成3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯；采用氢化铝锂对3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯进行还原制得3-²H₃-甲硫基丙醇。具体的反应途径如下：

作为优选，进一步的技术方案是：所述内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的合成方法的具体步骤为：

(1)3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯的合成：将预定量的3-巯基丙酸乙酯、氘代碘甲烷和氯仿加入到三口烧瓶中，搅拌预定时间；将预定量的四丁基硫酸氢铵和氢氧化钠溶于去离子水中，将上述混合物滴加到三口烧瓶中，之后继续反应预定时间；反应结束后分液出有机相和水相，水相用氯仿萃取，将有机相和萃取物合并后用洗涤至中性，干燥，除氯仿，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯；

(2)3-²H₃-甲硫基丙醇的合成：在干燥的三口烧瓶加入预定量的无水乙醚和氢化铝锂，搅拌并在冰水浴与氮气的保护下，用恒压滴液漏斗缓慢地向三口烧瓶中滴加预定量的3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯和无水乙醚的混合物，滴加完毕后继续反应预定时间，然后加热回流反应预定时间，反应结束后冷却，将反应混合物缓慢倒入盛有冰水中，调节pH值到6左右，分液出有机相和水相，水相用乙醚萃取，将有机相和萃取物合并后洗涤，干燥，除乙醚，得到3-²H₃-甲硫基丙醇粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙醇。

作为优选，进一步的技术方案是：所述内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的合成方法的具体步骤为：

(1)3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯的合成：在100mL三口烧瓶中依次加入一个磁力搅拌子、6.7g 3-巯基丙酸乙酯、2.5mL的氘代碘甲烷和50mL氯仿，在室温下搅拌反应30min；然后将3.40g四丁基硫酸氢铵、2.0g氢氧化钠和10mL去离子水的混合物用恒压滴液漏斗缓慢的滴加到三口烧瓶中，滴加完毕后搅拌反应1h；反应结束后分液出有机相和水相，水相用的氯仿萃取，合并有机相和萃取物，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥；之后旋蒸除去氯仿，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯；

(2)3-²H₃-甲硫基丙醇的合成：在干燥的三口烧瓶加入50mL无水乙醚和0.63g氢化铝锂，在磁力搅拌下，用冰水浴与氮气的保护下，用恒压滴液漏斗缓慢地向三口烧瓶中滴加3.0g 3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯和10mL的无水乙醚的混合物，滴加完毕后继续反应6h，然后加热回流反应2h，反应结束后冷却，将反应混合物缓慢倒入盛有冰水中，用稀盐酸调节pH值到6左右，反应结束后分液出有机相和水相，水相用乙醚萃取，将有机相和萃取物合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥；之后旋蒸除去乙醚，得到3-²H₃-甲硫基丙醇粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙醇。

作为优选，进一步的技术方案是：所述步骤(2)中：在固相微萃取专用瓶中加入预定量的高盐稀态酿造酱油和一个磁力搅拌子，搅拌，在高盐稀态酿造酱油中加入氯化钠至饱和，然后加入预定量的3-²H₃-甲硫基丙醇，在预定温度水浴中平衡预定时间；将萃取纤维在气相色谱仪进样口中在检测温度下老化至无杂峰，然后将老化后的萃取纤维插入装有样品的固相微萃取专用瓶子中，吸附预定时间；所述步骤(3)中：将步骤(2)中完成吸附的萃取纤维插入到气-质联用仪的进样口，在预定温度下解析预定时间。萃取纤维可以是2cm长的50/30μm DVB/CAR/PDMS。

作为优选，进一步的技术方案是：所述步骤(1)和步骤(3)中气相色谱-质谱联用仪检测过程的气相色谱条件为：所采用的色谱柱为DB-Wax毛细管色谱柱，柱子长度30.0m，内径250μm，膜厚0.25μm；进样口温度250℃；色谱柱采用程序升温，起始温度为40℃，保持2min，以15℃/min的速率升至230℃，保持5min；载气为He，载气流量1.66mL/min；使用的是固相微萃取专用衬管，采用不分流进样模式；质谱条件为：电离方式为电子轰击源EI，电离能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描模式为SIM，选择扫描的离子的质核比为109和106；其中109为3-²H₃-甲硫基丙醇的分子离子的质核比，且为基峰；106为3-甲硫基丙醇的分子离子的质核比，且为基峰；溶剂延迟5min。

作为优选，进一步的技术方案是：所述步骤(1)中，3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的混合溶液的浓度分别为1:5、1:3、1:1、3:1、5:1。

作为优选，进一步的技术方案是：所述步骤(2)中，在高盐稀态酿造酱油中加入的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的预定量根据步骤(3)中结果调整确定，保证待测样品中3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比落在步骤(1)中的标准曲线范围内。在具体的实验过程中，待测物中的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇可以从推荐量开始，如果不合适，可以根据检测结果进行调整，保证定量分析出的结果在标准曲线范围内，保证定量分析的准确度。优选，在待测的酱油中加入推荐量后的3-²H₃-甲硫基丙醇，使其在酱油中的浓度为2.5mg/L，实验表明即可得到较准确的定量结果。

作为优选，进一步的技术方案是：所述步骤(1)中3-甲硫基丙醇和3-²H₃-甲硫基丙醇的标准溶液的浓度范围为1～20mg/L。标准溶液的浓度主要根据中3-甲硫基丙醇在待测物中范围而定，采用本方法检测前，可采用其他方法对待测物中的中3-甲硫基丙醇进行粗略检测，确定其浓度范围，当然也可根据检测检测结果进行调整。

本发明的定量分析方法克服了现有分析方法中的缺点，主要优点在于：

1、本发明的定量分析方法所得回收率较高，精密度良好，结果较准确；

2、操作简单、方便。通过测定市售多个品牌和多种级别的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的含量发现，其浓度范围基本上为1mg/L-5mg/L，在实际测定时只需根据样品量的多少添加3-²H₃-甲硫基丙醇，使其在酱油中的浓度为2.5mg/L，即可得到较准确的定量结果。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明一种实施方式下的作出的标准曲线；

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。此外，本领域技术人员根据本文件的描述，可以对本文件中实施例中以及不同实施例中的特征进行相应组合。

本发明实施例如下，包括以下所试剂与设备：

试剂与耗材：3-巯基丙酸乙酯、氯仿、乙醚、氯化钠、乙酸乙酯、石油醚(30-60)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氘代碘甲烷、氢氧化钠(分析纯，北京伊诺凯科技有限公司)、四丁基硫酸氢铵、氢化铝锂(分析纯，上海麦克林生化有限公公司)；200目硅胶(分析纯，烟台江友硅胶开发有限公司)；3-甲硫基丙醇(含量大于99.5％，山东滕州瑞元香料公司)；顶空进样瓶(40mL顶空瓶，赛默飞公司)。

仪器与设备：7890B气相色谱-5977A质谱联用仪(美国安捷伦公司)；2cm长50/30μmDVB/CAR/PDMS(灰色)萃取纤维、手动固相微萃取手柄、SPME操作平台(美国Supleco公司)；DF-lO1S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器责任有限公司)。

具体实施例：

3-²H₃-甲硫基丙醇的合成

在100mL三口烧瓶中依次加入一个磁力搅拌子、6.7g(0.05mol)3-巯基丙酸乙酯、2.5mL(0.04mol)的氘代碘甲烷和50mL氯仿，在室温(25℃)下搅拌反应30min；然后将3.40g(0.01mol)四丁基硫酸氢铵、2.0g(0.05mol)氢氧化钠和10mL去离子水的混合物用恒压滴液漏斗缓慢的滴加到三口烧瓶中，滴加完毕后搅拌反应1h。反应结束后分出有机相，水相用10mL×5的氯仿萃取，合并有机相和萃取物，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥；之后旋蒸除去氯仿，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯粗品，用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到纯度大于98％的3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯，其产率为90％。

在干燥的三口烧瓶加入50mL无水乙醚和0.63g(0.16mol)氢化铝锂，在磁力搅拌下，用冰水浴与氮气的保护下，用恒压滴液漏斗缓慢地向三口烧瓶中滴加3.0g(0.02mol)3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯和10mL的无水乙醚的混合物，滴加完毕后继续反应6h，然后加热回流反应2h，反应结束后冷却，将反应混合物缓慢倒入盛有冰水中，用稀盐酸调节pH值到6左右，分出有机相，水相用20mL×5的乙醚萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥；之后旋蒸除去乙醚，得到3-²H₃-甲硫基丙醇粗品，用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到纯度大于98％的3-²H₃-甲硫基丙醇，其产率为95％。

标准曲线的绘制

准确称取0.02800g合成的3-²H₃-甲硫基丙醇，用色谱纯无水甲醇定容到2mL，得到浓度为14.00mg/mL的3-²H₃-甲硫基丙醇的甲醇溶液；同样配置浓度为14.00mg/mL的色谱纯3-甲硫基丙醇的甲醇溶液。分别取不同体积的3-²H₃-甲硫基丙醇的甲醇溶液和3-甲硫基丙醇的甲醇溶液进行混合，得到3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比分别为1:5、1:3、1:1、3:1、5:1的溶液，然后在下述的气相色谱-质谱联用条件下进行分析，进样量为0.6μL，以二者的浓度比为横坐标(x)，以质核比为109和106的离子峰面积比为纵坐标(y)，绘制标准曲线，所得标准曲线为y＝0.9055x+0.1077，标准曲线的线性相关系数R²＝0.9992。

固相微萃取

在40mL固相微萃取专用瓶中加入16mL高盐稀态酿造酱油和一个磁力搅拌子，在室温下搅拌，加入氯化钠至饱和，然后加入一定量(推荐用量是42μg)的3-²H₃-甲硫基丙醇，在45℃水浴中平衡20min。将2cm长的灰色萃取纤维在GC-MS的气相色谱仪进样口中在250℃下老化至无杂峰，将萃取纤维插入装有样品的固相微萃取专用瓶子中，吸附40min；拔出萃取纤维，插入气相色谱仪进样口中在250℃下解吸附5min。

气相色谱-质谱联用分析条件

气相色谱条件：所采用的色谱柱为DB-Wax(长度30.0m，内径250μm，膜厚0.25μm)毛细管色谱柱；进样口温度250℃；色谱柱采用程序升温，起始温度为40℃，保持2min，以15℃/min的速率升至230℃，保持5min；载气为He，载气流量1.66mL/min；在此气相色谱条件下，3-²H₃-甲硫基丙醇和3-甲硫基丙醇的保留时间都是11.6min。采用固相微萃取所富集到的高盐稀态酿造酱油中的3-甲硫基丙醇进行分析，使用的是固相微萃取专用衬管(通过分析不同浓度比的3-²H₃-甲硫基丙醇和3-甲硫基丙醇的溶液来测定响应因子时，使用的是分析液体样品所用的衬管)，采用不分流进样模式。

质谱条件：电离方式为电子轰击源(EI源)，电离能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描模式为SIM，选择扫描的离子的质核比为109(3-²H₃-甲硫基丙醇的分子离子，且为基峰)和106(3-甲硫基丙醇的分子离子，且为基峰)，溶剂延迟5min。

检测过程：将萃取物通过气相色谱-质谱联用仪进行分离与分析，使用的是选择离子扫描模式，扫描质核比为106和109的碎片离子，分别提取106和109的碎片离子的峰面积。

分析结果

(1)响应因子的测定

所得标准曲线为y＝0.9055x+0.1077，标准曲线的线性相关系数R²＝0.9992，标准曲线的斜率的倒数为响应因子R_f＝1.1044；定量限小于1μg/L。

(2)回收率与精密度

①空白加标回收率

采用以下配方制得的不含3-甲硫基丙醇的基质作为空白加标实验的模拟酱油基质。

8.0g谷氨酸钠、17.0g氯化钠、0.35g I+G、0.012g三氯蔗糖、2mL无水乙醇、0.12g山梨酸钾、3.58g焦糖色，用纯净水定容到100mL。

在40mL顶空样品瓶中加入16mL模拟酱油基质和一个磁力搅拌子，加入氯化钠至饱和，然后分别加入一定量的3-²H₃-甲硫基丙醇和3-甲硫基丙醇，按照(2)和(3)的方法进行萃取与分析，所得结果如表1所示。

表1空白加标实验结果

②样品加标回收率

采用两种市售儿童酱油进行加标回收率实验，一种是国产禾然乐童有机酱油，一种是日本产福山儿童酱油；在进行加标回收率测定之前，采用本专利的方法测定了两种儿童酱油本身含有的3-甲硫基丙醇的含量，测定结果如表2所示。

表2两种儿童酱中3-甲硫基丙醇含量的测定结果

在测定了两种酱油中所含的3-甲硫基丙醇浓度后，又往酱油中添加了3-甲硫基丙醇，然后采用本专利的方法测定酱油中3-甲硫基丙醇的总浓度；根据测定结果，计算出酱油中添加的3-甲硫基丙醇的浓度以及回收率，所得结果如表3所示。

表3样品添加实验结果

从以上所得结果可知，空白加标回收率和样品加标回收率都在95％左右，说明本专利的定量分析方法较准确。

③精密度

酱油瓶子一旦开启，由于有空气进入，放置一段时间，里面的挥发性成分就会发生变化，其中3-甲硫基丙醇的浓度也会有所变化；为了减少样品不稳定带来的误差，采用①中制备的空白基质加入3-甲硫基丙醇的方法测定方法的精密度，空白基质中3-甲硫基丙醇的浓度为2.625mg/L，连续测定三天，每天测定三次，所得结果如4所示。

表4精密度

3-甲硫基丙醇(2.625mg/L)	日内精密度	日间精密度
			相对标准偏差	1.5	2.8

从所得结果可知，相对标准偏差都小于3％，精密度良好。

(3)检测结果

对市售20个高盐稀态酿造酱油中的3-甲硫基丙醇的含量进行了测定，所得结果如表5。

表5 20种市售高盐稀态酿造酱油中的3-甲硫基丙醇的含量

注：以上国产样品均购自北京永辉超市海淀区增光路店，日本产酱油从网上购得。

对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，利用3-²H₃-甲硫基丙醇作为内标物，采用气相色谱-质谱联用仪对高盐稀态酿造酱油中提取的3-甲硫基丙醇进行定量分析，具体包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：称取预定量的3-甲硫基丙醇和3-²H₃-甲硫基丙醇，采用无水甲醇作为溶剂，分别配制预定浓度的3-甲硫基丙醇和3-²H₃-甲硫基丙醇的标准溶液，取不同体积的3-甲硫基丙醇的标准溶液和3-²H₃-甲硫基丙醇的标准溶液进行混合，得到3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的不同浓度比的溶液，对所述3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇不同浓度的溶液采用气相色谱-质谱联用仪进行检测分析，以3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比为横坐标，以质核比为109和106的离子峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，并得到曲线方程；

(2)酱油中3-甲硫基丙醇的提取：取预定量的待测高盐稀态酿造酱油，加入预定量的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇，采用固相微萃取法提取高盐稀态酿造酱油中的3-甲硫基丙醇以及加入的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇；萃取纤维为2cm长的50/30μm DVB/CAR/PDMS；

(3)样品检测：将步骤(2)中的提取物采用气相色谱-质谱联用仪进行检测分析，分别提取质核比为109和106的碎片离子的峰面积；

(4)结果计算：根据步骤(3)的检测结果，按照步骤(1)得到的标准曲线的曲线方程计算检测物中3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比，并根据步骤(2)中取的待测高盐稀态酿造酱油的量以及加入的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的量计算出待测高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的量；

其中，所述步骤(1)和步骤(3)中气相色谱-质谱联用仪检测过程的气相色谱条件为：所采用的色谱柱为DB-Wax毛细管色谱柱，柱子长度30.0m，内径250μm，膜厚0.25μm；进样口温度250℃；色谱柱采用程序升温，起始温度为40℃，保持2min，以15℃/min的速率升至230℃，保持5min；载气为He，载气流量1.66mL/min；使用的是固相微萃取专用衬管，采用不分流进样模式；

质谱条件为：电离方式为电子轰击源EI，电离能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描模式为SIM，选择扫描的离子的质核比为109和106；其中109为3-²H₃-甲硫基丙醇的分子离子的质核比，且为基峰；106为3-甲硫基丙醇的分子离子的质核比，且为基峰；溶剂延迟5min。

2.根据权利要求1所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的合成路线为：以3-巯基丙酸乙酯和氘代碘甲烷为原料，在相转移催化剂四丁基硫酸氢铵的作用下，合成3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯；采用氢化铝锂对3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯进行还原制得3-²H₃-甲硫基丙醇。

3.根据权利要求2所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，所述内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的合成方法的具体步骤为：

(1)3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯的合成：将预定量的3-巯基丙酸乙酯、氘代碘甲烷和氯仿加入到三口烧瓶中，搅拌预定时间；将预定量的四丁基硫酸氢铵和氢氧化钠溶于去离子水中，将上述混合物滴加到三口烧瓶中，之后继续反应预定时间；反应结束后分液出有机相和水相，水相用氯仿萃取，将有机相和萃取物合并后用洗涤至中性，用干燥，除氯仿，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯；

(2)3-²H₃-甲硫基丙醇的合成：在干燥的三口烧瓶加入预定量的无水乙醚和氢化铝锂，搅拌并在冰水浴与氮气的保护下，用恒压滴液漏斗缓慢地向三口烧瓶中滴加预定量的3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯和无水乙醚的混合物，滴加完毕后继续反应预定时间，然后加热回流反应预定时间，反应结束后冷却，将反应混合物缓慢倒入盛有冰水中，调节pH值到6，分出有机相和水相，水相用乙醚萃取，将有机相和萃取物合并后洗涤，干燥，除乙醚，得到3-²H₃-甲硫基丙醇粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙醇。

4.根据权利要求3所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，所述内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的合成方法的具体步骤为：

(1)3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯的合成：在100mL三口烧瓶中依次加入一个磁力搅拌子、6.7g3-巯基丙酸乙酯、2.5mL的氘代碘甲烷和50mL氯仿，在室温下搅拌反应30min；然后将3.40g四丁基硫酸氢铵、2.0g氢氧化钠和10mL去离子水的混合物用恒压滴液漏斗缓慢的滴加到三口烧瓶中，滴加完毕后搅拌反应1h；反应结束后分液出有机相和水相，水相用的氯仿萃取，合并有机相和萃取物，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥；之后旋蒸除去氯仿，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯；

(2)3-²H₃-甲硫基丙醇的合成：在干燥的三口烧瓶加入50mL无水乙醚和0.63g氢化铝锂，在磁力搅拌下，用冰水浴与氮气的保护下，用恒压滴液漏斗缓慢地向三口烧瓶中滴加3.0g3-²H₃-甲硫基丙酸乙酯和10mL的无水乙醚的混合物，滴加完毕后继续反应6h，然后加热回流反应2h，反应结束后冷却，将反应混合物缓慢倒入盛有冰水中，用稀盐酸调节pH值到6，反应结束后分液出有机相和水相，水相用乙醚萃取，将有机相和萃取物合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥；之后旋蒸除去乙醚，得到3-²H₃-甲硫基丙醇粗品，粗品用乙酸乙酯和石油醚作洗脱剂，用硅胶柱进行提纯，得到3-²H₃-甲硫基丙醇。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中：在固相微萃取专用瓶中加入预定量的高盐稀态酿造酱油和一个磁力搅拌子，搅拌，在高盐稀态酿造酱油中加入氯化钠至饱和，然后加入预定量的3-²H₃-甲硫基丙醇，水浴中平衡预定时间；将萃取纤维在气相色谱仪进样口中在检测温度下老化至无杂峰，然后将老化后的萃取纤维插入装有样品的固相微萃取专用瓶子中，吸附预定时间；所述步骤(3)中：将步骤(2)中完成吸附的萃取纤维插入到气-质联用仪的进样口，在预定温度下解吸附预定时间。

6.根据权利要求5所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中，3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的混合溶液的浓度分别为1:5、1:3、1:1、3:1、5:1。

7.根据权利要求6所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在高盐稀态酿造酱油中加入的内标物3-²H₃-甲硫基丙醇的预定量根据步骤(3)中结果调整确定，保证待测样品中3-²H₃-甲硫基丙醇与3-甲硫基丙醇的浓度比落在步骤(1)中的标准曲线范围内。

8.根据权利要求7所述的高盐稀态酿造酱油中3-甲硫基丙醇的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中3-甲硫基丙醇和3-²H₃-甲硫基丙醇的标准溶液的浓度范围为1～20mg/L。

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