CN115541789A - 烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法 - Google Patents

烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法 Download PDF

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CN115541789A CN202211294044.0A CN202211294044A CN115541789A CN 115541789 A CN115541789 A CN 115541789A CN 202211294044 A CN202211294044 A CN 202211294044A CN 115541789 A CN115541789 A CN 115541789A
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苏悦
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付亚宁
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Abstract

本发明涉及烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法，该方法包括如下步骤：(1)称取烟草于离心管中，加入内标溶液和水性溶液，静置，备用；(2)在步骤(1)得到的烟草溶液中加入甲醇，超声萃取，备用；(3)将步骤(2)得到的萃取液进行液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)分析；(4)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。

Description

烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法。
背景技术
烟草中烟碱占烟草生物碱总量的95％以上，在烟草中绝大部分与有机酸成盐并以烟碱盐形式存在。烟草及烟草制品中烟碱盐主要包括烟碱苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐等，其含量与烟草质量密切相关(烟草科技,2003,(6):6-10.)。目前烟草及烟草制品中烟碱的测试方法主要是气相色谱法(YC/T 246-2008.)、气相色谱-质谱联用法(YC/T 559-2018.)和液相色谱-串联质谱法(Journal of Chromatography A1999,852(2):451-463.)等，有机酸的测试方法主要是气相色谱法(YC/T 288-2009)、液相色谱法(中国烟草学报2007,(1):11-14.)和液相色谱-串联质谱法(江西农业学报2018,30(6):75-79.)等，但尚未见同时测定烟草及烟草制品中烟碱盐(烟碱及有机酸)含量的方法。有机酸测试中的气相色谱法前处理需要衍生化，操作繁琐，液相色谱法易出现假阳性结果，而液相色谱-串联质谱法前处理简单，不需要衍生化。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的空白，建立了一种烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法，该方法使用LC-MS/MS技术，实现了同时检测烟碱盐中的烟碱、苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、山梨酸、丁二酸，该方法具有操作简单、高通量、高分离度的优点，适合烟草及烟草制品中有机酸和烟碱的分析及测定。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法，该方法包括如下步骤：
(1)称取烟草于离心管中，加入内标溶液和水性溶液，静置，备用；
(2)在步骤(1)得到的烟草溶液中加入甲醇，超声萃取，备用；
(3)将步骤(2)得到的萃取液进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析；
(4)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。
优选地，在步骤(1)中，所述内标溶液为苯甲酸-d5及烟碱-d3的甲醇溶液，浓度为500μg/mL和400μg/mL。
优选地，在步骤(1)中，所述水性溶液为纯水、甲酸水溶液、乙酸水溶液，优选为乙酸水溶液。
优选地，在步骤(1)中，当水性溶液为甲酸水溶液或乙酸水溶液时，溶液的浓度为0.2～1％(体积比)，优选为0.2％(体积比)。
优选地，在步骤(1)中，当水性溶液为纯水时，体积为5～15mL，优选为5mL。
优选地，在步骤(2)中，所述甲醇的体积为10～20mL，优选为20mL。
优选地，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析使用的色谱柱选自Phenomenex Kinetex HILIC(4.6×150mm，2.6μm)、Phenomenex Luna C18(2)(4.6×150mm，3μm)、Waters Xbridge BEH Amide(2.1×100mm，2.5μm)和Thermo SCIENTIFIC AcclaimTrinity P1(3×100mm，3μm)色谱柱，优选为Waters Xbridge BEH Amide(2.1×100mm，2.5μm)色谱柱。
优选地，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析使用的流动相选自5mmol/L乙酸铵水溶液和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5)溶液、5mmol/L乙酸铵水溶液(pH 9.0)和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)溶液，优选为5mmol/L乙酸铵水溶液(pH 9.0)和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)溶液。
优选地，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析的色谱条件还包括：柱温为40℃；梯度洗脱程序为：初始流速0.6mL/min，0.5min时流速降至0.4mL/min，7.2min时流速升至0.6mL/min，保持1.8min，运行总时间为9min；进样体积为1μL。
优选地，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析的质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：ESI(+)；检测模式：MRM模式；锥孔温度(Cone Temperature)：130℃；电喷雾电压(Spray Voltage)：4000V(+)，3500V(-)；锥孔气流速(Cone Gas Flow)：20psi；加热探针温度(Heated Probe Temperature)：350℃；探针气流速(Probe GasFlow)：50psi；雾化器气流速(Nebulizer Gas Flow)：55psi。
优选地，在步骤(3)中，目标化合物和内标的MRM质谱检测参数如下：
Figure BDA0003902465870000031
优选地，在步骤(4)中，所述内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(苯甲酸-d5及烟碱-d3)，以各标准工作溶液中目标物与内标的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。
优选地，在步骤(4)中，所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为：烟碱为0.10～100μg/mL，柠檬酸为10-100μg/mL，酒石酸为5-100μg/mL，丙酮酸为1-100μg/mL，其他有机酸为0.1-100μg/mL。
优选地，所述烟碱盐包括苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、丁二酸、山梨酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸与烟碱形成的盐。
在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)称取烟草于离心管中，加入内标溶液和浓度为0.2％(体积比)乙酸水溶液，静置，备用；
(2)在步骤(1)得到的烟草溶液中加入甲醇，超声萃取，备用。
(3)将步骤(2)得到的萃取液进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析；
色谱条件：色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱(2.1×100mm，2.5μm)，柱温为40℃；流动相为5mmol/L乙酸铵溶液(pH 9.0)和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)溶液，梯度洗脱程序为：初始流速0.6mL/min，0.5min时流速降至0.4mL/min，7.2min时流速升至0.6mL/min，保持1.8min，运行总时间为9min；进样体积为1μL。
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：ESI(+)；检测模式：MRM模式；锥孔温度(Cone Temperature)：130℃；电喷雾电压(Spray Voltage)：4000V(+)，3500V(-)；锥孔气流速(Cone Gas Flow)：20psi；加热探针温度(Heated Probe Temperature)：350℃；探针气流速(Probe Gas Flow)：50psi；雾化器气流速(Nebulizer Gas Flow)：55psi。
目标化合物和内标的MRM质谱检测参数如下：
Figure BDA0003902465870000041
Figure BDA0003902465870000051
注：“*”表示定量离子。
(4)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。
其中，内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(苯甲酸-d5及烟碱-d3)，以各标准工作溶液中目标物与内标的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量；
所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为：烟碱为0.10～100μg/mL，柠檬酸为10-100μg/mL，酒石酸为5-100μg/mL，丙酮酸为1-100μg/mL，其他有机酸为0.1-100μg/mL。
与现有技术相比较，本发明至少具有以下有益的技术效果：
本发明基于LC-MS/MS技术，对色谱柱、流动相组成、流动相流速和质谱条件等进行了考察，建立了一种电子烟烟液中非挥发性有机酸和烟碱的分析方法，实现了苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、丁二酸、山梨酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和烟碱的同时分析方法，具有通量高、分离度好、操作简便、回收率及重复性好等优点，适合电子烟烟液中非挥发性有机酸和烟碱的分析。
附图说明
图1为实施例1中液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法的目标化合物MRM色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施的方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：一种烟草中有机酸烟碱盐的检测方法
(1)仪器与试剂
仪器：液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)系统由美国Agilent 1290超高效液相色谱仪(包括G7129B自动进样器、G7120A四元溶剂泵、G1316B柱温箱)及Bruker EVOQ三重四极杆质谱仪(配ESI离子源)组成，数据采集与处理软件为HyStar Software；超声仪(YM-100S，语盟)；电子天平(AE163，瑞士Mettler公司，感量：0.0001g)；MultiVortex多样品涡旋混合器(Detelogy)。
试剂耗材：苯甲酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸及烟碱购于Alfa Aesar，纯度大于88％，苯甲酸-d5和烟碱-d3购于Macklin，纯度大于98％，超纯水、甲醇(色谱纯)，乙酸(色谱级)，乙酸铵(纯度大于99％)，所用超纯水由Milli-Q系统(Milford，MA，USA)制得。
(2)仪器工作条件
本实验采用Agilent 1290超高效液相色谱仪，色谱柱为Waters XBridge BEHAmide(2.1×100mm，2.5μm)；流动相A：5mmol/L乙酸铵溶液(pH9.0)，流动相B：含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，(pH 9.0))；进样量1μL，柱温40℃。梯度洗脱程序如下表所示：
时间(min) A(％) B(％) 流速(μL/min)
0.00 0 100 600
0.50 0 100 400
7.00 50 50 400
7.20 0 100 600
9.00 0 100 600
质谱条件：锥孔温度(Cone Temperature)：130℃；电喷雾电压(Spray Voltage)：4000V(+)，3500V(-)；锥孔气流速(Cone Gas Flow)：20psi；加热探针温度(Heated ProbeTemperature)：350℃；探针气流速(Probe Gas Flow)：50psi；雾化器气流速(NebulizerGas Flow)：55psi；
目标化合物和内标的MRM质谱检测参数如下：
Figure BDA0003902465870000061
Figure BDA0003902465870000071
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法的目标化合物多反应监测(MRM)色谱图如图1所示。
(3)样品前处理
称取50mg烟草样品于50mL离心管中，加入500μL内标(苯甲酸-d5浓度为500μg/mL，烟碱-d3浓度为400μg/mL)，加入5mL 0.2％乙酸水溶液，静置30min。加入20mL甲醇，超声提取30min。取1mL提取液于色谱分析瓶中，进样分析。
(4)标准工作溶液配制
①、内标溶液的配制：分别准确称取50mg苯甲酸-d5、40mg烟碱-d3，各置于10mL棕色容量瓶中，以甲醇定容，配制成浓度分别约为5mg/mL和4mg/mL的内标储备液。其中烟碱-d3用于测定烟碱，苯甲酸-d5用于测定苯甲酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和丙酮酸。
②、一级标准储备液的配制
准确称取苯甲酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸和烟碱各2.0g，分别置于25mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度线，配制成浓度约为80mg/mL的标准品储备溶液。该溶液应在4℃～8℃条件下避光保存。
③、二级标准储备液的配制
精密吸取一定体积的苯甲酸、水杨酸、丁二酸、山梨酸、柠檬酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸和烟碱储备液，置于50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度线，配制成浓度为5mg/mL的混合二级标准储备溶液。
④、标准工作溶液的配制
准确移取混合二级标准储备溶液和内标溶液，用甲醇配制成最终浓度分别为0.1、1、5、10、20、40、50、80、100μg/mL的标准工作溶液，其中内标中苯甲酸-d5最终浓度为10μg/mL、烟碱-d3最终浓度为8μg/mL。
(5)样品测定
将步骤(4)所得标准曲线溶液和步骤(3)所得样品溶液分别进行HPLC-MS/MS分析，标准工作溶液中目标物及其内标多反应监测(MRM)色谱图见附图。以各标准工作溶液中目标物与内标物的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为纵坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量。
(6)方法验证
根据最低级标准工作溶液，按照3倍信噪比计算该方法的检出限，按照低、中、高3种添加水平计算加标回收率，每个水平添加5个平行样品，根据平行测试结果计算测试精密度。该方法的线性范围、线性系数、检出限、平均加标回收率、平均精密度如表1所示。
表1、各目标物线性范围、线性系数、检出限、平均加标回收率及平均精密度
Figure BDA0003902465870000081
Figure BDA0003902465870000091
(7)实际样品分析
根据上述测定方法，选择4个烟草样品，测得目标物含量如表2所示：
表2、典型烟草样品中烟碱和有机酸含量结果(mg/g)
Figure BDA0003902465870000092
实施例2：色谱柱的选择实验
考虑到有机酸的强极性化学性质，因此，主要选择了Phenomenex公司的KinetexHILIC(4.6×150mm，2.6μm)和Luna C18(2)(4.6×150mm，3μm)、Waters公司的Xbridge BEHAmide(2.1×100mm，2.5μm)，以及Thermo的SCIENTIFIC Acclaim Trinity P1(3×100mm，3μm)四种色谱柱比较。具体实验过程如实施例1所示。
研究发现：
①、根据色谱柱推荐流动相(甲醇-甲酸铵溶液)，Kinetex HILIC色谱柱对有机酸分离效果不理想，且苹果酸、酒石酸、柠檬酸及烟碱在色谱柱上无保留，通过优化流动相条件对未保留化合物无改善；SCIENTIFIC Acclaim Trinity P1色谱柱对有机酸分离效果明显，但水杨酸、苹果酸、柠檬酸及烟碱在色谱柱上无保留。
②、Luna C18(2)色谱柱对所有有机酸和烟碱均有保留，但多数有机酸保留时间集中，分离效果不佳。进一步优化流动相洗脱比例和时间，改善效果不明显。
③、根据色谱柱推荐流动相(乙腈-乙酸铵溶液)，所有目标物均能够在XbridgeBEH Amide色谱柱上保留，通过进一步优化流动相及梯度洗脱条件，取得较理想的分离效果。
故最终确定的色谱柱为Xbridge BEH Amide(2.1×100mm，2.5μm)色谱柱。
实施例3：流动相的选择实验
为了考察流动相对检测方法的影响，选择了以下几种流动相进行研究，水、乙腈、5mmol/L乙酸铵水溶液、5mmol/L乙酸铵水溶液(pH9.0)、含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5)溶液、含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)溶液。除流动相外，其余方法参照实施例1。
结果发现：
①、流动相中使用水或乙腈等溶剂，目标物中柠檬酸、酒石酸、丁二酸未保留，影响化合物保留效果。
②、流动相中水相和有机相分别添加乙酸铵(5mmol/L乙酸铵水溶液和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5)溶液)，目标物均有保留，柠檬酸、酒石酸响应较低。
③、调整流动相pH，使水相和有机相的pH均为9.0，(5mmol/L乙酸铵水溶液和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5)溶液)，取得了较为理想的效果。
故最终确定的流动相组成为方案③。
实施例4：溶剂的选择实验
考虑到烟草中含有烟碱、柠檬酸、苹果酸等目标物，有机酸易溶于水，因此采用甲醇和水作为提取溶剂，以烟碱、柠檬酸、苹果酸在烟草中的含量为评价指标，分别使用25mL纯水、25mL甲醇、不同体积的水和甲醇作为提取溶剂分析溶剂对烟草提取的影响，除溶剂外，其余方法参照实施例1。
结果如表3所示：
表3纯水和甲醇对烟草样品中烟碱、柠檬酸、苹果酸萃取的影响
Figure BDA0003902465870000101
研究发现：采用含有纯水的溶剂提取烟草，苹果酸、柠檬酸、烟碱的含量均较高，因此选用三种含水的提取方式为宜。
实施例5：提取方式的选择试验
在实施例4的基础上用纯水提取、不同体积的纯水和甲醇混合提取的方式，比较烟草中的加标回收率。
结果发现：
①、25ml纯水提取方式中山梨酸、酒石酸、烟碱回收率偏低，柠檬酸含量偏高。
②、10mL纯水浸泡，15mL甲醇提取方式中酒石酸、烟碱回收率偏低，柠檬酸回收率偏高。
③、5mL纯水浸泡，20mL甲醇提取方式中烟碱含量偏低。
相比三种提取方法最终确定的方式为方案③。
实施例6：酸性水的选择实验
为了考察水的酸性对提取烟碱的影响，在纯水中分别加入甲酸、乙酸，酸性浓度0.2％和1％。除酸性成分及浓度外，其余方法参照实施例3，比较酸性及浓度对烟碱及有机酸的提取效果影响。
研究发现：
①、纯水中加入0.2％及1％甲酸后苯甲酸、酒石酸回收率偏高，甲酸浓度为0.2％时烟碱回收率低，甲酸浓度为1％时烟碱回收率高，超过范围。
②、纯水中加入0.2％及1％乙酸后，烟碱回收率适中。
③、乙酸浓度为0.2％时提取的烟草中烟碱及柠檬酸含量均高于乙酸浓度为1％时的提取含量。
因此最终确定的酸性浓度为0.2％的乙酸。
实施例7：萃取方式的选择实验
为了考察不同萃取方式对提取烟碱和有机酸的影响，分别使用超声萃取和涡旋萃取两种方式考察萃取效率，萃取时间均为30min。
研究发现：两种萃取方式有机酸含量基本相同，使用超声萃取时苹果酸含量稍高于涡旋萃取，因此选用超声萃取方法。

Claims (10)

1.一种烟草及烟草制品中烟碱盐含量的测定方法，该方法包括如下步骤：
(1)称取烟草于离心管中，加入内标溶液和水性溶液，静置，备用；
(2)在步骤(1)得到的烟草溶液中加入甲醇，超声萃取，备用；
(3)将步骤(2)得到的萃取液进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析；
(4)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述内标溶液为苯甲酸-d5和烟碱-d3的甲醇溶液，浓度为500μg/mL和400μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述水性溶液为纯水、甲酸水溶液、乙酸水溶液，优选为乙酸水溶液；
优选地，在步骤(1)中，当水性溶液为甲酸水溶液或乙酸水溶液时，溶液的浓度为0.2～1％(体积比)，优选为0.2％(体积比)；
优选地，在步骤(1)中，当水性溶液为纯水时，体积为5～15mL，优选为5mL。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述甲醇的体积为10～20mL，优选为20mL。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析使用的色谱柱选自Phenomenex Kinetex HILIC(4.6×150mm，2.6μm)、Phenomenex Luna C18(2)(4.6×150mm，3μm)、Waters Xbridge BEH Amide(2.1×100mm，2.5μm)和Thermo SCIENTIFIC Acclaim Trinity P1(3×100mm，3μm)色谱柱，优选为WatersXbridge BEH Amide(2.1×100mm，2.5μm)色谱柱；
优选地，所述液相色谱-串联质谱分析使用的流动相选自5mmol/L乙酸铵水溶液和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5)溶液、5mmol/L乙酸铵溶液(pH 9.0)和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)溶液，优选为5mmol/L乙酸铵水溶液(pH9.0)和含浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)溶液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析的色谱条件还包括：柱温为40℃；梯度洗脱程序为：初始流速0.6mL/min，0.5min时流速降至0.4mL/min，7.2min时流速升至0.6mL/min，保持1.8min，运行总时间为9min；进样体积为1μL。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述液相色谱-串联质谱分析的质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：ESI(+)；检测模式：MRM模式；锥孔温度(Cone Temperature)：130℃；电喷雾电压(Spray Voltage)：4000V(+)，3500V(-)；锥孔气流速(Cone Gas Flow)：20psi；加热探针温度(Heated ProbeTemperature)：350℃；探针气流速(Probe Gas Flow)：50psi；雾化器气流速(NebulizerGas Flow)：55psi；
优选地，在步骤(3)中，目标化合物和内标的MRM质谱检测参数如下：
Figure FDA0003902465860000021
Figure FDA0003902465860000031
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(苯甲酸-d5及烟碱-d3)，以各标准工作溶液中目标物与内标物的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量；
优选地，在步骤(4)中，所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为：烟碱为0.10～100μg/mL，柠檬酸为10-100μg/mL，酒石酸为5-100μg/mL，其他有机酸为0.1-100μg/mL。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述烟碱盐包括苯甲酸、水杨酸、丙酮酸、丁二酸、山梨酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸与烟碱形成的盐。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)称取烟草于离心管中，加入内标溶液和0.2％(体积比)乙酸水溶液，静置，备用；
(2)在步骤(1)得到的烟草溶液中加入甲醇，超声萃取，备用；
(3)将步骤(2)得到的萃取液进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析；
色谱条件：色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱(2.1×100mm，2.5μm)，柱温为40℃；流动相为5mmol/L乙酸铵溶液(pH 9.0)及浓度为5mmol/L乙酸铵的乙腈/水(V:V＝95/5，pH 9.0)，梯度洗脱程序为：初始流速0.6mL/min，0.5min时流速降至0.4mL/min，7.2min时流速升至0.6mL/min，保持1.8min，运行总时间为9min；进样体积为1μL；
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；离子化方式：ESI(+)；检测模式：MRM模式；锥孔温度(Cone Temperature)：130℃；电喷雾电压(Spray Voltage)：4000V(+)，3500V(-)；锥孔气流速(Cone Gas Flow)：20psi；加热探针温度(Heated Probe Temperature)：350℃；探针气流速(Probe Gas Flow)：50psi；雾化器气流速(Nebulizer Gas Flow)：55psi；
目标化合物和内标的MRM质谱检测参数如下：
Figure FDA0003902465860000041
注：“*”表示定量离子
(4)采用内标标准曲线法定量计算样品中目标物的含量
其中，内标标准曲线法为：配制含有目标物的系列标准工作溶液，加入内标(苯甲酸-d5及烟碱-d3)，以各标准工作溶液中目标物与内标的定量离子峰面积比为纵坐标，以各标准工作溶液中目标物的含量为横坐标制作标准工作曲线；将步骤(3)的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中的目标物含量，再进一步计算得到样品中各目标物的含量；
所述系列标准工作溶液中各目标物的浓度范围为：烟碱为0.10～100μg/mL，柠檬酸为10-100μg/mL，酒石酸为5-100μg/mL，丙酮酸为1-100μg/mL，其他有机酸为0.1-100μg/mL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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NL2036103A (en) * 2023-05-19 2023-11-23 Yunnan Tobacco Quality Supervision And Testing Station Method for analyzing and detecting organic acid in tobacco

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