CN104614466B - 电子烟烟液中防腐剂的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于电子烟烟液中有害物质残留的理化检验技术领域，具体是一种电子烟烟液中4种防腐剂（对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯）的测定方法，其特征在于：样品振荡提取后，提取液经过分散固相萃取净化，萃取液稀释5倍，最后用液相色谱-串联质谱测定。本方法能够快速、准确检测电子烟烟液中4种防腐剂，具有测定结果准确、操作简便，测定干扰少、灵敏度高及重复性好的优点。

Description

电子烟烟液中防腐剂的测定方法

技术领域

本发明属于烟用材料中有害物质残留的理化检验技术领域，主要涉及电子烟烟液中4种防腐剂对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯的测定方法，具体说是样品振荡提取后，提取液经过分散固相萃取净化，将萃取液稀释5倍，最后用液相色谱-串联质谱测定。

背景技术

电子烟是近年来发展最为迅速的一种新型烟草制品，它由烟液、雾化器和电池杆三部分组成，烟用香精作为电子烟液的调味调香剂，在电子烟中运用极为广泛，烟用香精中所含有的防腐剂和甜味剂是食品行业最常用的添加剂。对羟基苯甲酸酯(Paraben)又称尼泊金酯，因其低毒、非挥发性、良好的杀菌能力和稳定性而被用作防腐剂，是一类低毒高效防腐剂，广泛的使用于食品、化妆品和医药。我国食品中允许使用的防腐剂有32种，并且在GB/2760-1996标准中明确规定了对羟基苯甲酸酯类及其钠盐含量。

高海军等【高海军，李勇，严正龙等.气相色谱法测定食品中6种对羟基苯甲酸酯及其钠盐.粮油食品科技,2011,19(3)】运用气相色谱法（FID检测器）建立了食品中毒性相对较大的6种低碳链醇烃基对羟基苯甲酸酯及其钠盐(甲、乙、异丙、丙、异丁、丁)含量的测定方法。鞠福龙等【鞠福龙,李春娟，李东刚.气相色谱一质谱联用法同时检测调味品中7种防腐剂.中国调味品,2009,10(34)】运用气相色谱-质谱联用法同时检测调味品中对羟基苯甲酸丙酯及其钠盐等7中防腐剂。但是对羟基苯甲酸丙酯钠是对羟基苯甲酸丙酯的钠盐形式，而钠盐的熔点很高，很难气化，用GC或是GC-MS时，在样品处理过程中需要进行酸化和提取处理，操作复杂，实验影响因素多。刘英等【刘英,尹州，邹晓筱等.高效液相色谱法同时测定蜜饯中的16种食品添加剂.分析测试学报,2011,30(6)】运用高效液相色谱法同时测定了蜜饯中对羟基苯甲酸丙酯等16种食品添加剂。赵孔祥【赵孔祥,苏毅,陈旭艳等.高效液相色谱法测定化妆品中10种限用物质.分析测试学报,2011,30(6)】应用高效液相色谱法测定了化妆品中对羟基苯甲酸丙酯等10种限用物质。陈皑【陈皑，何乔桑，王萍亚等.固相萃取-高效液相色谱法测定水果和果酱中的6种对羟基苯甲酸酯.色谱，2009，27（6）】等样品经固相萃取柱净化，采用HPLC分离，同时测定了水果和果酱中6种对羟基苯甲酸酯的含量。汪隽等【汪隽,许淑霞,范必威.安捷伦2007全国有机质谱用户学术交流会论文集，2007】建立了简便、快速的处理乳制食品的固相萃取前处理方法和分析乳制食品中对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的高效液相色谱法，并用液质联用法对所建立的方法进行了验证。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）相对于高效液相色谱而言，它能在复杂基质中对化合物进行更为准确的识别，定性更为准确，灵敏度更高，可以避免假阳性结果的出现。

发明内容：

本发明的目的正是基于上述现有状况而提供的一种电子烟烟液中对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯的测定方法，本方法克服了现有技术缺陷，能够快速、准确检测电子烟烟液中4种防腐剂对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯残留量，且测定结果准确、测定干扰少。

本发明鉴于上述现有的分析方法，考虑到电子烟烟液中以上防腐剂的含量很低，而且杂质干扰比较严重的情况，因此选用分散固相萃取和液相色谱-串联质谱相结合的方法分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种电子烟烟液中4种防腐剂对羟基苯甲酸甲酯，是对对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯4种防腐剂的测定方法，首先称取适量的样品后加乙醇振荡提取，提取液经C18固相分散萃取剂进一步净化，最后萃取液过滤稀释后直接以液相色谱-串联质谱测定，具体包括以下步骤：

a、称取0.3g样品（精确至0.01g），并置于10mL具塞离心管中。

b、样品的提取：准确加入5mL乙醇（实验过程我们优化了提取溶剂对提取效果的影响，甲醇、乙醇和乙腈提取效果相当，乙醇毒性最小），2000转/min涡旋振荡提取2min。

c、样品净化：静置5min，移取萃取液1mL于2mL离心管中，加入20mgC18固相萃取分散剂,2000转/min涡旋振荡2min，以5000转/min离心5min。吸取上清液,经0.22μm有机相滤膜过滤。

d、移取200μL滤液,用甲醇（由于萃取溶液采用乙醇粘度较大，对色谱柱寿命有影响，所以在此采用与流动相一致的甲醇进行稀释，降低基质效应的干扰）稀释至1mL，作为样品待测液；

e、准备标准工作溶液：称取0.01g的4种防腐剂标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；

f、液相色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的标准工作溶液以及样品待测液，分别注入液相色谱-串联质谱仪；

g、防腐剂测定结果的计算

以外标法进行定量分析，即以4种防腐剂的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99。对提取后的样品待测液进行测定，测得检出防腐剂的定量离子对峰面积，代入标准曲线求得样品中的防腐剂的残留量。

在本发明中标准工作溶液的配制方式如下：准确称取10mg的4种防腐剂于10mL容量瓶中，精确至0.1mg，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1000μg/mL标准储备溶液；分别移取100μL标准储备溶液到10mL容量瓶中，用甲醇定容，此标准溶液浓度为10.0μg/mL；分别移取一定体积的工作溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的4种防腐剂标准工作溶液，系列标准工作溶液浓度分别为：10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL和500ng/mL；

采用的液相色谱条件为：色谱柱：AtiantisdC18(150mm×2.1mm，3μm,美国Waters公司)；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液，流动相洗脱程序见表1。流速：200μL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描;电喷雾离子源(ESI);雾化气流量为60psi;气帘气流量20psi;辅助加热气流量为40psi;离子化温度500℃;碰撞气流量为6psi;4种气体均为氮气;停留时间为100msec;电离电压-4500V,检测方式：多离子反应监测（MRM），MRM参数见表2。

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对电子烟烟液样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

首次实现了电子烟烟液中对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯4种防腐剂的检测，为其他添加剂的检测提供了参考。

（1）本发明方法利用LC-MS/MS测定烟液中4种防腐剂的含量，可以同时进行定性和定量分析，有效降低了假阳性结果的出现。

（2）本发明采用毒性很小的溶剂乙醇提取，避免了有毒溶剂对环境的污染和操作人员的伤害。

（3）本发明萃取后用C18分散固相萃取剂净化除去色素等杂质，减少了杂质对样品测定的干扰。

（4）本发明进样前用甲醇将萃取液稀释5倍，此时样品基质中4种防腐剂的响应与同浓度用甲醇配制的4种防腐剂响应基本一致。如果稀释倍数太大将会使检测限提高，稀释倍数太低，基质效应太强，影响定量结果。用甲醇稀释可以避免溶剂效应的干扰。

（5）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①本发明方法的检测限：

将不同浓度的4种防腐剂标准工作溶液注入LC－MS/MS，得到线性范围和线性相关系数，以3倍信噪比（S/N=3）计算检测限（LOD），结果见表3。

②本发明方法的重复性和加标回收率：

在空白样品中加入高（20mg/kg）、中（10mg/kg）、低（5mg/kg）三种浓度的4种防腐剂的标准溶液，然后进行振荡萃取，分散固相萃取净化和LC－MS/MS分析，每个浓度平行做6个重复，并按照加标量和测定值计算其平均回收率，所有结果相对标准偏差小于5%，说明精密度良好，结果见表3。

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图。

图2为本发明标准溶液的选择离子色谱图。

图3为本发明实际样品加标的选择离子色谱图。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯，甲醇，乙醇均为色谱纯试剂；超纯水，符合GB/T6682中一级水的要求。

API4000四极杆串联质谱仪；瑞士MettlerAE163电子天平（感量：0.0001g）。

2．样品处理：

准确称取某一种电子烟烟液样品0.3g；并将其置于10mL具塞离心管中，准确加入5mL乙醇，涡旋振荡提取2min。静置5min，移取萃取液1mL于2mL离心管中，加入20mgC18分散固相萃取剂,涡旋振荡2min，以5000转/min离心5min。吸取上清液,经0.22μm有机相滤膜过滤。取200μL滤液用甲醇稀释至1mL,进LC-MS/MS分析。

3.准备标准工作溶液：准确称取10mg的4种防腐剂于10mL容量瓶中，精确至0.1mg，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1000μg/mL标准储备溶液；分别移取100μL标准储备溶液到10mL容量瓶中，用甲醇定容，此标准溶液浓度为10.0μg/mL；分别移取一定体积的工作溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的4种防腐剂标准工作溶液，系列标准工作溶液浓度分别为：10ng/mL,20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL和500ng/mL；

4.测定方法:以外标法进行定量分析，即以4种防腐剂的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99,对提取后的样品进行测定，测得检出目标物的定量离子对峰面积，代入标准曲线求样品中防腐剂残留量，但四种防腐剂均未检出。为判断方法的准确性，在此样品中加入10mg/kg的对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯标准溶液，进行同上的样品前处理，测得对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯含量分别为9.5mg/kg,10.04mg/kg,9.8mg/kg和9.65mg/kg，即对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的加标回收率为95%,100.4%,98％和96.5％，说明此方法是准确的。

实例2：

如实例1所述方法，选择另一烟用电子烟烟液样品，未检出防腐剂。

Claims (4)

1.一种电子烟烟液中防腐剂的测定方法，是对对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯四种防腐剂的测定，其特征在于：将电子烟烟液样品振荡提取后，提取液经过分散固相萃取净化，将萃取液稀释，最后用液相色谱-串联质谱测定，具体包括以下步骤：

a、称取0.3g样品，精确至0.01g，并置于10mL具塞离心管中；

b、样品的提取：准确加入5mL乙醇，2000转/min涡旋振荡提取2min；

c、样品净化：静置5min，移取萃取液1mL于2mL离心管中，加入20mgC18固相萃取分散剂,2000转/min涡旋振荡2min，以5000转/min离心5min，吸取上清液,经0.22μm有机相滤膜过滤；

d、移取200μL滤液,用甲醇稀释至1mL，作为样品待测液；

e、准备标准工作溶液：称取0.01g的4种防腐剂标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；

f、液相色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的标准工作溶液以及样品待测液，分别注入液相色谱-串联质谱仪；

g、防腐剂测定结果的计算

以外标法进行定量分析，即以4种防腐剂的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99；

对提取后的样品待测液进行测定，测得检出防腐剂的定量离子对峰面积，代入标准曲线求得样品中的防腐剂的残留量。

2.根据权利要求1所述的电子烟烟液中防腐剂的测定方法，其特征在于：标准工作溶液的配制方式如下：准确称取10mg的4种防腐剂于10mL容量瓶中，精确至0.1mg，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1000μg/mL标准储备溶液；分别移取100μL标准储备溶液到10mL容量瓶中，用甲醇定容，此标准溶液浓度为10.0μg/mL；分别移取一定体积的标准溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的4种防腐剂标准工作溶液，系列标准工作溶液浓度分别为：10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL和500ng/mL。

3.根据权利要求1所述的电子烟烟液中防腐剂的测定方法，其特征在于：采用的液相色谱条件为：色谱柱：AtiantisdC18，规格150mm×2.1mm，3μm；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液，流动相洗脱，流速：200μL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描;电喷雾离子源(ESI);雾化气流量为60psi;气帘气流量20psi;辅助加热气流量为40psi;离子化温度500℃;碰撞气流量为6psi;4种气体均为氮气;停留时间为100msec;电离电压-4500V,检测方式：多离子反应监测（MRM）。

4.根据权利要求3所述的电子烟烟液中防腐剂的测定方法，其特征在于：流动相洗脱程序如下

流动相洗脱程序

时间（min） A% B% 0 20 80 2 20 80 3 80 20 12 80 201 --> 13 20 80 20 20 80

。