CN102854278A

CN102854278A - 香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法

Info

Publication number: CN102854278A
Application number: CN2012103324681A
Authority: CN
Inventors: 黎小云; 邵雪莲; 奚景梁; 黄瑞标; 张露; 孙斌
Original assignee: Yingtan Huabao Flavours and Fragrances Co Ltd
Current assignee: Yingtan Huabao Flavours and Fragrances Co Ltd
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明提供一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法。用加有甲基丁香酚内标的无水乙醇溶液稀释样品，样品过滤后使用气相色谱/质谱选择离子法测定稀释后样品中香豆素和黄樟素的含量。以保留时间和监测离子丰度定性，通过选择特征离子进行定量，甲基丁香酚、香豆素、黄樟素的定量离子在质谱图中的m/z分别为178、146、162。以内标法绘制标准曲线，测定样品溶液，由标准曲线计算得出稀释样品中香豆素、黄樟素的量，进而可得出原样品中香豆素、黄樟素的含量。实践证明，此方法不仅简便易行，且能最大程度萃取烟用添加剂中的香豆素和黄樟素，图谱干净，可得到良好的分离效果和理想的色谱峰型，对气相色谱和质谱污染小。

Description

香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，尤其涉及一种烟用香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法。

背景技术

有文献报道香豆素和黄樟素作用于人体会引起肿瘤，国际肿瘤中心已确认黄樟素有致癌作用，早在1954年美国食品药品管理局就禁止在食品中添加香豆素，世界各国均禁止使用黄樟素。香豆素、黄樟素在无水乙醇等有机溶剂中均有较好的溶解度。烟用香精香料溶剂多为有机溶剂，香豆素和黄樟素可能会随着提取的植物成分进入到烟用香精香料中，因此有必要开发一种简便、稳定、准确的测定香豆素和黄樟素的方法来保障烟产品的安全。目前报道的香豆素和黄樟素检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电色谱法、毛细管电泳法、微分脉冲伏安法等。这其中液相色谱-质谱法及气相色谱-质谱法更灵敏、快捷，不过随着不断研究总结，还可以在此基础上发展更简便、准确、灵敏、适合企业实用的香豆素、黄樟素检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种更快速、简便、灵敏、准确的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法。内标甲基丁香酚物理化学性质、色谱行为和相应特征与香豆素、黄樟素更相近。萃取液色谱纯级无水乙醇纯度高、污染少，能较完全萃取香精香料中香豆素和黄樟素。此方法溶液配制简便，最大限度减少带入色谱中除样品外的化学物质，延长衬管、色谱柱使用寿命。此方法简便易行，结果准确，溶液配制简单，对气质连用仪消耗少，图谱干净，可得到良好的分离效果和理想的色谱峰型，适合烟用香精香料企业及相关机构大批量检测。

一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，包括以下步骤：

1) 萃取液：无水乙醇。

2) 内标溶液的配制：在无水乙醇中加入甲基丁香酚，配制浓度为10mg/ml的内标储备液，置于4℃下保存，有效期3个月，使用时再用内标储备液稀释1000倍，配制成浓度为10μg/ml的内标溶液。

3) 标准工作溶液的配制：取香豆素0.1g，黄樟素0.01g，精确至0.0001g，以无水乙醇定容至100ml，得到香豆素和黄樟素混合储备液，浓度分别为1mg/ml，0.1mg/ml，置于4℃下保存，有效期3个月，将混合储备液逐级稀释配制含香豆素和黄樟素的标准工作液。

4) 标准工作曲线绘制：对配制的标准工作溶液进行气相色谱和质谱选择离子测定，进样量1μl，计算每个标准工作溶液中香豆素、黄樟素与内标的峰面积比。以峰面积比为纵坐标，以香豆素、黄樟素质量为横坐标，绘制过原点标准工作曲线，得出回归方程，相关系数R²≧0.999。

5) 样品的处理：称取1.0g烟用香精香料于50ml三角瓶中，取5ml甲基丁香酚内标溶液溶解，振荡，静置，取上层清液，经过滤，得到待测样品溶液。

6) 样品的测定：取0.5ml～1.0ml待测样于气质联用仪进样瓶中，选择甲基丁香酚、香豆素和黄樟素质荷比m/z分别为178、146、162的离子进行定量分析，使用内标法绘制标准工作曲线，试样与标准工作曲线拟合，得出试样香豆素和黄樟素含量。

7) 结果的计算与表述：样品中的香豆素、黄樟素的含量(W)由下式计算得出：

W=M/m

式中：W—样品中香豆素、黄樟素的含量，单位为mg/kg。

M—根据计算结果，从标准工作曲线上读取的样品溶液中香豆素、黄樟素的量，单位为mg。

m—样品的质量，单位为kg。

无水乙醇为美国Fisher公司产HPLC Grade A995-4。

在步骤3）中，将混合储备液中香豆素溶度逐级稀释成0.5μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，7个不同浓度水平，则这7级混合标准工作溶液中黄樟素浓度水平分别为0.05 μg/ml，0.1 μg/ml，0.2 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml。从这7级混合标准工作溶液中分别移取1ml，各加入甲基丁香酚内标溶液5ml，摇匀，用直径0.45μm有机微孔滤膜过滤，制备7级加内标标准工作溶液，进样后制定标准工作曲线。

在步骤5）中，难溶于乙醇的样品可在水浴超声波中超声10min，静置时可用离心机加速分层，过滤时用直径0.45μm有机微孔滤膜。

在步骤6）中，气质联用仪的色谱条件：使用安捷伦公司型号为HP-INNOWAX的色谱柱（柱长30m，内径0.25m，膜厚0.25μm，固定相为聚乙二醇），载气为高纯氦(≧99.999%)，柱流速为1.0ml/min恒流，进样量为1μl，分流进样，分流比为10:1，进样口温度为250℃，程序升温为柱初始温度100℃，保持5min，以5℃/min的速率升至140℃，保持5min，然后以10℃/min的速率升至240℃，保持7min.。

气质联用仪的质谱条件：传输线温度为260℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电离能量为70eV，溶剂延迟10min，全扫描时间范围为10min-35min，定量使用选择离子模式，通过选择特征离子进行定量：黄樟素的质荷比m/z 162，甲基丁香酚的质荷比m/z 178，香豆素的质荷比m/z 146。以标准样品的保留时间和检测离子丰度定性：黄樟素m/z131/162约等于40%，扫描时段10.00min—19.00min；甲基丁香酚m/z147/178约等于30%，扫描时段19.00 min—24.00 min；香豆素m/z118/146约等于110%，扫描时段24min—34.00min。

[0017] 本发明以编号为17573(未检测出黄樟素)的样品为对象，加5mg/kg浓度的香豆素和5mg/kg浓度的黄樟素，做回收率和相对标准偏差实验，平行测定6次，结果如表1。

表1方法的回收率和相对标准偏差。

Figure 2012103324681100002DEST_PATH_IMAGE002

香豆素回收率为91.7%～102.2%，平均值为96.6%，黄樟素回收率为97.0%～99.6%，平均值为98.5%，6次检测结果算得香豆素相对标准偏差为3.59%，黄樟相对标准偏差为素1.04%。由结果可得出此方法具有较好的重现性，准确度高，稳定性好，适合企业和机构大批量检测使用。

经试验得出黄樟素的方法定量限(3S/N)为0.03mg/kg，香豆素的方法定量限(3S/N)为0.12 mg/kg。

本发明的有益效果：由方法回收率、相对标准偏差和方法定量限可知，本测定方法能完全萃取样品中香豆素和黄樟素，具有较好的重现性，准确度高，稳定性好，灵敏度高。由操作可知本方法简便易行，对仪器损耗少，带入的杂质少，所得图谱干净，可得到良好的分离效果和理想的色谱峰型，噪音小，适合企业、机构大批量检测使用。

附图说明

图1为由配制的混合标准工作溶液所得的香豆素标准工作曲线图。

图2为由配制的混合标准工作溶液所得的黄樟素标准工作曲线图。

图3为标准工作溶液中香豆素、甲基丁香酚、黄樟素保留时间图。

图4为选择事例样品17573色谱图。

图5为选择事例样品17573中香豆素色谱图。

具体实施方法

以下通过具体实施例来进一步说明本发明：

实施例1

试剂：无水乙醇、甲基丁香酚、黄樟素、香豆素。

仪器：Agilent产气质联用仪6890N-5975B，METTLER TOLEDO产电子天平AL204，SK-1快速混匀器，超声波清洗机，移液枪。

萃取液：美国Fisher产HPLC Grade A995-4 无水乙醇。

内标溶液的配制：在无水乙醇中加入甲基丁香酚，配制浓度为10mg/ml的内标储备液，使用时再用内标储备液稀释1000倍，配制成浓度为10μg/ml的内标溶液。

标准工作溶液的配制：取香豆素0.1g，黄樟素0.01g，精确至0.0001g，以无水乙醇定容至100ml，得到香豆素和黄樟素混合储备液，浓度分别为1mg/ml，0.1mg/ml。将混合储备液中香豆素溶度逐级稀释成0.5μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，7个不同浓度水平。则这7级混合标准工作液中黄樟素浓度水平分别为0.05 μg/ml，0.1 μg/ml，0.2 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml。从7级标准工作溶液中分别移取1ml，各加入甲基丁香酚内标溶液5ml，摇匀，用直径0.45μm有机微孔滤膜过滤，制备7级加内标标准工作溶液，进样后制定标准工作曲线。

气质联用仪色谱条件：安捷伦公司型号为HP-INNOWAX的色谱柱（柱长30m，内径0.25m，膜厚0.25μm，固定相为聚乙二醇），高纯氦载气 (≧99.999%)，柱流速为1.0ml/min恒流，进样量为1μl，分流进样，分流比为10:1，进样口温度为250℃，程序升温为柱初始温度100℃，保持5min，以5℃/min的速率升至140℃，保持5min，然后以10℃/min的速率升至240℃，保持7min.。

气质联用仪的质谱条件：传输线温度为260℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电离能量为70eV，溶剂延迟10min，全扫描时间范围为10min-35min，定量使用选择离子模式，通过选择特征离子进行定量：黄樟素的质荷比m/z 162，甲基丁香酚的质荷比m/z 178，香豆素的质荷比m/z 146。以标

准样品的保留时间和检测离子丰度定性：黄樟素m/z131/162约等于40%，扫描时段10.00min—19.00min；甲基丁香酚m/z147/178约等于30%，扫描时段19.00 min—24.00 min；香豆素m/z118/146约等于110%，扫描时段24min—34.00min。

标准工作曲线绘制：对配制的标准工作溶液进行气相色谱和质谱选择离子测定，进样量1μl，计算每个标准工作溶液中香豆素、黄樟素与内标的峰面积比。以峰面积比为纵坐标，以香豆素、黄樟素质量为横坐标，绘制过原点标准工作曲线，得出回归方程，相关系数R²≧0.999。

样品的处理：称取1.0g烟用香精香料于50ml三角瓶中，用移液枪取5ml甲基丁香酚内标溶液溶解，振荡，静置，取上层清液，经直径0.45μm有机微孔滤膜过滤，得到待测样品溶液。

样品的测定：取0.5ml～1.0ml待测样于气质联用仪进样瓶中，进样检测，试样与标准工作曲线拟合，得出试样香豆素和黄樟素含量。

结果的计算与表述：样品中的香豆素、黄樟素的含量(W)由下式计算得出：

W=M/m

式中：W—样品中香豆素、黄樟素的含量，单位为mg/kg。

m—样品的质量，单位为kg。

由配制的标准工作溶液所得的香豆素和黄樟素的标准工作曲线如图1、2。香豆素y=1319.4x-250.53，R²=0.9998；黄樟素y=1607.5x-11.823，R²=0.9999。

Claims

1.一种香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，包括以下步骤：

1）萃取液：无水乙醇；

2）内标溶液的配制：在无水乙醇中加入甲基丁香酚，配制浓度为10mg/ml的内标储备液，置于4℃下保存，有效期3个月，使用时再将内标储备液稀释1000倍，配制成浓度为10μg/ml的内标溶液；

3）标准工作溶液的配制：取香豆素0.1g，黄樟素0.01g，精确至0.0001g，以无水乙醇定容至100ml，得到香豆素和黄樟素混合储备液，浓度分别为1mg/ml，0.1mg/ml，置于4℃下保存，有效期3个月，将混合储备液逐级稀释配制含香豆素和黄樟素的标准工作液；

4）标准工作曲线绘制：对配制的标准工作溶液进行气相色谱和质谱选择离子测定，进样量1μl，计算每个标准工作溶液中香豆素、黄樟素与内标的峰面积比，以峰面积比为纵坐标，以香豆素、黄樟素质量为横坐标，绘制过原点标准工作曲线，得出回归方程，相关系数R²≧0.999；

5）样品的处理：称取1.0g烟用香精香料于50ml三角瓶中，用5ml甲基丁香酚内标溶液溶解，振荡，静置，取上层清液，经过滤，得到待测样品溶液；

6）样品的测定：取0.5ml～1.0ml待测样品溶液于气质联用仪进样瓶中，选择甲基丁香酚、香豆素和黄樟素质荷比m/z分别为178、146、162的离子进行定量分析，使用内标法绘制标准工作曲线，试样与标准工作曲线拟合，得出试样香豆素和黄樟素含量；

7）结果的计算与表述：样品中的香豆素、黄樟素的含量(W)由下式计算得出：

W=M/m，式中：W—样品中香豆素、黄樟素的含量，单位为mg/kg，M—根据计算结果，从标准工作曲线上读取的样品溶液中香豆素、黄樟素的量，单位为mg，m—样品的质量，单位为kg。

2.根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于：无水乙醇为美国Fisher公司产HPLC Grade A995-4。

3.根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于：在步骤3）中，将混合储备液中香豆素溶度逐级稀释成0.5μg/ml，1 μg/ml ，2 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，7个不同浓度水平，则这7级混合标准工作溶液中黄樟素浓度水平分别为0.05 μg/ml，0.1 μg/ml，0.2 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml，从这7级浓度的标准工作溶液中分别移取1ml，各加入甲基丁香酚内标溶液5ml，摇匀，用直径0.45μm有机微孔滤膜过滤，制备7级加内标标准工作溶液，进样后制定标准工作曲线。

4.根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于：在步骤5）中，难溶于乙醇的样品可在水浴超声波中超声10min，静置时可用离心机加速分层，过滤时用直径0.45μm有机微孔滤膜。

5.根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法，其特征在于：在步骤6）中，气质联用仪的色谱条件：使用安捷伦公司型号为HP-INNOWAX的色谱柱，载气为高纯氦，柱流速为1.0ml/min恒流，进样量为1μl，分流进样，分流比为10:1，进样口温度为250℃，程序升温为柱初始温度100℃，保持5min，以5℃/min的速率升至140℃，保持5min，然后以10℃/min的速率升至240℃，保持7min.，气质联用仪的质谱条件：传输线温度为260℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，电离能量为70eV，溶剂延迟10min，全扫描时间范围为10min-35min，定量使用选择离子模式，通过选择特征离子进行定量：黄樟素的质荷比m/z 162，甲基丁香酚的质荷比m/z 178，香豆素的质荷比m/z 146，以标准样品的保留时间和检测离子丰度定性：黄樟素m/z131/162约等于40%，扫描时段10.00min—19.00min；甲基丁香酚m/z147/178约等于30%，扫描时段19.00 min—24.00 min；香豆素m/z118/146约等于110%，扫描时段24min—34.00min。