CN107064362B - 口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定 - Google Patents

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Abstract

一种口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定，其特征在于：采用溶液萃取的方法对样品进行萃取，选取QuECHERS试剂对样品进行净化，通过超高效合相色谱串联质谱技术对样品进行测定。本发明的优点在于：前处理步骤较为简单，所使用的有机溶剂较少；测定过程所使用的有机溶剂量也很少，在3min的时间内可以实现多种成分的测定，测定效率高，相对于液相色谱，此方法检出限低，更适合微量成分的测定，是一种较为绿色、高效、准确的口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定方法。

Description

口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定
技术领域
本发明属于烟草制品添加剂理化分析领域，具体是一种适用于口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定。
背景技术
对羟基苯甲酸酯类物质又称为尼泊尔金酯类物质，包括甲酯，乙酯，丙酯等，是一种广谱，高效防腐剂。目前广泛使用于食品，化妆品，家具，纺织等日化领域，甚至在婴儿用品（如咬咬胶）也检测到它的存在。对羟基苯甲酸酯具有酚羟基结构，在pH3-8的范围内均有较好的抑菌作用。在实际应用中，单独使用一种酯的现象较为少见，多为几种酯的混合使用。
以前，研究认为尼泊尔金酯毒性不大，但是，1998年，Routledge等首次发现了尼泊尔金酯具有雌激素活性，这一发现对尼泊尔金酯具有低毒性的观点提出了挑战；在化妆品领域，最新研究表明，含尼泊尔金酯的膏霜作用于皮肤上后，在紫外线的照射下，会加速皮肤老化，因此，目前很多高端化妆品开始使用别的替代品来进行防腐。
不同于日用品，食品中的尼泊尔金酯类物质是直接进入人体内的。如果过多的食入含有尼泊尔金酯的食物，会导致部分没有被体内组织酶水解成代谢产物——对羟基苯甲酸，而直接被吸收储存在人体组织中，从而造成多种疾病之源。
口含烟是无烟气烟草制品的一种，其主体也是烟草，主要通过口腔含服对其进行吸食。这类产品为了保证口感，含水率较卷烟高，有的甚至加入大量的保润剂保持其湿润状态。如果环境温度较高，极易产生霉菌等腐败物质，因此，产品中会加入一定量的防腐成分。我国目前对于此类防腐剂在食品中的限量在10~1500mg/kg范围内（按照不同的对羟基苯甲酸酯进行分类，且以对羟基苯甲酸盐计）。目前各个国家并没有关于口含烟的成分安全监控系统性文件的颁布，对于其潜在的危险成分（如尼泊尔金酯等防腐剂）检测具有一定的指导意义。
关于尼泊尔金酯类物质的检测，有使用气相色谱质谱联用，液相色谱，液相色谱质谱联用等分析技术。GB/T 5009.31-2003即采用气相色谱进行测定，但是只测定两种酯（甲酯和丙酯），还有的采用气相色谱质谱进行测定，在测定前对其进行衍生化处理，操作较为繁琐。液相色谱及液相色谱串联质谱可以实现尼泊尔金酯类物质的准确测定，但是液相色谱测定中需要使用大量的有机溶剂，对操作者和环境的危害较大。合相色谱是2012年由Waters公司推出的全新色谱技术，其主要的流动相为压缩二氧化碳（CO2），与液体流动相或载气相比，降低了成本和毒性，且分析速度快，与质谱检测器串联后，可以实现多种成分的准确测定。采用合相色谱串联质谱对口含烟中的尼泊尔金酯类物质进行测定，目前未见相关报道。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提出的一种适用于口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定，该方法前处理步骤较为简单，所使用的有机溶剂较少；测定过程所使用的有机溶剂量也很少，在3min的时间内可以实现多种成分的测定，测定效率高。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：采用溶液萃取的方法对样品进行萃取，选取QuECHERS试剂对样品进行净化，通过超高效合相色谱串联质谱技术对样品进行测定，具体步骤如下：
（1）准确称取1g口含烟样品至50mL离心管中，加入内标溶液，再加入10mL甲醇，在超声波中超声提取30min，在离心机中以10000转/分钟的速度离心2min；
（2）取离心管中上清液1~1.5mL至含有QuECHERS试剂的离心管中，涡旋混合1~2min，在离心机中以10000转/分钟的速度离心1min，取上清液，经0.22µm尼龙滤膜过滤后，采用超高效合相色谱串联质谱测定；
（3）标准工作溶液配制，用甲醇配制系列标准溶液，浓度分别为50， 100，200，300，500 ng/mL，其中的内标浓度均为100ng/mL；
（4）采用ACQUITY UPC2-MS/MS对样品进行测定，分析条件为：
色谱柱：Waters UPC2 HSS C18 SB，规格2.1mm×100mm,1.7µm；流动相：A：CO2，B：v/v,1:1的异丙醇/甲醇混合溶液；洗脱方式：梯度；流速：1.2-1.5mL/min；柱温：20~40 ˚C；进样体积：1µL；电离方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子；温度：150℃；毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：600 L/h；反吹气流速：50 L/h； MRM模式采集；
MRM参数见表1，梯度洗脱程序见表2：
。
（5）结果计算：根据不同浓度的标准工作溶液的峰面积对内标物峰面积的比值得到标准工作曲线，由标准曲线得到样品对应的浓度与含量。
在本发明中，步骤（2）中的QuECHERS试剂由25mg PSA、7.5mg Carbon、150mg MgSO4构成，其中，MgSO4主要用来除去样品中的水分，因为合相色谱主要流动相为CO2，要求提取液中水分的含量控制在5%以下，对于口含烟这种含水分较高的样品，首先是要除去水分；Carbon主要用来除去提取液中的色素类物质，以防长期进样所造成的柱效下降，峰型变异等现象；PSA主要用来除去甲醇提取液中的其它杂质，降低基质效应对测定所带来的干扰。
采用QuECHERS试剂盒对样品进行一步净化就可以实现水、杂质和色素的同时去除，操作简单，净化效率高。免去了以往需要样品烘干、采用SPE小柱进行净化等繁琐步骤。
步骤（1）中所使用的内标为氘代对羟基苯甲酸甲酯。
所述标准工作溶液的具体配制方法如下：
标准储备液和内标溶液的配置：
准确称取0.05g左右对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯于烧杯中，加入甲醇溶解，转移至50mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为1mg/mL的对羟基苯甲酸酯混合标准储备液（标准溶液I），此溶液在4℃条件下避光保存，保质期为1年。
准确移取100µL标准溶液I至10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为10000ng/mL的标准储备液（标准溶液Ⅱ），此溶液在4℃条件下避光保存，保质期为6个月。
用25mL水溶解2.5mg氘代对羟基苯甲酸甲酯，得到100µg/mL的内标标准储备液，此溶液在4℃条件下避光保存，保质期为6个月。
准确移取1mL内标标准储备液至10mL容量瓶中，用水定容，得到浓度为10000ng/mL的内标标准工作溶液，此溶液在4℃条件下避光保存，保质期为6个月。
由标准储备液配置系列标准溶液（浓度分别为50， 100，200，300，500 ng/mL，其中的内标浓度均为100ng/mL），进行UPC2-MS/MS分析后，计算每个标准溶液中待测物质与内标的峰面积比，标准曲线的线性范围为50~500ng/mL，线性相关系数0.9992~0.9996，分别按信噪比S/N=3和10计算得方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），甲酯、乙酯、丙酯和丁酯定量限和检出限见表3。
选取口含烟样品进行高、中、低3个水平的加标回收率实验，加标量分别为50，100，200ng/mL，每个水平平均测定3次，结果见表4。由表4可得，高中低3个加标水平条件下的回收率范围为94.6~105.6%，结果良好。
取上述口含烟样品进行精密度试验，平行测定6次，计算6次测定的相对平均标准偏差。结果见表5，由表5可得，6次平行测定的RSD为2.14~3.95%，测定结果良好。
本发明的优点在于：前处理步骤较为简单，所使用的有机溶剂较少；测定过程所使用的有机溶剂量也很少，在3min的时间内可以实现多种成分的测定，测定效率高，相对于液相色谱，此方法检出限低，更适合微量成分的测定，是一种较为绿色、高效、准确的口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定方法。
附图说明
图1为本发明中次高级标准溶液（即浓度300ng/ mL）测定的提取离子色谱图。
图2为本发明中实际样品测定的提取离子色谱图。
具体实施方式
实施例：口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定。
1）样品前处理
将袋装口含烟的包装袋剪开，准确称取1g左右的样品至50mL离心管中，加入0.1mL10000ng/mL的内标溶液（氘代对羟基苯甲酸甲酯），再加入10mL甲醇，（最终的内标浓度为100ng/mL），在超声波中超声提取30min，在离心机中以10000转/分钟的速度离心2min。
取离心管中上清液1~1.5mL至含有QuECHERS试剂（25mg PSA、7.5mg Carbon、150mgMgSO4）的离心管中，涡旋混合1~2min，在离心机中以10000转/分钟的速度离心1min，取上清液，经0.22µm尼龙滤膜过滤后，采用超高效合相色谱串联质谱测定。
2）采用ACQUITY UPC2-MS/MS（美国Waters公司）对样品进行测定。分析条件为：色谱柱：Waters UPC2 HSS C18 SB(2.1mm×100mm,1.7µm)；流动相：A：CO2，B：异丙醇甲醇混合溶液（v/v,1:1）；洗脱方式：梯度；流速：1.2~1.5mL/min；柱温：20~40 ˚C；进样体积：1µL；电离方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子；温度：150℃；毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：600 L/h；反吹气流速：50 L/h； MRM模式采集，MRM参数见表1，梯度洗脱程序见表2。
3）标准工作溶液
采用甲醇对标准储备液进行逐级稀释，得到浓度为50，100，200，300，500 ng/mL的标准工作溶液（内标浓度为100ng/mL），此溶液在4℃条件下避光保存，保质期为两周。
4）根据不同浓度的标准溶液的峰面积对内标物峰面积的比值得到标准工作曲线。由标准曲线得到样品对应的浓度与含量。
此例中口含烟样品中对羟基苯甲酸甲酯和乙酯的含量分别为1.07和1.52mg/kg，丙酯和丁酯均为未检出。

Claims (2)

1.一种口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定，其特征在于：采用溶液萃取的方法对样品进行萃取，选取QuECHERS试剂对样品进行净化，通过超高效合相色谱串联质谱技术对样品进行测定，具体步骤如下：
（1）准确称取1g口含烟样品至50mL离心管中，加入内标溶液，再加入10mL甲醇，在超声波中超声提取30min，在离心机中以10000转/分钟的速度离心2min；内标为氘代对羟基苯甲酸甲酯；
（2）取离心管中上清液1~1.5mL至含有QuECHERS试剂的离心管中，涡旋混合1~2min，在离心机中以10000转/分钟的速度离心1min，取上清液，经0.22µm尼龙滤膜过滤后，采用超高效合相色谱串联质谱测定；QuECHERS试剂由25mg PSA、7.5mg Carbon、150mg MgSO4构成；
（3）标准工作溶液配制，用甲醇配制系列标准溶液，浓度分别为50， 100，200，300，500ng/mL，其中的内标浓度均为100ng/mL；
（4）采用ACQUITY UPC2-MS/MS对样品进行测定，分析条件为：
色谱柱：Waters UPC2 HSS C18 SB，规格2.1mm×100mm,1.7µm；流动相：A：CO2，B：v/v,1:1的异丙醇/甲醇混合溶液；洗脱方式：梯度；流速：1.2-1.5mL/min；柱温：20~40 ˚C；进样体积：1µL；电离方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子；温度：150℃；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：600 L/h；反吹气流速：50 L/h； MRM模式采集；
（5）结果计算：根据不同浓度的标准工作溶液的峰面积对内标物峰面积的比值得到标准工作曲线，由标准曲线得到样品对应的浓度与含量。
2.根据权利要求1所述的口含烟中对羟基苯甲酸酯类物质的测定，其特征在于：步骤（4）中MRM参数见表1，梯度洗脱程序见表2：
。
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