CN102955008B - 一种加压毛细管电色谱检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，其特征在于先将样品经乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱净化，0.22μm滤膜过滤后使用，采用加压毛细管电色谱进行分析，以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作检测柱，紫外检测器在270nm处进行检测，流动相为乙腈∶磷酸二氢钠(5mmol/L，pH 6.0)＝30∶70(V/V)。本发明采用液-液萃取的经典样品处理方法结合固相萃取对样品进行预处理，可以有效减少鱼肉组织中杂质的含量和基质干扰；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以减少5种磺胺类药物的保留时间，并且灵敏度得到提高，可以同时分离检测5种磺胺类药物，不仅能满足鳗鱼磺胺类残留量的常规检测，也可用于其它水产品样品中的磺胺类药物的测定。

Description

一种加压毛细管电色谱检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法

技术领域

本发明属于食品安全-兽药残留检测领域，涉及一种采用毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物的分析方法，具体的说是采用毛细管电色谱法同时测定鱼肉中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑五种磺胺类药物的方法。

背景技术

磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。因其具有抗菌谱广、抗球虫和价廉易得等特点，至今仍在兽医临床和畜牧业中广泛应用。磺胺类药物是国家允许限量使用的一类抗菌药物，可被饲料生产者采用。目前，国家农业行业标准《NY 5070无公害食品水产品中鱼药残留限量》中规定，磺胺类药物在水产品组织中的最高残留总量为0.1mg/kg。该药在体内的代谢时间较长，当达到一定浓度时就会对人体的机能产生损害，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血，磺胺二甲基嘧啶等还存在潜在的致癌性。因此，为保护消费者的健康安全，建立灵敏、准确、快速的水产品中磺胺类药物的检测方法是十分紧迫的。

目前磺胺类药物的检测方法主要包括免疫学方法、微生物学法、高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用法、薄层色谱法和毛细管电泳法等。我国农业部颁布的检测方法有“动物源食品中磺胺类药物残留检测方法-高效液相色谱法”、“动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测方法-高效液相色谱法”。这些方法优缺点各异：微生物学法检测速度较快，但检测灵敏度和特异性较差；薄层色谱法灵敏度、选择性较好，但重复性不够好；毛细管电泳最大的不足是其进样量小，限制了灵敏度、无法测定μg/kg级或更低浓度的残留量。液质联用仪虽然检测灵敏度和分辨率很高，但一般实验室很难配置这样的仪器。

加压毛细管电色谱(pCEC)是近几年来兴起的一种微分离技术，它结合了电泳的高效性和高效液相色谱的保留机制，通过在填有HPLC填料的毛细管色谱柱的两端施加高压，提高了样品的分离能力和效率，使以前需很长时间才能出现的峰现在只需很短时间就可出现，并且试剂和样品的消耗量减少，近几年开始也用于兽药残留的分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，能同时测定鳗鱼中多种磺胺类药物残留，具有快速、准确、灵敏度高的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品制备：将鳗鱼肌肉组织样品剪碎后均质，冷冻保存；

2)样品预处理：将样品经乙酸乙酯离心提取，HLB固相萃取柱净化，再经0.20～0.24μm滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用；

3)配制磺胺标准溶液；

4)采用加压毛细管电色谱进行分析：以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用4～6mmol/L，pH 5.5～6.5的磷酸氢二钠溶液与乙腈的混合液，其体积比为80～60∶20～40；在所加电压为9～11kv，柱压为7.5～8MP，柱温为常温，流动相的流速：40～60μL/min；进样量：0.9～1.1μL的工艺条件下，用紫外检测器在波长270nm处进行检测，同时绘制标准曲线；

5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定量分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。

作为改进，所述步骤2)中的乙酸乙酯离心提取的具体过程为：准确称取5±0.01g均质样品置于50mL离心管中，加入4～6g干燥的无水硫酸钠和10～20mL乙酸乙酯，用涡旋混合器充分混匀2～3min，4000～6000r/min离心8～12min，将上清液转移到100mL分液漏斗中，再向原离心管中加入10～15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中，加入10～20mL正己烷，振荡使其充分混合，静置，弃正己烷层，将乙酸乙酯层转移到150mL旋转蒸发瓶，25～35℃真空旋转蒸至无液体残留，用0.8～1.2mL乙腈、1.5～2.5mL体积分数为0.9～1.1％磷酸溶液溶解得到提取液。

作为改进，所述步骤2)中的HLB固相萃取柱净化的具体过程为：用4～6mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用4～6mL去离子水冲洗小柱，转移过多的乙腈，将提取液加到小柱上，保持1.5～2.5mL/min的流速过柱，再依次用4～6mL水、2～4mL体积分数1.8～2.2％乙腈溶液淋洗小柱，最后用5～7mL 95％乙腈水溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用0.9～1.1mL流动相定容。

作为改进，所述磺胺为磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑和磺胺二甲异噁唑五种，所述磺胺标准溶液的配制为：称取各磺胺类标准品10.0mg±0.01g，用乙腈溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液。

再改进，所述磷酸氢二钠溶液为5mmol/L，pH 6.0，所述流动相的配制过程为：取乙腈、重蒸水、50mmol/L磷酸二氢钠按体积比30∶60∶10的比例配制流动相，超声波脱气20～40min。

再改进，所述磺胺标准溶液在检测前需用流动相稀释成0.5～5μg/mL的标准工作液。

进一步优选，所述毛细管电色谱柱选用规格为EP-100-20/45-3-C₁₈，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS。

最后，所述步骤4)的所述电压为10kv，柱压为7.8MP，柱温为常温，流动相的流速：50μL/min；进样量：1.0μL。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

采用液-液萃取的经典样品处理方法结合固相萃取对样品进行预处理，可以有效减少鱼肉组织中杂质的含量和基质干扰；同时采用低毒溶剂乙酸乙酯代替二氯甲烷，减少了实验过程中有机溶剂对操作者和环境的污染；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以减少5种磺胺类药物的保留时间，并且灵敏度得到提高，可以同时分离检测5种磺胺类药物，不仅能满足鳗鱼磺胺类残留量的常规检测，也可用于其它水产品样品中的磺胺类药物的测定。

本发明的分析方法高效、准确，有机试剂消耗少，有较高的灵敏度，可以满足日常检测磺胺类药物的需求。

附图说明

图1是5种磺胺类药物标准品的毛细管电色谱图，加-10kV电压时的出峰顺序图，其中1.磺胺嘧啶2.磺胺间甲氧嘧啶3.磺胺甲噁唑4.磺胺二甲异噁唑5.磺胺喹噁啉；

图2是不加电压的uHPLC图，其中1.磺胺嘧啶2.磺胺二甲异噁唑3.磺胺间甲氧嘧啶4.磺胺甲噁唑5.磺胺喹噁啉；

图3是市售鱼肉样品的检测电色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1 样品制备：将鳗鱼肌肉组织样品，用剪刀剪碎后用高速均质器均质，冷冻保存。

2 样品前处理：

(1)提取：将样品解冻，准确称取5g(精确至0.01g)均质样品置于50mL离心管中，加入5g干燥的无水硫酸钠和15mL乙酸乙酯，用涡旋混合器充分混匀2min，5000r/min离心10min，将上清液转移到100mL分液漏斗中，再向原离心管中加入15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中，加入15mL正己烷，振荡使其充分混合，静置，弃正己烷层，将乙酸乙酯层转移到150mL旋转蒸发瓶，30℃真空旋转蒸至无液体残留，用1mL乙腈、2mL体积分数为1％磷酸溶液溶解。

(2)净化：预先用5mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用5mL超纯水冲洗小柱，转移过多的乙腈。将提取液加到小柱上，保持2mL/min的流速过柱，再依次用5mL水、3mL体积分数2％乙腈溶液淋洗小柱，最后用6mL95％乙腈水溶液洗脱固相萃取小柱，分2mL、2mL、2mL分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用1mL流动相定容，溶液经0.22μm滤膜过滤后，供毛细管电色谱测定。

3 标准溶液的配置：

磺胺标准储备溶液：称取各磺胺类标准品10.0mg(准确至0.1mg)，用乙腈溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液，避光冷藏保存。临用前用流动相稀释成标准工作液。

4 流动相配制及色谱条件：

取乙腈、重蒸水、磷酸二氢钠(50mmol/L)按30∶60∶10(V/V/V)的比例配制流动相，超声波脱气30min后备用。

所用色谱条件：

(1)色谱柱选用规格EP-100-20/45-3-C18，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μmODS柱；

(2)紫外检测：波长270nm；

(3)流动相：乙腈∶磷酸氢二钠(5mmol/L，pH 6.0)＝30∶70(V/V)，

(4)流速：50μL/min；进样量：1μL；

(5)柱压：电压-10kV，柱压为7.8MP，柱温为常温。

5 工作曲线和检出限：

用流动相稀释标准储备溶液为0.5～5μg/mL混合标准工作溶液，按试验条件进行检测，绘制标准曲线。试验表明，5种磺胺在0.5～5μg/mL范围内线性良好，线性回归方程、相关系数及检出限列于表1。

表1  5种磺胺类药物标准工作曲线与检出限

6 回收率和精密度试验：

采用标准添加法对添加样品分别进行加标回收率和精密度试验，以观察方法的准确性和重现性。在空白样品中添加两个不同添加量的磺胺类药物的混合标准溶液，按照方法操作步骤进行回收率实验，同时每个添加浓度平行重复3次，计算回收率和精密度，结果见表2

表2  样品加标平均回收率(n＝3)

从上述结果可知本实验建立的鳗鱼中磺胺类药物多残留分析的固相萃取-毛细管电色谱法，采用液-液萃取的经典样品处理方法结合固相萃取，可以有效减少鱼肉组织中杂质的含量和基质干扰；同时采用低毒溶剂乙酸乙酯代替二氯甲烷，减少了实验过程中有机溶剂对操作者和环境的污染；同时采用5mmol/L磷酸氢二钠-乙腈(30∶70，V/V)为流动相，使得流动相具有一定的缓冲能力，pH不易变化，测定的重现性较好；采用毛细管电色谱进行分析检测，有机试剂消耗少，通过施加外电压，可以减少5种磺胺类药物的保留时间，并且灵敏度得到提高；同时分离检测5种磺胺类药物，不仅能满足鳗鱼磺胺类残留量的常规检测，也可用于其它水产品样品中的磺胺类药物的测定。

在本发明所建立的分析条件下，得到5种磺胺类药物标准品的毛细管电色谱(图1)和不加电压的uHPLC图(图2)及市售鱼肉样品的检测谱图(图3)从这些色谱图的分离效果可见，可以有效解决基质中大部分干扰物质的影响，并且能有效缩短分析时间。

Claims (7)

1.一种加压毛细管电色谱仪检测鳗鱼中磺胺类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品制备：将鳗鱼肌肉组织样品剪碎后均质，冷冻保存；

2)样品预处理：将样品经乙酸乙酯离心提取，HLB固相萃取柱净化，再经0.20～0.24μm滤膜过滤后供毛细管电色谱测定用；

3)配制磺胺标准溶液；所述磺胺为磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑和磺胺二甲异噁唑的五种，所述磺胺标准溶液的配制为：称取各磺胺类标准品10.0mg±0.01g，用乙腈溶解并定容于100ml容量瓶中，配成质量浓度为100mg/L标准储备溶液；

4)采用加压毛细管电色谱进行分析：以反相键和C18为填料的毛细管电色谱柱作为检测柱；流动相采用4～6mmol/L，pH5.5～6.5的磷酸氢二钠溶液与乙腈的混合液，其体积比为80～60∶20～40；在所加电压为9～11kv，柱压为7.5～8MP，柱温为常温，流动相的流速：40～60μL/min；进样量：0.9～1.1μL的工艺条件下，用紫外检测器在波长270nm处进行检测，同时绘制标准曲线；

5)将样品经检测分析后根据其保留时间进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的乙酸乙酯离心提取的具体过程为：准确称取5±0.01g均质样品置于50mL离心管中，加入4～6g干燥的无水硫酸钠和10～20mL乙酸乙酯，用涡旋混合器充分混匀2～3min，4000～6000r/min离心8～12min，将上清液转移到100mL分液漏斗中，再向原离心管中加入10～15mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中，加入10～20mL正己烷，振荡使其充分混合，静置，弃正己烷层，将乙酸乙酯层转移到150mL旋转蒸发瓶，25～35℃真空旋转蒸至无液体残留，用0.8～1.2mL乙腈、1.5～2.5mL体积分数为0.9～1.1％磷酸溶液溶解得到提取液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的HLB固相萃取柱净化的具体过程为：用4～6mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用4～6mL去离子水冲洗小柱，转移过多的乙腈，将提取液加到小柱上，保持1.5～2.5mL/min的流速过柱，再依次用4～6mL水、2～4mL体积分数1.8～2.2％乙腈溶液淋洗小柱，最后用5～7mL95％(体积比)乙腈水溶液洗脱固相萃取小柱，分步洗脱，收集滤液并用氮吹仪吹干，用0.9～1.1mL流动相定容。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸氢二钠溶液为5mmol/L，pH6.0，所述流动相的配制过程为：取乙腈、重蒸水、50mmol/L磷酸二氢钠按体积比30∶60∶10的比例配制流动相，超声波脱气20～40min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述磺胺标准溶液在检测前需用流动相稀释成0.5～5μg/mL的标准工作液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述毛细管电色谱柱选用规格为EP-100-20/45-3-C₁₈，内径100μm，有效柱长20cm，填料粒径3μm ODS。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4)的所加电压为10kv，柱压为7.8MP，柱温为常温，流动相的流速：50μL/min；进样量：1.0μL。