CN114563512A - 一种测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，涉及鱼子酱检测技术领域。本发明通过预溶解、固相萃取等处理技术对鱼子酱进行富集净化，同时加入内标溶液得到鱼子酱待测样品；然后再将待测样品进行液质检测。本发明的净化富集技术能够有效解决鱼子酱油脂含量高、基质复杂、黏性大等不易提取的问题，从而提高检测的准确性和灵敏度。本发明的检测方法可以用于鱼子酱中痕量磺胺类药物残留的定性和定量分析，为鱼子酱质量安全控制、污染物溯源、风险分析提供检测技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及鱼子酱检测技术领域，尤其涉及一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法。
背景技术
鱼子酱(Caviar)由鲟鱼卵腌制而成，富含人体必需氨基酸和不饱和脂肪酸、无机盐、维生素，以及钙、铁和硒等微量元素。鱼子酱与松露、鹅肝酱并称为“世界三大美食”，素有“黑色黄金”之称，是国际上经久不衰的名贵高档食品。近年来，在政府的引导下我国已发展成集鲟鱼产品技术研发、加工、贸易于一体的水产食品加工产业，具备鱼苗繁育、养殖基地、鱼子酱及鲟鱼产品加工和销售的一整套产业链。
然而，随着鱼子酱产业的兴起和发展，对于鱼子酱产品的质量安全标准越来越严格，磺胺类等禁用物质不得检出。这些都成为制约我国鱼子酱出口的新的技术壁垒，使我国鱼子酱出口面临严峻形势。因此，控制禁用物质残留以保障鱼子酱产品质量安全，提高市场竞争力，同时避免类似2011年7月，欧盟以我国鱼子酱中孔雀石绿残留超标为由，禁止鱼子酱进境从而影响中国产鱼子酱声誉的事件再次发生，迫切需要对鱼子酱中禁用物质残留检测技术进行研究。
近年来，国内外关于磺胺类药物及代谢物残留检测方法的研究越来越得到人们的重视，主要基质为鸡蛋、畜禽产品(猪、牛、羊、鸡)、鱼及水产品等。目前，还未有同时测定鱼子酱中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异恶唑和磺胺间甲氧嘧啶等12种磺胺类药物残留的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱分析方法的文献报道。由于鱼子酱黏性较大、油脂较多，直接加入乙酸乙酯提取，鱼子酱会发生结块现象，不易提取。提供一种可以有效的去除鱼子酱中的油脂，便于提取的方法，并且同时测定鱼子酱中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异恶唑和磺胺间甲氧嘧啶等12种磺胺类药物残留的方法是目前所要解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，该法具有简便、灵敏度高、基质干扰小等优点，可用于日常大批量鱼子酱样品中磺胺类药物及其代谢物残留的定性、定量分析。
本发明提供的固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，包括以下步骤：
(1)取鱼子酱样品，用组织粉碎机充分捣碎均匀，装入样品袋中密封，在-18℃冷冻保存；
(2)在鱼子酱样品中加入混合内标溶液和正己烷，超声溶解后再加入乙酸乙酯进行振荡提取，离心后收集上清液；在离心后的固体中加入乙酸乙酯进行再次提取，收集上清液；合并两次的上清液，将上清液采用氮气进行吹干，去除溶剂，然后再加水溶解制成待净化溶液；
(3)将待净化溶液利用MCX固相萃取小柱进行净化，采用体积比为1:1的甲醇-水进行淋洗，采用氨水甲醇混合溶液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液采用氮气进行吹干，然后再用甲酸、甲醇水的混合溶液进行溶解，过滤得到富集纯化后的待测样品；
(4)将待测样品采用高效液相色谱串联质谱法进行定性和定量检测。
本申请所述多种磺胺类药物包括12种磺胺类药物，分别为：磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲基异恶唑、磺胺喹噁啉和磺胺二甲氧嘧啶。
优选的，步骤(2)所述鱼子酱样品与混合内标溶液的质量体积比为1:0.01g/mL，所述混合内标溶液的浓度为100ng/mL；
所述鱼子酱样品与正己烷的质量体积比为1:2g/mL。
优选的，氨水甲醇中氨水的体积浓度为5％。
优选的，步骤(3)所述甲酸、甲醇和水混合溶液中甲醇和水的体积比为2:8，混合溶液中甲酸的浓度为0.15wt％。
优选的，步骤(3)所述MCX固相萃取小柱的规格为500mg/6mL，使用前依次用5mL甲醇，5mL水进行活化。
优选的，步骤(4)所述高效液相色谱梯度洗脱采用InertSustain Swift C18色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm。
优选的，步骤(4)所述高效液相色谱梯度洗脱的流动相A为体积浓度0.15％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速0.4mL/min；进样量20uL。
优选的，步骤(4)所述质谱分析的的条件为：电喷雾离子化源，正离子扫描模式；检测方式为多反应监测；干燥气温度为325℃；干燥气流量为5L/min；喷雾气压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为12L/min；毛细管电压为4000V。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用正己烷预溶解，乙酸乙酯提取2次，MCX固相萃取小柱净化等前处理方法提取净化，高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定鱼子酱中痕量磺胺类类药物残留量，可以有效的解决鱼子酱黏性大，不易提取的缺点。结果表明，本方法具有简便、灵敏、准确的优点，可以用于鱼子酱中痕量磺胺类药物残留的定性和定量分析，为鱼子酱质量安全控制、污染物溯源、风险分析提供检测技术支持。
附图说明
图1为混合标准溶液的总离子流图；
图2为磺胺噻唑(6.832min)标准溶液选择离子色谱图；
图3为磺胺嘧啶(6.996min)标准溶液选择离子色谱图；
图4为磺胺吡啶(7.198min)标准溶液选择离子色谱图；
图5为磺胺甲基嘧啶(7.724min)标准溶液选择离子色谱图；
图6为磺胺甲噻二唑(8.110min)标准溶液选择离子色谱图；
图7为磺胺二甲基嘧啶(8.257min)标准溶液选择离子色谱图；
图8为磺胺间甲氧嘧啶(8.523min)标准溶液选择离子色谱图；
图9为磺胺邻二甲氧嘧啶(9.937min)标准溶液选择离子色谱图；
图10为磺胺甲恶唑(10.116min)标准溶液选择离子色谱图；
图11为磺胺二甲基异恶唑(10.501min)标准溶液选择离子色谱图；
图12为磺胺喹噁啉(11.452min)标准溶液选择离子色谱图；
图13为磺胺二甲氧嘧啶(11.478min)标准溶液选择离子色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，步骤如下：
(1)取衢州鲟龙水产食品科技开发有限公司生产的，批号为20210930的鱼子酱样品，用组织粉碎机充分捣碎均匀，装入样品袋中密封，在-18℃冷冻保存；
(2)取5.0g步骤(1)保存的鱼子酱样品置于50mL带盖离心管中，加入0.05mL混合内标溶液和5mL正己烷，采用涡旋超声溶解后，加入10mL乙酸乙酯涡旋振荡提取，6000r/min离心5min，取上清液，再次加入5mL乙酸乙酯提取一次，合并两次的提取液，在45℃的温度下用氮吹仪吹干，加5ml水溶解残渣得到待净化溶液；
(3)将待净化溶液转移规格为500mg/6mL的MCX固相萃取小柱中，使用前依次用5mL甲醇，5mL水活化；用10mL蒸馏水分两次洗涤离心管并转移至所述固相萃取小柱，弃去流出液，再用5mL体积比为1:1的甲醇-水淋洗，抽干，然后用8mL体积浓度为5％的氨水甲醇洗脱，收集全部洗脱液，在45℃以下水浴中氮吹干，用1.0mL含0.15wt％甲酸的体积比为2:8的甲醇-水溶液溶解，混匀后经0.45μm有机相滤膜过滤后得到待测样品；
(4)高效液相色谱梯度洗脱，
色谱柱：InertSustain Swift C18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相A为0.15％甲酸水溶液，B为乙腈，流速0.4mL/min；进样量20uL。梯度洗脱程序见表1：
表1
| 时间/min | 0.15％甲酸水溶液/％ | 乙腈/％ |
| 0.00 | 75.0 | 25.0 |
| 6.00 | 55.0 | 45.0 |
| 9.00 | 15.0 | 85.0 |
| 9.10 | 75.0 | 25.0 |
| 18.00 | 75.0 | 25.0 |
(5)质谱分析，质谱条件为：电喷雾离子化源(ESI)，正离子扫描模式；检测方式为多反应监测(MRM)；干燥气温度(Gas Temp)为325℃；干燥气流量(Gas Flow)为5L/min；喷雾气压力(Nebulizer)为45psi；鞘气温度(Sheath Gas Temp)为350℃；鞘气流速(Sheath GasFlow)为12L/min；毛细管电压(Capillary)为4000V，采集参数见表2，表2中*表示定量离子。
表2
基质效应：
取鱼子酱样品配制基质标准工作溶液，采用基质标准工作溶液响应值(A)与同质量浓度溶剂标样(0.15wt％甲酸的体积比为2:8的甲醇-水溶液为介质配制的标准工作溶液)响应值(B)的比值(Matrix effect)进行评价基质效应，其计算公式为Matrix effect(ME)＝A/B×100。当标准工作液浓度为5.0ng/mL时，磺胺噻唑，磺胺嘧啶，磺胺邻二甲氧嘧啶，磺胺喹噁啉，磺胺甲噻二唑，磺胺甲恶唑，磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲基异恶唑，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺吡啶，磺胺间甲氧嘧啶的质效应分别为ME(磺胺噻唑)＝44.4％，ME(磺胺嘧啶)＝66.3％，ME(磺胺邻二甲氧嘧啶)＝42.6％，ME(磺胺喹噁啉)＝32.3％，ME(磺胺甲噻二唑)＝49.4％，ME(磺胺甲恶唑)＝30.4％，ME(磺胺甲基嘧啶)＝79.7％，ME(磺胺二甲基异恶唑)＝32.9％，ME(磺胺二甲氧嘧啶)＝18.6％，ME(磺胺邻二甲基嘧啶)＝66.6％，ME(磺胺吡啶)＝56.4％，ME(磺胺间甲氧嘧啶)＝68.1％。
从实验结果可以看出，鱼子酱基质对磺胺噻唑，磺胺嘧啶，磺胺邻二甲氧嘧啶，磺胺喹噁啉，磺胺甲噻二唑，磺胺甲恶唑，磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲基异恶唑，磺胺二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺吡啶，磺胺间甲氧嘧啶12种化合物均表现出较强的基质抑制效应，为消除基质效应带来的影响，本发明采用同位素内标以及空白基质提取液配制标准曲线的溶液等方法来降低基质效应的影响。
分别称取适量12种磺胺类药物标准品用甲醇配制成1000μg/mL的标准储备溶液，储存于-20℃冰箱中。
取适量各标准储备溶液，用甲醇稀释成100ng/ml的混合标准中间溶液。
取适量混合标准中间溶液用流动相逐级稀释配制成浓度为1.0、2.0、5.0、10、20ng/ml的混合标准工作溶液，其中同位素内标溶液浓度均为5.0ng/ml。
分别吸取不同浓度的混合标准工作溶液，配制标准曲线溶液，按建立好的方法进行分析，以各目标分析物与内标的浓度比X为横坐标，以目标分析物与内标的峰面积比Y为纵坐标，进行回归分析，得到本方法的线性范围，线性方程及相关系数如表3所示，从表3可以看出，在1.0～20ng/mL范围内，12种磺胺素类药物均呈现出良好的线性关系(相关系数r≥0.99)。
在阴性鱼子酱样品中加标测定，3倍信噪比对应的加标水平为方法的检出限，10倍为定量限，得到的检出限和定量限结果如表3。
表3
质谱条件的优化：
分别取1.0mg/L混合标准工作溶液及其同位素内标溶液，采用流动注射进样的方式，以30μL/min分别对其母离子扫描得到分子离子峰，再对其进行子离子扫描得到碎片离子信息。优化各项质谱参数，使母离子与选取的子离子强度达到最大。多种磺胺类药物及其代谢物多反应监测质谱参数见表2，混合标准溶液的总离子流图见图1，磺胺类药物标准溶液选择离子色谱图见图2-13。
图1中，峰1：磺胺噻唑(6.832min)；峰2：磺胺嘧啶(6.996min)；峰3：磺胺吡啶(7.198min)；峰4：磺胺甲基嘧啶(7.724min)；峰5：磺胺甲噻二唑(8.110min)；峰6：磺胺二甲基嘧啶(8.295min)；峰7：磺胺间甲氧嘧啶(8.523min)；峰8：磺胺邻二甲氧嘧啶(9.937min)；峰9：磺胺甲恶唑(10.116min)；峰10：磺胺二甲基异恶唑(10.501min)；峰11：磺胺喹噁啉(11.452min)；峰12：磺胺二甲氧嘧啶(11.478min)。
回收率和精密度：
选取阴性鱼子酱样品，分别在1.0、2.0和5.0μg/kg 3个水平下进行加标试验，阴性鱼子酱样品的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)结果如表4。
表4
从表4可以看出，鱼子酱中12种药物残留的平均回收率在72.9％～119％之间，相对标准偏差在1.0％～11％之间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取鱼子酱样品，用组织粉碎机充分捣碎均匀，装入样品袋中密封，在-18℃冷冻保存；
(2)在鱼子酱样品中加入混合内标溶液和正己烷，超声溶解后再加入乙酸乙酯进行振荡提取，离心后收集上清液；在离心后的固体中加入乙酸乙酯进行再次提取，收集上清液；合并两次的上清液，将上清液采用氮气进行吹干，去除溶剂，然后再加水溶解制成待净化溶液；
(3)将待净化溶液利用MCX固相萃取小柱进行净化，采用体积比为1:1的甲醇-水进行淋洗，采用氨水甲醇混合溶液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液采用氮气进行吹干，然后再用甲酸、甲醇水的混合溶液进行溶解，过滤得到富集纯化后的待测样品；
(4)将待测样品采用高效液相色谱串联质谱法进行定性和定量检测。
2.根据权利要求1所述测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤(2)所述鱼子酱样品与混合内标溶液的质量体积比为1:0.01g/mL，所述混合内标工作溶液的浓度为100ng/mL；
所述鱼子酱样品与正己烷的质量体积比为1:2g/mL。
3.根据权利要求1所述固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，氨水甲醇中氨水的体积浓度为5％。
4.根据权利要求1所述固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤(3)所述甲酸、甲醇和水混合溶液中甲醇和水的体积比为2:8，混合溶液中甲酸的浓度为0.15wt％。
5.根据权利要求1所述测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤(3)所述MCX固相萃取小柱的规格为500mg/6mL，使用前依次用5mL甲醇，5mL水进行活化。
6.根据权利要求1所述测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤(4)所述高效液相色谱梯度洗脱采用InertSustain Swift C18色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm。
7.根据权利要求1所述测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤(4)所述高效液相色谱梯度洗脱的流动相A为体积浓度0.15％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速0.4mL/min；进样量20uL。
8.根据权利要求1所述测定鱼子酱中多种磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤(4)所述质谱分析的的条件为：电喷雾离子化源，正离子扫描模式；检测方式为多反应监测；干燥气温度为325℃；干燥气流量为5L/min；喷雾气压力为45psi；鞘气温度为350℃；鞘气流速为12L/min；毛细管电压为4000V。
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