CN104597165A - 一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明建立了一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的检测方法，其采用Q-Orbitrap高分辨质谱仪，通过Full MS scan/dd–MS²(Top N)扫描模式，正负离子同时检测，在一个分析周期完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级质谱扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息；通过比较样品与减肥类化学成分对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱，确定样品中是否掺杂了减肥类化学药物，并对潜在的阳性样品进行快速筛查、确证和定量。本发明具有灵敏度高、选择性好、确证性强、操作简单快捷等优势，能够进行准确无误的筛查，具有传统HPLC和低分辨LC-MS无可比拟的灵敏度，并能够在单个分析周期(12分钟)内鉴定、确证和定量分析化合物。

Description

一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种药品、保健食品或食品的分析技术领域，特别是涉及一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法。

背景技术

近年来，中成药保健食品中非法添加化学药物已成为一种普遍现象，一些不法厂商为片面追求治疗效果，获取经济暴利，擅自在中草药和保健食品中非法添加化学药物。咖啡因、呋塞米、酚酞、盐酸西布曲明、盐酸芬氟拉明等药物为减肥类产品的常用非法添加物，均有一定的不良反应，如滥用或使用不当会导致不良后果。中药及纯天然保健食品长期以来深受广大患者的喜爱，然而目前有些减肥类中药制剂及保健食品的生产厂家受利益驱动，在中药制剂和保健品中非法掺入减肥类化学药，使其符合广告所宣传的治疗效果以促进销售，由于处方中没有标明添加化学药物的种类及剂量，如使用不当，将对服用者的健康和生命造成威害。为有效打击这种制假掺伪的不法行为，有必要建立快速、专属的方法鉴定中药制剂及保健食品中非法掺入的此类药物。由于中药制剂及保健食品成分复杂，建立和完善非法添加药物检测方法也成为药物分析界的热点之一。被研究和报道的非法药物检测方法中，以HPLC和低分辨LC-MS(四级杆，离子阱)为主要技术手段。但目前的HPLC和低分辨LC-MS法存在着灵敏度低、选择性差、定性能力弱、确证性不够强等缺点，不能实现100％的筛查正确率，在日常非法添加检测时有时会出现假阳性和假阴性样品，造成检验工作错判漏判等失误。

因此，人们仍然需要一种操作更简单、速度更快且更安全、污染更小抗干扰能力更强的检验方法，以便于准确快速的鉴别出减肥类中成药、保健食品和食品中是否添加非法添加物。Orbitrap高分辨质谱仪(Orbitrap HRMS)是最新的高分辨质谱技术，分辨率最高可达1 000 000以上，质量精度可达0.1-1ppm。Orbitrap HRMS通过革新性的新质谱技术，可进行高精度的目标物或非目标物的筛选，同时提供大范围的定性和定量分析。然而，Orbitrap HRMS的强大的定性定量潜力却未见用于减肥类中成药和保健食品中的非法添加检测。

发明内容

本发明提供了一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法，该检测方法高灵敏度、高选择性、定性能力强，可用于减肥类中成药和保健食品中非法添加物的快速鉴定、确证和定量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采用Q-Orbitrap高分辨质谱仪，通过Full MS scan/dd–MS²(Top N)扫描模式，正负离子同时检测，在一个分析周期12分钟内完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级质谱扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息；

2)通过比较样品与减肥类化学成分对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱，确定样品中是否掺杂了减肥类化学药物，并对潜在的阳性样品进行定量分析；所述减肥类化学成分对照品为咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明。

3)将得到的实验数据以Exact Finder 1.0软件进行快速筛查、确证和定量。

更进一步优选的，所述高分辨质谱仪的质谱条件色谱条件为：

流动相：含0.1％冰醋酸的10mmol·L^-1的NH₄AC(A)–甲醇(B)，梯度洗脱(0～0.5min，20％B；0.5～6.5min，20％～85％B；6.5～9.0min，85％B；9.1～12min，20％B)；流速：300μL/min；柱温：30℃；自动进样器控温：20℃；进样量：5μL。

所述高分辨质谱仪的质谱条件：

Full MS scan/dd–MS²(Top N)扫描模式，正负离子同时检测；一级质谱扫描分辨率70000FWHM，二级质谱扫描分辨率17500FWHM；full MS一级全扫描范围为m/z 100-500，自动增益控制AGC、最大注入时间IT分别设为1.0e⁶和100ms；dd–MS²数据依赖的二级扫描AGC设为2.0e⁵，最大IT设为50ms，分离窗口isolation window设为1.0m/z，underfill ratio设为1.0％，强度阈值intensity threshold设为4.0e⁴，同位素排除exclude isotopes设为"on"，动态排除dynamic exclusion设为10.0s。

不论什么样的减肥药，都是通过以下3种途径来实现减肥的：①抑制大脑的食欲中枢，降低食欲，使肥胖者减少进食量，从而减少热量的摄入。②刺激新陈代谢，增加机体耗氧量和脂肪、糖的氧化，以减少脂肪在体内的堆积。③刺激肠道，使营养吸收减少，排泄增多增快。因此相应的有以下类型的减肥药：食欲抑制剂、中枢兴奋剂、泻药、利尿剂等。本发明选择最常见的5种非法添加药物(咖啡因、呋塞米、酚酞、盐酸芬氟拉明和盐酸西布曲明)进行研究，其中，咖啡因属于中枢兴奋剂，呋塞米属利尿剂；酚酞属泻药类，盐酸芬氟拉明和盐酸西布曲明属食欲抑制药。虽然减肥药的种类很多，但这样一种分布状况基本上代表了减肥药物的类型“散布”状况，所以建立检测方法能满足检测非法添加药物的要求。

中药制剂及保健食品成分一般均较复杂，应用高效液相色谱法鉴定时干扰大，不易将多种待测成分均与干扰峰分离，而采用Q-Orbitrap高分辨质谱仪鉴定时，凭借其超高质谱分辨率，可以得到待测成分的一级质谱分子离子准确质量数(可精确至±5ppm)，从而排除了干扰组分的影响；如果待测成分的一级质谱分子离子的准确质量数恰好与干扰成分相同，则利用准确二级碎片离子来排除干扰，提高专属性。本发明具有灵敏度高、选择性好和确证性强等优势，能够进行准确无误的筛查，具有传统HPLC和低分辨LC-MS无可比拟的专属性和灵敏度，而且操作简单快捷，可以应用于打击减肥类中成药及保健食品中非法添加物的日常食品药品监管行动。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

附图1为本发明的对照品提取离子色谱图；

附图2为本发明的对照品一级质谱图；

附图3为本发明的对照品二级质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例：

1实验材料

1.1仪器与试药

UHPLC–Q–Orbitrap超高效液相色谱–质谱联用系统，包括Accela 1250LC泵和自动进样器、Q Exactive^TM质谱部分(Thermo Fisher Scientific,Germany)。XCalibur 2.2软件(ThermoFisher Scientific，MA，USA)软件用以仪器控制和数据处理；Q Exactive 2.1软件(Thermo FisherScientific，MA，USA)用于控制质谱仪。色谱柱为Hypersil GOLD aQ C₁₈column(100mm×2.1mm，1.9μm)(Thermo Fisher Scientific，USA)。KQ–300GDV温控超声仪(昆山，中国)。色谱纯甲醇、乙酸、乙酸铵均购自TEDIA公司(USA)，超纯水(18.2MΩ)由Milli–Q AdvantageA10超纯水系统制得。

对照品：咖啡因，批号171215-201211，含量99.9％；呋塞米，批号100544-201102，含量99.7％；酚酞，批号100091-199601，含量100％；盐酸芬氟拉明，批号100073-200002，含量100％；盐酸西布曲明，批号100624-200401，含量100％。均购自中国食品药品检定研究院。

样品：27批减肥类中成药和保健食品来源于山东省食品药品监督管理局及各地市食品药品监督管理局。

1.2色谱条件与质谱条件

流动相:含0.1％冰醋酸的10mmol·L^-1的NH₄AC(A)–甲醇(B),梯度洗脱(0～0.5min，20％B；0.5～6.5min，20％～85％B；6.5～9.0min，85％B；9.1～12min，20％B)；流速:300μL/min；柱温:30℃；自动进样器控温：20℃；进样量:5μL。理论塔板数按咖啡因计算不应低于10000。

Q Exactive^TM质谱系统配有HESI源，喷雾电压为3.0KV，毛细管温度和雾化器分别为350℃和250℃。鞘气和辅助气分别设为40和15psi，S–lens RF电压为50V。喷雾气和碰撞气均为氮气。使用校正溶液(含咖啡因、四肽MRFA和Ultramark 1621的混合溶液)三天校正一次质量轴。正负离子同时扫描，扫描方式采用full MS/dd–MS²模式，此模式包含一次一级全扫描(分辨率70 000FWHM)和一次数据依赖的二级扫描(分辨率17500FWHM)两个事件。full MS一级全扫描范围为m/z 100-400，自动增益控制AGC、最大注入时间IT分别设为1.0e⁶和100ms；dd–MS²数据依赖的二级扫描AGC设为2.0e⁵,最大IT设为50ms,分离窗口isolation window设为1.0m/z,underfill ratio设为1.0％,强度阈值intensity threshold设为4.0e⁴,同位素排除excludeisotopes设为"on",动态排除dynamic exclusion设为10.0s。

1.3溶液配制

1.3.1系列浓度混合对照品溶液

精密称取咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明适量置于25ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液，浓度为400μg·mL^-1。精密吸取上述储备液1.0mL于100mL量瓶中，加甲醇定容，得到10.0μg·mL^-1的混合对照品储备液。同法逐步稀释，得到1.0，5.0，20，100，500ng·mL^-1的系列浓度混合对照品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备

若供试品为固体制剂，研细后，精密称取细粉约相当于一次服用量；若供试品为液体制剂，精密量取一次服用量，置50mL量瓶中，加甲醇适量，20℃恒温超声15分钟，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。若供试品溶液浓度超出线性范围，则精密量取供试品溶液适量以初始流动相稀释至合适的浓度。

2结果

2.1方法的建立

对照品中咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明的提取离子色谱图如图1所示，由图中可以观察到五种化合物均实现了良好的色谱分离。化合物理论质量数与实际测得的质量数相对偏差越小，筛查结果的可信程度越高。五种分析物的实测质量数和理论质量数偏差均小于5ppm，显示了Orbitrap HRMS高度可靠的质量精度。我们将保留时间和一级质谱准确质量数作为鉴定依据，用于中成药和保健食品中非法添加物的快速筛查。对每种化合物的最佳归一化碰撞能量(NCE)进行优化，得到其二级碎片离子。图2给出五种减肥类化合物的二级质谱图。我们将二级碎片离子作为诊断离子，用以进一步确证化合物的存在。

2.2方法学验证

检出限：逐级稀释对照品溶液，按最低3倍信噪比(S/N≥3)计算检出限。呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明的检出限为0.1ng·mL^-1，咖啡因的检出限为0.5ng·mL^-1，表明了本方法具有很高的灵敏度，可实现对中成药和保健食品中减肥类非法添加物的痕量检测。

标准曲线：精密吸取系列浓度混合对照品溶液5μL进样，每个浓度进样3次，测定峰面积，取平均值。以峰面积Y为纵坐标，以对照品浓度X(ng·mL^-1)为横坐标做线性回归分析，求算得相关系数r²均大于0.9988，显示了良好的线性关系。

准确度与精密度：准确度以浓度实测值和真实值比值的百分比来表示，精密度以浓度实测值的相对标准偏差(RSD)来表示。咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明的日内和日间准确度分别在97.3～103.1％和95.6～104.8％之间，日内和日间精密度分别在0.96～2.8％和1.3～4.9％之间，结果令人满意。

回收率：本方法采用甲醇作为提取溶剂，五种化合物的的提取回收率均≥91.2％，表明甲醇对咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明具有良好的提取效率。

2.3方法的应用

将得到的实验数据以Exact Finder 1.0软件进行快速筛查、确证和定量。在ScreeningMethod中定义目标化合物数据库、定义目标识别或确认设置。我们以化合物保留时间和一级准确质量数作为鉴定依据，以二级碎片离子作为确认依据。样品与对照品中分析物的准确质量数偏差应≤5ppm，峰阈值、S/N信噪比阈值、诊断碎片离子数目分别设为50000、5和2，保留时间窗口设置为10s。在Quan Method中定义目标化合物类型、校正曲线计算选项、校正水平、质控水平。

在27种减肥类中成药和保健食品中共检出18批阳性样品，不符合率高达66.7％。其中，检出呋塞米样品1批，检出盐酸西布曲明样品6批，检出酚酞样品4批，同时检出咖啡因和盐酸西布曲明的样品2批，同时检出酚酞和盐酸西布曲明的样品5批。检出的非法添加物浓度很高(全部>10mg·g^-1)，会对消费者的身体健康造成严重危害。Q–Orbitrap高分辨质谱法具有快速、准确、高灵敏度、高选择性的特点，为打击日益猖獗的非法添加行为提供了新工具、新技术。

Claims (2)

1.一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法，其特征在

于包括以下步骤：

1)采用Q-Orbitrap高分辨质谱仪，通过Full MS scan/dd–MS²(Top N)扫描模式，正负离子同时检测，在一个分析周期12分钟内完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级质谱扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息；

2)通过比较样品与减肥类化学成分对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱，确定样品中是否掺杂了减肥类化学药物，并对潜在的阳性样品进行定量分析；所述减肥类化学成分对照品为咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明。

3)将得到的实验数据以Exact Finder 1.0软件进行快速筛查、确证和定量。

2.根据权利要求1所述的减肥类中成药和保健食品中非法添加物的检测方法，其特征在于，所述高分辨质谱仪的质谱条件色谱条件为：

流动相：含0.1％冰醋酸的10mmol·L^-1的NH₄AC(A)–甲醇(B)，梯度洗脱(0～0.5min，20％B；0.5～6.5min，20％～85％B；6.5～9.0min，85％B；9.1～12min，20％B)；流速：300μL/min；柱温：30℃；自动进样器控温：20℃；进样量：5μL；

所述高分辨质谱仪的质谱条件：

Full MS scan/dd–MS²(Top N)扫描模式，正负离子同时检测；一级质谱扫描分辨率70000FWHM，二级质谱扫描分辨率17500FWHM；full MS一级全扫描范围为m/z 100-500，自动增益控制AGC、最大注入时间IT分别设为1.0e⁶和100ms；dd–MS²数据依赖的二级扫描AGC设为2.0e⁵，最大IT设为50ms，分离窗口isolation window设为1.0m/z，underfill ratio设为1.0％，强度阈值intensity threshold设为4.0e⁴，同位素排除exclude isotopes设为"on"，动态排除dynamic exclusion设为10.0s。