CN111289670A - 一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种减肥类中成药及食品中N‑丁基‑3‑(三氟甲基)‑α‑甲基苯乙胺）的检测方法，采用超高效液相色谱‑二极管阵列检测器‑线性离子阱质谱法进行定性确证，超高效液相色谱‑质谱法定量测定。色谱条件：色谱柱：C18色谱柱；检测器：二极管阵列检测器、线性离子阱质谱仪；流动相：A‑0.1%甲酸溶液、B‑0.1%甲酸‑甲醇；流速：0.2‑0.6 mL/min；柱温：25‑40℃；进样量：0.1‑10μL；洗脱梯度程序：0‑1min，30%B；10‑10.2min，75%‑95%B；12‑12.2min，95%‑30%B。本发明方法可特异、快速地筛查并确证减肥类中成药和食品中添加的N‑丁基‑3‑(三氟甲基)‑α‑甲基苯乙胺，主要适用于减肥类中成药及食品的分析。
Description
技术领域
本发明属于化学分析领域，涉及化学物质的色谱、质谱联用检测方法，具体涉及一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的分析方法。
背景技术
芬氟拉明(N-乙基-α-甲基-3-三氟甲基苯乙胺)是一种苯丙胺类食欲抑制药，具有一定的中枢兴奋作用，能加强周围组织对葡萄糖的利用而降低血糖；还有降低胆固醇、三酰甘油、血浆总脂质的作用。所以，临床上常用于单纯性肥胖及伴有糖尿病、高血压、焦虑症、心血管疾病的肥胖患者。近年来，该药被不法商家添加进减肥类中成药或保健食品中，这种行为已违反了国家法律。目前，国家法定检验标准(国家药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件编号:2006004、食品中西布曲明等化合物的测定BJS 201701)都已收载了芬氟拉明的检测方法，为禁用成分。
N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺(CAS号：52742-18-4，分子式：C14H20F3N，分子量： 259.1547)为芬氟拉明的修饰物(结构式见下)，其与芬氟拉明具有相同的结构骨架，因而具有一定的减肥作用。不法分子为了躲避监管，往减肥中成药或食品中添加这种物质以达到增加销量，逃脱法律制裁的目的。日前在市售减肥类中成药中发现有添加这种成分，但尚无此物质的检验方法，本发明建立N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的快速筛查、定量方法，以填补监管漏洞。
a:N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺b:芬氟拉明
发明内容
本发明的目的是提供一种针对减肥类中成药和食品中添加N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检验方法，该方法的原理为：将供试品用甲醇提取稀释，C18色谱柱分离，经紫外光谱检测器和线性离子阱质谱仪检测，采集化合物的紫外吸收光谱，一级质谱离子、二级主要碎片离子进行定性确证，并采用MRM模式建立外标方法测定含量。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，包括以下步骤：
(1)测定条件：
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱，100mm/50mm×2.1mm，1.7μm/1.8μm；检测器：二极管阵列检测器、线性离子阱质谱仪；流动相：A-0.1％甲酸溶液、B-0.1％甲酸-甲醇；流速：0.2-0.6mL/min；柱温：25-40℃；进样量：0.1-10μL；洗脱梯度程序：0-1min，30％B；10-10.2min，75％-95％B； 12-12.2min，95％-30％B；紫外检测波长：200-400nm；
质谱条件：
离子源：ESI+；脱溶剂温度(℃)：550；离子化电压(V)：5500；喷雾气(psi)：55；辅助加热气(psi)：55；采集模式：MRM，MS2；气帘气：25；碰撞气：Medium；
化合物离子对参数：
注：*定量离子对
(2)精密称量N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品约10mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，作为对照品溶液一；再移取适量，用甲醇逐级稀释，配成浓度约为10ng/mL的对照品溶液二。
(3)将供试品制成细粉(胶囊剂倾取内容物，片剂及固体食品研细)，混合均匀，精密称取适量(固体中成药取用量为一次服用量，固体食品称取1g，液体样品直接移取1mL)，置于100mL容量瓶中，加甲醇70mL，涡旋1min，室温水浴超声提取30min，静置，加甲醇定容至刻度，混匀，13000r/min离心5min，移取上清液，进样，测定。
(4)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-线性离子阱质谱法进行定性筛查，分别取空白溶液、供试品溶液和对照品溶液一，注入液质联用仪，采集色谱图，比对供试品与对照品的色谱峰保留时间及紫外吸收光谱，如果均一致，则将供试品溶液适当稀释，与空白溶液和对照品溶液二，注入液质联用仪，采集质谱图，比对一、二级质谱特征。
结果判断：
供试品色谱图中，如果出现与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品保留时间一致的色谱峰，紫外吸收光谱都一致，且其质谱一级母离子，二级主要子离子质量数均相同，主要子离子的相对丰度比接近(满足下表1规定值)，则确定添加了N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺，则利用MRM模式建立标准曲线进行含量测定。
如果未出现与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品保留时间一致的色谱峰，或者出现了与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品保留时间一致的色谱峰，但是不能同时满足紫外吸收光谱一致，质谱一级母离子，二级主要子离子质量数相同，主要子离子的相对丰度比接近(满足下表1规定值)的要求，则确定样品中没有添加N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺，计算其检出浓度。
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
| 相对离子丰度(％) | k>50％ | 50％≥k>20％ | 20％≥k>10％ | k≤10％ |
| 允许的最大偏差(％) | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
检出浓度：
按下表2中检出限，当称样量为1g(mL)，稀释倍数为100时，检出浓度为：0.4μg/kg(L)。
含量测定：
线性范围：
移取上述对照品溶液一，加甲醇稀释配制成最终浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、 50.0ng/mL的系列标准溶液，进样，采集质谱数据，以MRM定量离子对峰面积(Y)对浓度 (X)进行线性拟合，计算线性方程和相关系数(见表2)。结果显示在0.1-50ng/mL范围内，线性关系良好(r>0.999)。
检出限：
取浓度为0.1ng/mL对照品溶液用阴性样品提取液稀释10倍后进样测定，计算3倍信噪比时对应的浓度作为检出限，结果见表1。
表2 N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的线性范围、线性方程、相关系数、检出限
准确度和精密度：
以检测结果阴性的样品为基质，进行加标回收率测定。称取某阴性样品一次服用剂量置于100mL容量瓶中，分别加入N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照溶液(将对照品溶液一稀释成100ng/mL)1、5、10mL，各平行3份，加甲醇70mL，余下按步骤(3)中供试品溶液的制备，进样，测定，与相应浓度的对照品溶液比较，计算回收率(见表3)。
精密度测定以浓度为10ng/mL的对照品溶液，连续进样6次，测定，计算待测物的色谱保留时间和定量离子对峰面积，计算其均值和相对标准偏差(RSD)，结果可见精密度良好(见表4)。
表3 N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的回收率(n＝3)
| 浓度(ng/ml) | 平均回收率(％) | RSD(％) |
| 1 | 116.2 | 3.9 |
| 5 | 104.1 | 1.9 |
| 10 | 108.7 | 2.3 |
表4 N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的精密度(n＝6)
稳定性：
取浓度为10ng/mL的对照品溶液置于自动进样器中(15℃)，分别于0、2、4、8、12、24小时进样测定，计算组分的响应值，结果显示稳定性良好。
进一步的，所述色谱柱为Waters ACQUITY
HSS T3,100mm×2.1mm，1.8μm。
进一步的，所述步骤(3)中供试品为固体或液体剂型的中成药及食品。
进一步的，所述供试品为固体型的中成药或食品的，取用时研至粒径≤180μm，所述供试品为中成药胶囊剂的，取用时倾取内容物。
有益效果：
1.本发明方法可准确鉴定减肥类中成药和食品中添加的N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺；
2.本发明方法主要适用于固体和液体剂型的中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的测定；
3.N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺为制作减肥类中成药及食品中可能添加的化学物质，这种物质尚没有检测手段，通过本方法可以准确筛查，确证，为监管提供有力技术支撑。
附图说明：
图1为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为100μg/mL)的 215nm色谱图(a：N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺，下同)。
图2为实施例中供试品溶液的215nm色谱图。
图3为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为100μg/mL)的紫外吸收光谱图。
图4为实施例1中供试品溶液的外吸收光谱图。
图5为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为10ng/mL)的 TIC色谱图。
图6为实施例1中供试品溶液的TIC色谱图。
图7为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为10ng/mL)的 MRM(260.2/187.1)色谱图。
图8为实施例中供试品溶液的MRM(260.2/187.1)色谱图。
图9为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为10ng/mL)的 MRM(260.2/159.1)色谱图。
图10为实施例中供试品溶液的MRM(260.2/159.1)色谱图。
图11为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为10ng/mL)的 MS2质谱图(CE:20V)。
图12为实施例1中供试品溶液的MS2质谱图(CE:20V)。
图13为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为10ng/mL)的 MS2质谱图(CE:25V)。
图14为实施例1中供试品溶液的MS2质谱图(CE:25V)。
图15为实施例中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品溶液(浓度为10ng/mL)的 MS2质谱图(CE:30V)。
图16为实施例1中供试品溶液的MS2质谱图(CE:30V)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，下述具体实施例仅作为对本发明的解释性说明。
仪器：Shimadzu LC-30A超高效液相色谱仪(Shimadzu,Japan)；AB SCIEX
6500+ 质谱仪(AB SCIEX,America)；KQ-300DA型数据超声波清洗器(昆山超声仪器公司生产)； Milli-Q纯水系统(Millipore公司)；Metler-Toledo电子天平(感量：0.01mg)。
试剂：超纯水；甲醇和甲酸均为质谱纯；N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品(来源：TRC)。
实施例1
一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，包括以下步骤：
(1)检测条件：
色谱柱：Waters ACQUITY
HSS T3,100mm×2.1mm,1.8μm；检测器：二极管阵列检测器、线性离子阱；流动相：A-0.1％甲酸溶液、B-0.1％甲酸-甲醇；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：1μL；洗脱梯度程序：0-1min，30％B；10-10.2min，75％-95％B；12-12.2min，95％-30％B；
紫外检测波长：200-400nm；
质谱条件：
离子源：ESI+；脱溶剂温度(℃)：550；离子化电压(V)：5500；喷雾气(psi)：55；辅助加热气(psi)：55；采集模式：MRM，MS2；气帘气：25；碰撞气：Medium；
化合物离子对参数：
注：*定量离子对
(2)精密称量N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品约10mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，作为对照品溶液一；再移取适量，用甲醇逐级稀释，配成浓度约为10ng/mL的对照品溶液二。
(3)将某批号的纤之素胶囊(黄色胶囊)20粒倾取内容物，混匀，精密称取一次服用量 (约0.5g)，置于100mL容量瓶中，加甲醇70mL，涡旋1min，室温水浴超声提取30min，静置，加甲醇定容至刻度，混匀，13000r/min离心5min，移取上清液，进样，测定。
(4)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-线性离子阱质谱法进行定性筛查，分别取空白溶液、供试品溶液和对照品溶液一，注入液质联用仪，采集色谱图及紫外吸收光谱；将供试品溶液适当稀释，与空白溶液和对照品溶液二，注入液质联用仪，采集质谱图，比对一、二级质谱特征。
采集数据：
比较步骤(2)和(3)采集的对照品溶液一和供试品溶液的液相色谱图，发现(3)在保留时间8.2min处显示有色谱峰，与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品的保留时间及紫外光谱特征一致(见附图1-4)。
将供试品溶液的稀释液与对照品溶液二比较发现：供试品溶液中N-丁基-3-(三氟甲基)-α- 甲基苯乙胺保留时间一致处色谱峰对应的TIC图、MRM图、MS2碎片均与对照品一致，且二级主要碎片的丰度比满足表1规定值(见附图5-16)。
判断某批号的纤之素胶囊(黄色胶囊)中含有N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺。
按照步骤(3)中制备2份样品提取溶液，并根据其质谱响应适当稀释直至化合物浓度位于定量线性范围内，进样，采集数据，将响应信号代入拟合方程，计算出供试品中检出化合物的含量。
结果：N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺含量为41.6mg/g。
Claims (9)
1.一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)对照品溶液配制：精密称量N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品并用甲醇配制为0.1mg/mL的对照品溶液一及10ng/mL的对照品溶液二；
(2)供试品提取稀释：将供试品制成细粉，混合均匀(液体直接量取)，精密称取一次服用量，置于容量瓶中，加甲醇后经涡旋、室温水浴超声提取、静置，然后加甲醇定容，混匀，经离心处理后移取上清液；
(3)采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-线性离子阱质谱法进行定性筛查，分别取空白溶液、供试品溶液和对照品溶液一，注入液质联用仪，采集空白、供试品和对照品色谱图，比对供试品与对照品的色谱峰保留时间及紫外吸收光谱，如果均一致，则将供试品溶液适当稀释，与空白溶液和对照品溶液二，注入液质联用仪，采集质谱图，比对一、二级质谱特征；
(4)含量测定：在经步骤(3)确定供试品中添加了N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺后，按照步骤(2)中制备2份样品提取溶液，并根据其色谱响应稀释直至化合物浓度位于定量线性范围内，进样，采集数据，将响应信号代入拟合方程，计算出供试品中检出化合物的含量；所述的步骤(3)中的检测条件为：
色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱，100mm/50mm×2.1mm，1.7μm/1.8μm；检测器：二极管阵列检测器、线性离子阱质谱仪；流动相：A-0.1％甲酸溶液、B-0.1％甲酸-甲醇；流速：0.2-0.6mL/min；柱温：25-40℃；进样量：0.1-10μL；洗脱梯度程序：0-1min，30％B；10-10.2min，75％-95％B；12-12.2min，95％-30％B；
紫外检测波长：200-400nm；
质谱条件：
离子源：ESI+；脱溶剂温度(℃)：550；离子化电压(V)：5500；喷雾气(psi)：55；辅助加热气(psi)：55；采集模式：MRM，MS2；气帘气：25；碰撞气：Medium；
化合物离子对参数：
注：*定量离子对。
2.根据权利要求1所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述的定性筛查时，在供试品色谱图中，如果出现与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品保留时间一致的色谱峰，紫外吸收光谱都一致，且其质谱一级母离子，二级主要子离子质量数均相同，主要子离子的相对丰度比接近(满足相对离子丰度的最大允许偏差规定值)，则确定添加了N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺，利用MRM模式建立标准曲线进行含量测定；
如果未出现与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品保留时间一致的色谱峰，或者出现了与N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺对照品保留时间一致的色谱峰，但是不能同时满足紫外吸收光谱一致，质谱一级母离子，二级主要子离子质量数相同，主要子离子的相对丰度比接近(满足相对离子丰度的最大允许偏差规定值)的要求，则确定样品中没有添加N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺，计算其检出浓度。
3.根据权利要求2所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述的相对离子丰度的最大允许偏差为：
4.根据权利要求1所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述色谱柱为Waters ACQUITY
HSS T3，100mm×2.1mm，1.8μm。
5.根据权利要求1所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中供试品为固体或液体剂型的中成药或食品。
6.根据权利要求5所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述供试品为固体型的中成药或食品的，取用时研至粒径≤180μm，所述供试品为中成药胶囊剂的，取用时倾取内容物。
7.根据权利要求1所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的供试品待测物提取稀释的具体方法为：将供试品制成细粉，混合均匀(液体直接移取)，精密称取一次服用量，置于100mL容量瓶中，加甲醇70mL，涡旋1min，室温水浴超声提取30min，静置，加甲醇定容至刻度，混匀，经离心处理后移取上清液，进样，测定。
8.根据权利要求1、5-7中任一项所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述供试品取用量为：固体中成药取用量为一次服用量，食品取用量为1.0g，液体中成药或食品取用量为1mL。
9.根据权利要求1或7所述的一种减肥类中成药及食品中N-丁基-3-(三氟甲基)-α-甲基苯乙胺的检测方法，其特征在于：所述的离心处理的离心机转速≥13000r/min，离心时间≥5min。
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