CN112005110B - 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括：将所述低分子肝素用亚硝酸完全降解得到降解产物，以及将所述降解产物经高效液相色谱(HPLC)联用电雾式检测器(CAD)进行检测。此方法无需衍生和脱乙酰步骤，降解产物制备时间短、分析成本低、检测准确率高。

Description

一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用。
背景技术
达肝素钠是一种低分子肝素钠，由不同分子量的多糖链组成，其本身在紫外没有吸收峰。肝素酶，不论是肝素酶I、II或III，它们都是特异性裂解葡萄糖胺(1-4)己糖醛酸间相连的糖苷键，并在己糖醛酸的C4与C5间形成一个双键。肝素酶酶解达肝素钠后所得的酶解产物能够在紫外具有吸收峰，可通过紫外检测器对达肝素钠的酶解产物进行定量分析。
为了检测达肝素钠的质量，常用肝素酶酶解达肝素钠，然后用液相系统对降解产物进行分离，并通过与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质量的标准曲线进行定量。由于二糖标准品比较昂贵，所以后续发展出通过高效液相系统对降解产物进行分离，然后进一步对分离的产物通过质谱仪进行结构表征，从而实现对达肝素钠降解产物的定性分析，利用紫外检测器对分离出的各个组分进行定量分析，最终实现对达肝素钠质量的分析。
为了进一步提升对肝素酶酶解组分的定性/定量分析的方法，现有技术常在肝素酶酶解达肝素钠产物上柱前或后，进行衍生反应，例如：现有技术(CN201310711455.X)公开了在肝素酶酶解达肝素钠后，上液相系统柱子分离之前，对酶解产物进行衍生，并用反相色谱与高分辨质谱联用对衍生产物进行检测，以保证所有酶解产物均能进行定性分析。现有技术(CN201410123609.8)公开了在肝素酶酶解达肝素钠液相系统柱子分离酶解产物之后，进行荧光衍生反应，然后再进行检测。这既为无紫外吸收的低分子量肝素组分提供可检测的荧光基团，又可以实现高灵敏度的荧光检测，谱图中样品响应值更高；避免了衍生反应的副产物对色谱分离造成的干扰，提高分析的准确性和重复性。
另外，为了避免肝素酶降解的局限性，现有技术(CN201310695114.8)中还存在检测肝素二糖组成的方法，其主要是先将肝素脱乙酰化，得到脱乙酰肝素，然后将脱乙酰肝素用亚硝酸降解，得肝素二糖；将肝素二糖浓缩至干后溶于水，调pH值至碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；用液相色谱法或液相色谱质谱联用法检测衍生后的二糖。
关于现有技术中使用脱乙酰化后然后进行脱乙酰肝素亚硝酸降解法，它能够降解达肝素钠中带有N-硫酸基的葡萄糖胺，但不能降解达肝素钠中带有的N-乙酰基的葡萄糖胺。也就是说，脱乙酰步骤使得达肝素钠中存在的含有N-乙酰基的葡萄糖胺信息消失，且该方法还必须含有衍生步骤，步骤繁琐。
关于现有技术中肝素酶降解法，首先肝素酶易失活且性质不稳定，其次肝素酶酶解达肝素钠需要的时间长(单酶解实验所需时间为48h)、步骤繁琐、检测成本高(需要使用质谱)。同时，用酶解降解达肝素钠时，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脱水后形成结构相同的脱水的糖醛酸，失去了达肝素钠中葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸的含量和结构信息，且肝素酶不能完全将达肝素钠降解为二糖。
在现有技术中，对达肝素钠降解产物的分析方法效率低下、成本高且对达肝素钠降解产物的分析方法所得结果不能完整体现被分析的达肝素钠的情况。因此，目前存在对分析时间短、分析成本低、检测准确率高且完整体现被分析的达肝素钠的情况的分析方法的需求。
发明内容
在本发明的第一方面，涉及一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括下述步骤：(1)将所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解；(2)将降解产物经高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测。
在一些实施方式中，所述步骤(1)还包括在所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解后，加入pH调节剂终止反应，然后加入硼氢化钠溶液还原，进一步加入一种或多种pH调节剂终止反应且调节pH至中性，得到最终降解产物。
在一些实施方式中，在所述步骤(2)中，所述高效液相色谱和电雾式检测器的条件是流速0.1-2mL/min；洗脱梯度为0-45min，10％-60％流动相A，90％-40％流动相B，其中所述流动相A是铵盐溶液且所述流动相B是乙腈。
在一些实施方式中，所述铵盐是醋酸铵或甲酸铵，其浓度是20-200mM，且所述流速为0.1-1mL/min，且所述洗脱梯度为0-45min，10％-45％流动相A，90％-55％流动相B。
在一些实施方式中，所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是17.5-405:1，优选为25-250:1、35-175:1、50-130:1。
在一些实施方式中，在与亚硝酸混合后所述达肝素钠的浓度在4mg/mL-150mg/mL。
在一些实施方式中，所述pH调节剂选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸和冰醋酸。
在一些实施方式中，所述方法任选包括下述步骤：将步骤(2)所得检测结果与达肝素钠被亚硝酸完全降解后的产物经超高效液相色谱联用质谱进行检测的结果进行比对，最终获得步骤(1)所述达肝素钠经亚硝酸降解后的产物的定性和定量信息。
在本发明的第二方面，涉及所述分析方法在达肝素钠质量检测中的应用。
在一些实施方式中，所述应用包括使用所述分析方法对达肝素钠标准品(包括但不限于欧洲或美国标准品)和/或原研样品进行多次检测，根据检测结果建立质量标准。
附图说明
图1显示空白溶液和Dal-USP-RED-02叠图，上图为Dal-USP-RED-02，下图为BLANK-RED。
图2显示Dal-USP-RED-01和Dal-USP-RED-02叠图，上图为Dal-USP-RED-02，下图为Dal-USP-RED-01。
图3显示Dal-USP-RED-03和Dal-USP-RED-04叠图，上图为Dal-USP-RED-04，下图为Dal-USP-RED-03。
图4显示Dal-USP-RED-04至Dal-USP-RED-08叠图。
图5显示样品检测结果示图。
图6显示空白溶液、达肝素钠标准品和达肝素钠原研样品叠图，由下往上分别为专属性-BLANK-RED、专属性-Dal-USP-RED-01、专属性-Dal-EP-RED-01、专属性-原研样品-RED-01。
图7显示空白溶液、达肝素钠标准品和达肝素钠原研样品叠图，由下往上分别为BLANK-RED、Dal-USP-RED-01、Dal-EP-RED-01、原研样品-RED-01。
定义
如本文所使用的，术语“室温”是指25℃±5℃。同时，若没有具体指明实验温度，均为室温。
如本文所使用的，术语“约”是指该术语所修饰的数值的±20％，优选为±10％，更优选为±5％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。
如本文所使用的，术语“达肝素钠标准品”是指包括但不限于美国药典和欧洲药典的达肝素钠标准品。
如本文所使用的，术语“达肝素钠原研样品”是指原研厂家辉瑞的达肝素钠上市产品，包括但不限于美国和欧洲的达肝素钠上市产品。
如本文所使用的，术语“峰面积百分比％”是指经高效液相色谱与电雾式检测器联用检测达肝素钠降解产物所获得的各个峰(例如，11个峰)或经高效液相色谱与质谱联用检测达肝素钠降解产物所获得的各个峰的峰面积占全部峰的峰面积的比值的百分比％。
如本文所使用的，术语“各个峰的相对保留时间的比值”是指经高效液相色谱与电雾式检测器联用检测达肝素钠降解产物所获得的各个峰的保留时间与与其中所述峰中峰面积最大的峰(例如，第4个峰)的保留时间的比值，或经高效液相色谱与质谱联用检测达肝素钠降解产物所获得的各个峰的保留时间与其中所述峰中峰面积最大的峰的保留时间的比值。
如本文所使用的，下述英文缩写具有本领域技术人员通常知晓的含义。具体地，UPLC:超高效液相色谱仪；HPLC:高效液相色谱仪；QTOF：飞行时间质谱仪；CAD：电雾式检测器；dp：表示糖链的聚合度；MS：质谱仪；TIC：总离子流图；RRT：相对保留时间。
发明详述
本发明所使用的方法无需衍生和脱乙酰步骤，降解产物制备时间短(约5小时)、分析成本低、检测准确率高且完整体现被分析的达肝素钠的情况。
CAD检测原理是溶质(分析物)液滴干燥后形成溶质颗粒，与带正电荷的氮气颗粒碰撞使溶质颗粒带上正电，然后，带电颗粒将它们的电荷转移给收集器，最后用高灵敏度的静电检测计测出带电溶质的信号电流。由此产生的信号电流与溶质(分析物质)的质量含量成正比，与溶质(分析物质)本身化学结构无关。由于达肝素钠亚硝酸降解后的组分无紫外特征吸收，联用CAD检测可解决这一问题。因此，可以用于达肝素钠亚硝酸降解组分的定性、定量分析，包含了4个双糖峰、5个四糖峰和2个六糖峰，且对大于定量限的8个组分峰(对应表25中的2-9)进行了定量分析。
本发明使用方法采用HPLC联用检测器CAD完成，达肝素钠亚硝酸降解产物首先通过层析柱(HILIC柱(亲水相互作用色谱))分离后，进入CAD检测器检测，从而根据CAD检测结果获得达肝素钠亚硝酸降解物的组成信息。
本发明方法还可将经超高效液相色谱联用质谱进行检测的所述降解产物的检测结果与将经高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测的所述降解产物的检测结果进行比对，使得以后仅对达肝素钠亚硝酸降解产物实现高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测即可实现对所述降解产物的准确定性。
在本发明涉及一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括下述步骤或由下述步骤组成：(1)将所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解；(2)将降解产物经高效液相色谱(HPLC)联用电雾式检测器(CAD)进行检测。
在一些实施方式中，所述步骤(1)还包括在所述达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解后，加入pH调节剂终止反应，然后加入硼氢化钠溶液还原，进一步加入一种或多种pH调节剂终止反应且调节pH至中性(约7.0)，得到最终降解产物。
进一步地，所述步骤(1)还包括在所述达肝素钠与亚硝酸(所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是17.5-405:1)混合被完全降解后，加入碳酸钠调节pH至7-9(优选约8.5)，终止反应，然后加入硼氢化钠溶液还原，3-5小时(优选约4小时)后加入冰醋酸调节pH至3-5(优选约4)终止反应，然后加入氢氧化钠调节pH至6.5-7.5(优选约7)，得到最终降解产物。
更进一步地，取105μL的100mg/mL的达肝素钠样品与200μL的pH1.5的亚硝酸溶液混合，静置反应30min以上，再在混合器上震荡2min，使得所述达肝素钠完全降解，加入80μL1M的碳酸钠溶液调节pH值至8.5，使反应终止，加入145μL新配的30mg/mL硼氢化钠溶液，室温还原至少4小时，加入冰醋酸120μL调pH值至4.0终止反应，再添加150μL 4M NaOH中和调pH至约7.0，总体积约为800μL，得到最终降解产物，取所述降解产物液体0.3ml于离心管中，加入0.7ml超纯水混匀，以0.22μm的滤膜过滤后待用。
在一些实施方式中，在所述步骤(2)中，所述高效液相色谱和电雾式检测器的条件是流速0.1-2mL/min，优选为0.1-1mL/min，更优选为0.3mL/min；洗脱梯度为0-45min，10％-60％流动相A，90％-40％流动相B；优选地，洗脱梯度为0-45min，10％-45％流动相A，90％-55％流动相B。
在一些实施方式中，所述洗脱梯度为0-10min，15％流动相A，85％流动相B；10-25min，15％-33％流动相A，85％-67％流动相B；洗脱梯度为25-45min，33％-45％流动相A，67％-55％流动相B。进一步地，所述高效液相色谱的条件还任选地包括：洗脱梯度为45-50min，45％流动相A，55％流动相B；洗脱梯度为50-60min，45％-15％流动相A，55％-85％流动相B，其中所述流动相A是铵盐溶液且所述流动相B是乙腈。柱温为20-30℃，优选地25℃，且进样量1-10μL，优选地3μL。优选地，所述高效液相色谱的条件如表1所示，且所述电雾式检测器的条件是雾化温度约为35℃，根据雾化温度调节其它参数(例如，幂函数、采集频率、过滤值等)，优选地如表2所示。
在一些实施方式中，所述铵盐是醋酸铵或甲酸铵(在本发明的分析方法中醋酸铵或甲酸铵可以互相替换而不影响实验结果)，其浓度是20-200mM，优选100-150mM，更优选100mM和150mM，且所述流速为0.1-1mL/min，优选0.3mL/min。
在一些实施方式中，所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是17.5-405:1，优选为25-250:1、35-175:1、50-130:1。
在一些实施方式中，在与亚硝酸混合后，所述达肝素钠的浓度为4mg/mL-150mg/mL，优选为4.76mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、34.4mg/mL、51.6mg/mL、55mg/mL、68.9mg/mL、70mg/mL、100mg/mL、103.3mg/mL、137.7mg/mL以及所述各数值点之间的范围，包括但不限于20mg/mL-100mg/mL、20mg/mL-70mg/mL、30mg/mL-55mg/mL等。
在一些实施方式中，所述pH调节剂选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸和冰醋酸。
在一些实施方式中，所述达肝素钠液亚硝酸降解产物溶液在室温放置约1个月，优选约1周，更优选约3天内保持稳定。
在一些实施方式中，所述方法任选包括下述步骤：将步骤(2)所得检测结果与达肝素钠被亚硝酸完全降解后的产物经超高效液相色谱联用质谱进行检测的结果进行比对，最终获得步骤(1)所述达肝素钠经亚硝酸降解后的产物信息。
在一些实施方式中，所述检测的结果进行比对是将步骤(2)所得各个峰的相对保留时间的比值与经高效液相色谱联用电雾式检测器检测所述降解产物的各个峰的相对保留时间的比值进行对比。
在本发明的第二方面，涉及所述分析方法在达肝素钠质量检测中的应用。
在一些实施方式中，所述应用包括使用所述分析方法对达肝素钠标准品(例如，欧洲或美国标准品)和/或原研样品(例如，辉瑞公司在美国或欧洲上市产品)进行多次检测，根据检测结果建立质量标准。
在一些实施方式中，根据本发明所述检测结果建立的质量标准可以根据本领域的普通技术人员的一般知识进行变化，这些变化的技术方案均落入本发明要求保护的所述应用的范围之中。进一步地，所述质量标准可以通过如本申请实施例表30中各峰的峰面积百分比％的范围来建立。进一步地，所述质量标准是通过表31中的规则将表30中各峰的峰面积百分比％转换成表32中的质量标准1、2和3(其分别对应于质量标准强度高、中和低)。再进一步地，所述质量标准如下表所述。
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
质量标准1 ≤3.3 4.3-7.0 3.9-6.1 44.7-50.8 4.3-6.9 3.4-5.5 12.8-16.2 6.2-10.0 2.0-3.7 ≤3.0 ≤3.0
质量标准2 ≤3.6 3.8-7.6 3.5-6.6 43.5-52.1 3.8-7.5 3.0-6.0 12.2-16.9 5.5-10.9 1.8-4.0 ≤3.3 ≤3.3
质量标准3 ≤3.9 3.3-8.2 3.0-7.2 42.4-53.3 3.3-8.1 2.6-6.5 11.5-17.7 4.7-11.7 1.6-4.3 ≤3.5 ≤3.5
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而并非用于限定本发明权利要求中所涵盖的范围。
1.本发明所用的试剂的来源：
Figure BDA0002735861930000061
2.本发明所用的试剂样品的制备：
(1)流动相的制备：根据实际用量可按溶液配比调整溶液的配制体积。
流动相A(20～200mM醋酸铵或甲酸铵溶液，优选150mM醋酸铵)的配制：称取醋酸铵或甲酸铵适量至1000mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，转移至蓝盖瓶中，使用前超声10分钟。
流动相B：取适量乙腈至一洁净蓝盖瓶中，超声10分钟待用。
(2)肝素类亚硝酸降解产物溶液的制备：所用溶液根据实际用量可按溶液配比调整溶液的配制体积。
(3)0.5M H2SO4溶液的配制：取0.3mL浓硫酸缓慢加入少量水中，用超纯水定容到10mL，待冷却后，冷藏保存待用。
(4)0.5M Ba(NO2)2(亚硝酸钡)：称取1.2303g的一水合Ba(NO2)2，用超纯水溶解并定容到10mL，冷藏保存。
(5)pH 1.5亚硝酸(HONO)溶液的配制：在通风橱中，取冷藏的0.5M H2SO4和冷藏的0.5M Ba(NO2)2等体积直接混匀，11000rpm离心两分钟去除BaSO4沉淀，取上清液，即为pH1.5的亚硝酸溶液，临用现配。
(6)1M碳酸钠溶液的配制：取1.06g碳酸钠用超纯水溶解，并定容到10mL，摇匀。
(7)30mg/mLNaBH4溶液的配制：取30mgNaBH4于洁净离心管中，加入1mL超纯水溶解，摇匀，临用现配。
(8)4M氢氧化钠溶液的配制：取1.6g氢氧化钠，加入10mL超纯水溶解，摇匀。
(9)100mg/mL达肝素钠样品溶液的配制：称取0.1g达肝素钠样品(原研样品或欧洲药典化学参考品或美国药典化学参考品)于洁净离心管中，加入1mL超纯水至完全溶解。
(10)达肝素钠亚硝酸降解产物溶液和空白溶液的制备：
达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的示例性制备：分别取一定体积(例如，105μL)的达肝素钠样品(例如，100mg/mL)溶液于离心管中，加入200μL的pH1.5的HONO溶液，混合器上震荡均匀，静置反应30min以上，再在混合器上震荡2min，加入80μL1M的碳酸钠溶液调节pH值至8.5，使反应终止，加入145μL新配的30mg/mL硼氢化钠溶液，室温还原至少4小时，加入冰醋酸120μL调pH值至4.0终止反应，再添加150μL 4M NaOH中和调pH约7.0，总体积约为800μL，取降解液0.3ml于离心管中，加入0.7ml超纯水混匀，以0.22μm的滤膜过滤后待用。
空白溶液的制备：将达肝素钠样品溶液的制备中的105μL达肝素钠样品溶液更换为105μL超纯水，所用到的溶剂及整个制备过程同达肝素钠样品溶液的制备。
实施例1不同浓度达肝素钠亚硝酸降解产物的色谱分离及分析
1.高效液相色谱条件见表1
表1
Figure BDA0002735861930000071
2.CAD的条件见表2
表2
Figure BDA0002735861930000072
Figure BDA0002735861930000081
3.不同浓度达肝素钠亚硝酸降解样品的制备方法见表3。
Figure BDA0002735861930000091
Figure BDA0002735861930000101
样品命名规则：USP和EP标准品(以Dal-USP/EP-RED-XX为开头命名)，其中批号-RED开头代表降解后经还原的样品，XX代表第几个样品；空白样品以Blank-RED为开头命名，其中Blank-RED开头代表空白降解后经还原的样品。
在表3中，其中Dal-USP-RED-01是现有技术中彻底降解的浓度；如果Dal-USP-RED-02的结果与Dal-USP-RED-01相同，说明降解时样品初始浓度增加5倍也能彻底降解；Dal-USP-RED-04为在Dal-USP-RED-02的基础上初始浓度再增加2.1倍，因Dal-USP-RED-03与Dal-USP-RED-02初始浓度相同，则Dal-USP-RED-03与Dal-USP-RED-04相比较可证明Dal-USP-RED-04是否彻底降解。
Dal-USP-RED-01与Dal-USP-RED-02最终样品浓度一致。Dal-USP-RED-04最终样品浓度是Dal-USP-RED-03的1.05倍。
Dal-USP-RED-01至Dal-USP-RED-08的达肝素钠的初始浓度分别为100mg/mL、100mg/mL、100mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL、300mg/mL和400mg/mL。
将上述样品上机检测，实验结果如下：
如图1所示，空白溶液除溶剂峰外，未出现影响样品检测的色谱峰。
由图1得知，亚硝酸降解过程中使用的大量溶剂(比如碳酸钠、硼氢化钠、冰醋酸等)会在CAD出峰，这些试剂如果大量进入CAD检测器，会影响到检测器的寿命，因此只在条件摸索实验中采集0min～60min，以后实验均从16min开始采集。
如图2所示，Dal-USP-RED-01和Dal-USP-RED-02最终样品浓度一致，由于样品浓度低，除溶剂峰外仅出现3个色谱峰。
如图3所示，Dal-USP-RED-04最终样品浓度是Dal-USP-RED-03的1.05倍，除溶剂峰外出现11个色谱峰。
如图4所示，Dal-USP-RED-04至Dal-USP-RED-08各色谱峰分离良好。
结论：
在与亚硝酸混合后，各组达肝素钠的浓度如下(所述浓度＝达肝素钠初始质量(mg)/加入的亚硝酸与达肝素钠的体积(mL))：4.76mg/mL(Dal-USP-RED-01)、20mg/mL(Dal-USP-RED-02)、20mg/mL(Dal-USP-RED-03)、34.4mg/mL(Dal-USP-RED-04)、51.6mg/mL(Dal-USP-RED-05)、68.9mg/mL(Dal-USP-RED-06)、103.3mg/mL(Dal-USP-RED-07)、137.7mg/mL(Dal-USP-RED-08)。现有技术样品处理方面，降解试剂对样品检测干扰较大，发明人通过先将与亚硝酸混合后达肝素钠的浓度(第Dal-USP-RED-02至Dal-USP-RED-08组)提高至第Dal-USP-RED-01组的约4-30倍，再用超纯水稀释(稀释步骤)，从而降低降解试剂的干扰，还可适当提高样品检测浓度。假如通过上述实验，达肝素钠样品降解后的条件保持不变，和上表相同，亚硝酸降解时达肝素钠的浓度过高，导致最终上样时的样品中的盐浓度过高，从而可能影响HPLC中层析柱寿命，降低检测结果的准确性。
因此，如表3结合图1-4相应的结果显示，本发明的检测方法能够快速、低成本、准确的实现对达肝素钠样品亚硝酸降解产物的分离和检测，进而可进一步实现达肝素钠样品的分析(质量维度)。
4.四针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液各组分峰面积以及两针之间各峰面积相对误差见表4、5。
相对误差公式：
Figure BDA0002735861930000121
公式含义：A相对B的相对误差。
表4
Figure BDA0002735861930000122
表5
Figure BDA0002735861930000123
注：由于Dal-USP-RED-04最终样品浓度是Dal-USP-RED-03的1.05倍，峰面积与样品浓度成正比，计算两针之间峰面积相对误差需采用相同样品浓度，故Dal-USP-RED-03样品峰面积需乘与1.05。
结论：
空白溶液除溶剂峰外没有出现影响样品各色谱峰的检测；样品溶液中4号峰与溶剂峰的分离度为2.6，满足相邻色谱峰最小分离度不小于0.8要求，说明两峰分离度好，溶剂峰不影响4号峰的检测。
样品浓度高，通过提高样品溶液浓度，降解完成后增加稀释倍数的方式得到的样品(Dal-USP-RED-04最终样品浓度约为3.94mg/ml)，基线噪音小，所以选定为较优降解条件。
以下验证实验中达肝素钠标准品、达肝素钠原研样品均按较优条件降解。
实施例2不同浓度达肝素钠亚硝酸降解产物的色谱分离及分析
1.色谱和CAD仪器条件同前。
达肝素钠亚硝酸降解样品检测结果示意图如图5所示。
数据处理：设置合适的积分参数，例如表6，将样品的CAD图采用面积归一化法积分，计算各组分的峰面积百分比。
表6
Figure BDA0002735861930000131
2.方法验证：验证项目包括专属性、定量限、精密度(重复性和中间精密度)和耐用性。
(1)专属性：
在HILIC-HPLC-CAD系统上进样分析亚硝酸降解空白溶液、达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液、达肝素钠欧洲药典标准品亚硝酸降解产物溶液和原研达肝素钠亚硝酸降解产物溶液，考察空白样品是否会影响检测。
将在HILIC-HPLC-CAD系统上运行的亚硝酸降解空白溶液、达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液、达肝素钠欧洲药典标准品亚硝酸降解产物溶液和原研达肝素钠亚硝酸降解产物溶液在HILIC-UPLC-MS分别进样，考察空白样品是否会影响检测，同时也对亚硝酸降解后的各组分进行定性。
具体方法：
达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的配制见表7和表8。
表7
溶液名称 达肝素钠标准品/样品名称 达肝素钠标准品/样品加入量 超纯水加入量 溶液浓度
Dal-USP 达肝素钠美国药典标准品 0.0200g 0.200ml 100mg/ml
Dal-EP 达肝素钠欧洲药典标准品 0.0205g 0.205ml 100mg/ml
原研样品 达肝素钠原研 0.0208 0.208ml 100mg/ml
表8
Figure BDA0002735861930000132
Figure BDA0002735861930000141
空白溶液的制备:将以超纯水代替100mg/ml样品溶液，其余不变。
在前述的仪器条件下，进样分析一针空白溶液、一针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液、一针EP达肝素钠标准品亚硝酸降解产物溶液、一针达肝素钠原研样品亚硝酸降解产物溶液。
实验结果如下：
如图6所示，空白溶液除溶剂峰外，未出现影响样品检测的色谱峰。
达肝素钠美国标准品、欧洲标准品和达肝素钠原研样品亚硝酸降解产物溶液CAD图相邻色谱峰的分离度见表9。
表9
Figure BDA0002735861930000142
达肝素钠美国标准品、欧洲标准品和达肝素钠原研样品亚硝酸降解产物溶液CAD图(2号峰与3号峰)最小分离度、4号峰的不对称度和4号峰的塔板数见表10。
表10
Figure BDA0002735861930000143
Figure BDA0002735861930000151
结论：
空白中除溶剂峰外，未出现影响样品检测的色谱峰。
由表9得知USP达肝素钠标准品、EP达肝素钠标准品、达肝素钠原研样品亚硝酸降解产物溶液相邻色谱峰中最小分离度为2号峰与3号峰的分离度，均能满足分离度不小于0.8要求。
USP达肝素钠标准品、EP达肝素钠标准品、达肝素钠原研样品亚硝酸降解产物溶液4号峰理论塔板数、不对称度、相邻色谱峰(2号峰与3号峰)分离度均表现良好，因此本发明的方法满足专属性要求。
HILIC-UPLC-MS方法
流动相A、B、达肝素钠亚硝酸降解产物溶液均如先前的实施例1和达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的制备所述(HILIC-HPLC-CAD)。
仪器条件见表11、12：
表11
Figure BDA0002735861930000152
表12
Figure BDA0002735861930000153
Figure BDA0002735861930000161
实验结果如下：
如图7所示，空白溶液除溶剂峰外，未出现影响样品检测的色谱峰。
质谱TIC图与CAD图各峰RRT基本一致，结果详见表13。
Figure BDA0002735861930000171
Figure BDA0002735861930000181
Figure BDA0002735861930000191
Figure BDA0002735861930000201
Figure BDA0002735861930000211
注：结构表示方式如下：以U8,9,1为例，首位字母U表示饱和糖醛酸结构，首位数字8代表八糖结构，第二位数字代表有9个磺酸基，第三位数字代表有1个乙酰基，-ManR代表还原端为脱水甘露醇结构。AMol为2,5-脱水甘露醇；Rc-GlcN为链内缩环葡萄糖胺；ANAC为N乙酰化糖胺；序列中I表示为艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸。
由于乙酰基仅存在于葡萄糖胺残基中属于本领域的公知常识，因此如CN201310695114.8中的脱乙酰步骤使得达肝素钠中存在的含有N-乙酰基的葡萄糖胺信息消失，而如表14-15所见在本发明方法中能完整体现被分析的达肝素钠降解产物的情况。
实验结论：
空白中除溶剂峰外，未出现影响样品检测的色谱峰。
USP达肝素钠标准品、EP达肝素钠标准品、达肝素钠原研样品亚硝酸降解产物溶液4号峰理论塔板数最小值149851、不对称度1.2、相邻色谱峰(2号峰与3号峰)分离度为0.9，均满足分析要求。通过质谱解析对CAD图中各峰进行定性，得到其可能结构和可能序列。后续可仅通过CAD检测，实现对样品的定性和定量检测。
(2)精密度(重复性和中间精密度)：
重复性：
达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的配制见表16、17。
表16
Figure BDA0002735861930000221
Figure BDA0002735861930000231
空白溶液的制备:将以超纯水代替100mg/ml样品溶液，其余不变。
仪器条件如前所述，进样分析1针空白样品、6针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液。
在同一天由同一个检验员进样分析6针达肝素钠美国药典参考标准品亚硝酸降解产物溶液各1针。定量分析：计算6针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液CAD图中各组分峰的面积百分比的相对标准偏差(RSD％)。
实验结果：
6针达肝素钠美国标准品亚硝酸降解各组分峰峰面积百分比见表18。
表18
Figure BDA0002735861930000241
从上表可以看出，除峰名称为1、10、11外其余峰面积百分比均大于LOQ(3.0％)(后续定量限实验确定的定量限，且峰面积百分比≥10％的峰的RSD最大为1.3％，峰面积百分比≥LOQ且＜10.0％的峰的RSD最大为7.2％，因此本发明的方法通过了重复性实验。
中间精密度：
由不同的实验人员在不同的日期，按照重复性中的方法进行溶液配制。
达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的配制见表19、20。
表19
溶液名称 达肝素钠标准品/样品名称 达肝素钠标准品/样品加入量 超纯水加入量 溶液浓度
Dal-USP-01 达肝素钠美国药典标准品 0.0205g 0.205ml 100mg/ml
Dal-USP-02 达肝素钠美国药典标准品 0.0204g 0.204ml 100mg/ml
Dal-USP-03 达肝素钠美国药典标准品 0.0201g 0.201ml 100mg/ml
Dal-USP-04 达肝素钠美国药典标准品 0.0206g 0.206ml 100mg/ml
Dal-USP-05 达肝素钠美国药典标准品 0.0202g 0.202ml 100mg/ml
Dal-USP-06 达肝素钠美国药典标准品 0.0201g 0.201ml 100mg/ml
Figure BDA0002735861930000261
空白溶液的制备:将以超纯水代替100mg/ml样品溶液，其余不变。
流动相和仪器条件如前所述，进样分析1针空白样品，6针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液。定量分析：计算两个检验员检测的12针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液CAD图中各组分峰的面积百分比的相对标准偏差(RSD％)。
实验结果如下：
6针达肝素钠美国标准品亚硝酸降解各组分峰峰面积百分比见表21。
表21
Figure BDA0002735861930000271
两名实验员12针达肝素钠美国标准品亚硝酸降解各组分峰的峰面积百分比见表22。
Figure BDA0002735861930000281
从表21可以看出，除峰名称为1、10、11外其余峰面积百分比均大于LOQ(下述的定量限(3)部分)(3.0％)，且峰面积百分比≥10％的峰的RSD最大为2.2％，峰面积百分比≥LOQ且＜10.0％的峰的RSD最大为6.1％，可进行有效的分析。
从表22可以看出，两个实验员12针达肝素钠美国标准品亚硝酸降解产物溶液，除峰名称为1、10、11外其余峰面积百分比均大于LOQ(3.0％)，定量限结果参考下述(3)定量限部分的研究结论，且峰面积百分比≥10％的峰的RSD最大为1.6％，峰面积百分比≥LOQ且＜10.0％的峰的RSD最大为7.2％，可进行有效的分析。
以上，本发明的方法通过了中间精密度实验验证。
(3)定量限：
本方法是通过CAD图积分采用面积百分比法计算各组分的百分含量百分比，用于组分百分含量对比研究。因此需对各组分的最小定量范围进行确认。根据ICHQ2要求，定量限的可接受标准既满足S/N≥10：1，同时满足峰面积百分比RSD％≤10.0％。
流动相和仪器条件如前所述。
达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的配制见表23、24。
表23
溶液名称 达肝素钠标准品/样品名称 达肝素钠标准品/样品加入量 超纯水加入量 溶液浓度
Dal-USP 达肝素钠美国药典标准品 0.0203g 0.203ml 100mg/ml
表24
Figure BDA0002735861930000291
空白溶液的制备:将以超纯水代替100mg/ml样品溶液，其余不变。
进样分析1针空白样品，3针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液。
重复性实验6针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液每个组分RSD％及定量限3针信噪比(S/N)均符合上述定量限的可接受标准的最小峰面积百分比为定量限。
定量分析：分别计算重复性实验6针达肝素钠美国药典标准亚硝酸降解产物溶液CAD图谱峰面积百分比的相对标准偏差(RSD％)。
通过每个峰的S/N和峰面积百分比的RSD％来确定定量限。
3针达肝素钠美国标准品亚硝酸降解各组分峰峰面积百分比、信噪比见表25。
表25
Figure BDA0002735861930000301
从上表可以看出同时满足信噪比S/N≥10:1，6针重复性峰面积百分比RSD≤10.0％最小组分峰名称为9，9号峰峰面积百分比平均值3.0％，因此在样品浓度为100mg/ml的情况下，该方法定量限为3.0％。
(4)耐用性：
流动相和仪器条件同前。
达肝素钠亚硝酸降解产物溶液的配制见表26、27。
表26
Figure BDA0002735861930000302
Figure BDA0002735861930000311
Figure BDA0002735861930000321
从上表可以看出6针耐用性与6针重复性达肝素钠美国标准品溶液的检测结果除峰名称为1、10、11外其余峰面积百分比均大于LOQ(3.0％)，且峰面积百分比≥10％的峰的RSD最大为2.0％，峰面积百分比≥LOQ且＜10.0％的峰的RSD最大为9.6％，因此，本发明的方法通过耐用性实验检测，对不同序列号的色谱柱具有耐用性。
(5)溶液稳定性：
将重复性考察用达肝素钠液美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液作为0小时的稳定性实验样品，置于室温放置约48小时(首次进样时间计为第1天，48小时为第3天)进行检测，每个时间点样品各进一针。
定量分析：计算12针达肝素钠美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液CAD图中各组分峰的面积百分比的相对标准偏差(RSD％)，以第一针同时作为系统适用性。
实验条件同前。
12针达肝素钠美国标准品亚硝酸降解各组分峰峰面积百分比见表29。
Figure BDA0002735861930000341
6针溶液稳定性与6针重复性达肝素钠美国标准品溶液从上表可以看出除峰名称为1、10、11外其余峰面积百分比均大于LOQ(3.0％)，且峰面积百分比≥10％的峰的RSD最大为2.5％，峰面积百分比≥LOQ且＜10.0％的峰的RSD最大为9.1％，因此，本发明的方法通过溶液稳定性实验，达肝素钠液美国药典标准品亚硝酸降解产物溶液放置3天溶液稳定，不影响样品检测结果。
实施例3
实验条件和实验试剂如实施例2所述。
本发明人认为通过对欧洲原研和美国原研样品的检测，可确定本发明的方法用于检测达肝素钠质量的标准，检测方法同前实施例2中的方法。对7个欧洲原研、11个美国原研样品批次的达肝素钠降解产物经高效液相色谱联用电雾式检测器的检测结果如表30所示。
表30
Figure BDA0002735861930000351
可采用的质量标准：按照欧美原研检测结果，分高、中和低(对应表32中的质量标准1、2和3)三种，按以下表31的规则计算。例如，表30中第1个峰的峰面积百分比％是2.1-2.9％(低于定量限3.0％，关于定量限请参考表25)，那么参考表31中的规则最右侧一栏定量限>峰面积百分比％来计算质量标准强度(即，高：2.9×115％＝3.3；中：2.9×125％＝3.6；低：2.9×135％＝3.9)，其对应于表32中的质量标准1(≤3.3％)、质量标准2(≤3.6％)和质量标准3(≤3.9％)。其它峰参考上述方法进行计算。
表31
Figure BDA0002735861930000361
表32(峰面积百分比％)
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
质量标准1 ≤3.3 4.3-7.0 3.9-6.1 44.7-50.8 4.3-6.9 3.4-5.5 12.8-16.2 6.2-10.0 2.0-3.7 ≤3.0 ≤3.0
质量标准2 ≤3.6 3.8-7.6 3.5-6.6 43.5-52.1 3.8-7.5 3.0-6.0 12.2-16.9 5.5-10.9 1.8-4.0 ≤3.3 ≤3.3
质量标准3 ≤3.9 3.3-8.2 3.0-7.2 42.4-53.3 3.3-8.1 2.6-6.5 11.5-17.7 4.7-11.7 1.6-4.3 ≤3.5 ≤3.5
由上表可知，使用欧洲和美国原研达肝素钠通过本发明方法进行降解产物的分析，可建立一套达肝素钠降解产物分析的质量标准并用于达肝素钠样品的质量判断。本发明所述质量标准仅仅是示例性的，本领域的普通技术人员可以根据一般知识进行变化，这些变化的技术方案均落入本发明要求保护的所述应用的范围之中。
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (12)

1.一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法，所述方法包括下述步骤：
(1)在达肝素钠与亚硝酸混合被完全降解后，加入pH调节剂终止反应，然后加入硼氢化钠溶液还原，进一步加入一种或多种pH调节剂终止反应且调节pH至中性，得到最终降解产物；
(2)将降解产物经高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测，
其中，步骤(2)中，所述高效液相色谱联用电雾式检测器进行检测的条件为：色谱柱为Adv.Bio Glycan Mapping Column 2.1*150mm，2.7μm；流速0.1-2mL/min；其中流动相A是铵盐溶液，所述铵盐溶液是醋酸铵或甲酸铵，且流动相B是乙腈，洗脱梯度为0-10min，15％流动相A，85％流动相B；10-25min，15％-33％流动相A，85％-67％流动相B；洗脱梯度为25-45min，33％-45％流动相A，67％-55％流动相B。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述铵盐的浓度是20-200mM，所述流速为0.1-1mL/min。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其中，所述铵盐的浓度是100-150mM，所述流速为0.3mL/min；所述进样量为3μL，所述色谱柱的柱温为25℃，所述洗脱梯度为
Figure FDA0003895308500000011
4.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是17.5-405:1。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是25-250:1。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是35-175:1。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述达肝素钠的质量与所述亚硝酸摩尔数的比值(g/mol)是50-130:1。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其中在与亚硝酸混合后所述达肝素钠的浓度在4mg/mL-150mg/mL。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其中所述pH调节剂选自下述的一种或多种：碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸和冰醋酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分析方法，所述方法进一步包括下述步骤：
将经步骤(2)所得检测结果与达肝素钠被亚硝酸完全降解后的产物经高效液相色谱联用质谱进行检测的结果进行比对，最终获得步骤(1)所述达肝素钠经亚硝酸降解后的产物的定性和定量信息，所述高效液相色谱联用质谱检测的条件如下所述，流动相A是醋酸铵或甲酸铵，且流动相B是乙腈：
Figure FDA0003895308500000021
条件内容 名称/指标 质谱仪 Waters Xevo G2-S QTOF Mode Negative Resolution Mode【负离子分辨率模式】 Capillary Voltage 2.0kV Sampling cone 25V Source Offset Voltage 80V Source Temperature 120℃ Desolvation Temperature 500℃ Cone Gas Flow 50L/Hr Desolvation Gas Flow 800L/Hr Start Mass 200 End Mass 2000 Start Time 16min(可根据实际情况进行调整) End Time 60min(可根据实际情况进行调整)
。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的分析方法在达肝素钠质量检测中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，包括使用根据权利要求1-9中任一项所述的分析方法对达肝素钠标准品和/或原研样品进行多次检测，根据检测结果建立质量标准。
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