CN109932455A - 检测24h尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法是用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合出标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，在该待检测24H尿液经过处理后，同样使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测尿液进行检测，得到待测尿液y1、y2和y3值，将y1、y2和y3值代入标准曲线方程中，通过计算得到待测尿液中儿茶酚胺三种代谢物相对浓度x1、x2和x3，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该尿液中待检测24H尿液中的儿茶酚胺三种代谢物浓度，该方法检测过程简便快速，检测灵敏度高，利于对患者体内儿茶酚胺三种代谢物进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及神经类物质的临床含量浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测24H尿液中神经类物质儿茶酚胺代谢物含量的方法。
背景技术
嗜铬细胞瘤是起源于肾上腺髓质，交感神经节，并可出现在肾上腺、膀胱、腹主动脉旁、腹膜后及心脏等的嗜铬组织的肿瘤。常出现阵发性或持续性高血压临床症状，并表现多样化，嗜铬细胞瘤病情凶险，变化剧烈，如不及时治疗易引起心脑血管并发症而导致死亡。因此嗜铬细胞瘤的早期诊断，具有重要的临床意义。
嗜铬细胞瘤是一种可能治愈的肾上腺髓质儿茶酚胺生成细胞肿瘤，或不太常见的交感神经节(副神经节瘤)，嗜铬细胞瘤早期诊断非常重要，但早期在影像学中较难定位，特别是肾上腺以外包括主动脉旁，膀胱内，直肠后，胸内等部位的瘤体更难发现，而这些部位的嗜铬细胞瘤多数为恶性。旁交感神经节可分泌过量儿茶酚胺，包含去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺三种物质，三种物质经过代谢可生成相应代谢产物去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺 (具体化学结构如图1、图2、图3所示)，儿茶酚胺含量水平的不同与心脏猝死、冠状心脏病和心脏不充血等也有潜在联系。由于瘤组织可阵发性或持续性地分泌大量的儿茶酚胺，嗜铬细胞瘤体大小与儿茶酚胺的释放不成正比，巨大的肿瘤因儿茶酚胺在瘤体内转换速度较慢，降解较充分故释放到血液中的儿茶酚胺较少，但最终通过代谢以尿的形式排出，患者的尿儿茶酚胺代谢物水平会显著升高。因此，尿儿茶酚胺代谢物的测定，成为嗜铬细胞瘤的重要诊断依据。
发明内容
针对上述技术问题，本申请的发明目的是提供一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，使儿茶酚胺代谢物含量的测定快速准确，前处理操作简单易行，灵敏度高，精确定量相关物质并且可以广泛适用。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲变肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL；
精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液B，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL；
精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL；
将标准储备液A、B和C以11:101.9:43.3的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，在含有156.25-10000ng/mL去甲变肾上腺素、125-8000ng/mL变肾上腺素和156.25-10000ng/mL的3-甲氧基酪胺的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)、标准内标液的配制：
取去甲变肾上腺素同位素内标储备液D，其去甲变肾上腺素同位素的浓度为100μg/mL；取变肾上腺素同位素内标储备液E，其变肾上腺素同位素的浓度为100μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到3-甲氧基酪胺同位素内标储备液F，其3-甲氧基酪胺同位素的浓度为 68.44μg/mL，将内标储备液D、E和F以3:3:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，得到含有1500ng/mL去甲变肾上腺素同位素、含有1500ng/mL变肾上腺素同位素和含有342.2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度标准工作液分别与10μL标准内标液和80μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入 5μL含有1-5mol/L盐酸的水解液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，在80-100℃条件下水浴20-30min，再依次加入5μL含有1-5mol/L氢氧化钠的中和液和 100μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将处理好的上述标准溶液分别全部转移至SPE 柱，然后用100-300μL水进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.05-1mol/L盐酸的洗脱液，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比分别作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得到的至少九组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、 y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测尿液的采集
收集24小时的尿液，在上述尿液中添加防腐剂，并置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；其中在成人的尿液中添加10克硼酸或25毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂；在儿童的尿液中添加3克硼酸或15毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂：
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的100uL的尿液于上述离心管中，加入5μL含有1-5mol/L盐酸的水解液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，在80-100℃条件下水浴20-30min，再依次加入5μL 含有1-5mol/L氢氧化钠的中和液和100μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液；分别用 100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，然后用100-300μL水进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.05-1mol/L盐酸的洗脱液，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺峰面积及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的峰面积之比y1、y2和y3分别代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺浓度分别与标准内标液中对应的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测尿液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和-甲氧基酪胺浓度。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：
含有156.25ng/mL去甲变肾上腺素、含有125ng/mL变肾上腺素和含有156.25ng/mL的3- 甲氧基酪胺；
含有312.5ng/mL去甲变肾上腺素、含有250ng/mL变肾上腺素和含有312.5ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有625ng/mL去甲变肾上腺素、含有500ng/mL变肾上腺素和含有625ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有1250ng/mL去甲变肾上腺素、含有1000ng/mL变肾上腺素和含有1250ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有2500ng/mL去甲变肾上腺素、含有2000ng/mL变肾上腺素和含有2500ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有5000ng/mL去甲变肾上腺素、含有4000ng/mL变肾上腺素和含有5000ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有10000ng/mL去甲变肾上腺素、含有8000ng/mL变肾上腺素和含有10000ng/mL的3- 甲氧基酪胺。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成，在步骤(a)和(b)中，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液，所述溶解液是含有0.1mol/L盐酸的水溶液。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)和(d)中，所述水解液是含有3mol/L盐酸的水溶液；所述中和液是含有3mol/L氢氧化钠的水溶液；所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵的水溶液。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为1μL。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述分析色谱柱的流动相为含有95:5比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.25mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1。
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
本发明有益效果：
本发明所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，尿液样本经off-line SPE固相萃取装置前处理后直接进样，整个前处理过程可在30min内完成，效率得到了极大提高，使检测过程简便快速，另外，该方法的检测灵敏度高，大大提高了定量结果的准确性，更利于在临床治疗中对患者体内的儿茶酚胺代谢物含量进行监测，为嗜铬细胞瘤的前期诊断提供实验基础。
附图说明
图1为去甲变肾上腺素化学结构式；
图2为变肾上腺素化学结构式；
图3为3-甲氧基酪胺化学结构式；
图4为实施例中标准溶液中儿茶酚胺代谢物三种物质色谱图；
图5为实施例中加标尿液样本中儿茶酚胺代谢物三种物质色谱图。
在图4和图5中，标注1为去甲变肾上腺素的色谱峰；标注2为变肾上腺素的色谱峰；标注3为3-甲氧基酪胺的色谱峰，标注4为去甲变肾上腺素同位素内标的色谱峰；标注5为变肾上腺素同位素内标的色谱峰；标注6为3-甲氧基酪胺同位素内标的色谱峰。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本发明的一种检测24H尿液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)标准工作液的配制：
精确称取去甲肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL；精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液B，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL，将标准储备液A、B和C以 11:101.9:43.3的体积比混合后，用含有0.04％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，分别在含有156.25-10000ng/mL去甲变肾上腺素、125-8000ng/mL变肾上腺素、156.25-10000ng/mL3-甲氧基酪胺的范围内配制出七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：含有156.25ng/mL去甲变肾上腺素、含有125ng/mL变肾上腺素和含有156.25ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有312.5ng/mL去甲变肾上腺素、含有250ng/mL变肾上腺素和含有312.5ng/mL的3- 甲氧基酪胺；含有625ng/mL去甲变肾上腺素、含有500ng/mL变肾上腺素和含有625ng/mL的 3-甲氧基酪胺；含有1250ng/mL去甲变肾上腺素、含有1000ng/mL变肾上腺素和含有1250ng/mL 的3-甲氧基酪胺；含有2500ng/mL去甲变肾上腺素、含有2000ng/mL变肾上腺素和含有 2500ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有5000ng/mL去甲变肾上腺素、含有4000ng/mL变肾上腺素和含有5000ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有10000ng/mL去甲变肾上腺素、含有8000ng/mL变肾上腺素和含有10000ng/mL的3-甲氧基酪胺，并在-80℃条件下保存；
(b)标准内标液的配制
取去甲变肾上腺素同位素内标储备液D，其去甲变肾上腺素同位素浓度为100μg/mL；取变肾上腺素同位素内标储备液E，其变肾上腺素同位素浓度为100μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液F，其3-甲氧基酪胺同位素浓度为68.44μg/mL，将内标储备液D、 E和F以3:3:1的体积比混合后，用含有0.04％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，得到含有 1500ng/mL去甲变肾上腺素同位素、含有1500ng/mL变肾上腺素同位素和含有342.2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取上述七种不同浓度的标准工作液10μL，将上述七种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和80μL的4％牛血清白蛋白分别置于1.5ml离心管中混合制成七种标准溶液，在上述七种标准溶液中加入5μL含有3mol/L盐酸水溶液的水解液，然后，将上述七种标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀30s，在100℃条件下水浴20min，再依次加入5μL含有3mol/L氢氧化钠水溶液的中和液和100μL含有50mmol/L 乙酸铵水溶液的缓冲液；分别用200μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将处理好的上述标准溶液分别全部转移至SPE柱，用200μL水洗涤，最后加入100μL含有0.1mol/L盐酸水溶液的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述七种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺色谱图及其内标的色谱图，以上述七种标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比分别作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得到的至少二十一组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测尿液的采集
收集24小时的尿液，在上述尿液中添加防腐剂，并置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；其中在成人的尿液中添加10克硼酸或25毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂；在儿童的尿液中添加3克硼酸或15毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂；
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的100uL的尿液于上述离心管中，加入5μL含有3mol/L盐酸水溶液的水解液，然后在转速为2000rpm下涡旋混匀30s-1min，在100℃条件下水浴20min，再依次加入5μL含有3mol/L氢氧化钠水溶液的中和液和100μL含有50mmol/L水溶液的缓冲液，分别用 200μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，用200μL水洗涤，最后加入100μL含有0.1mol/L盐酸水溶液的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100uL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺峰面积及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的峰面积之比y1、y2和y3分别代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测尿液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和-甲氧基酪胺浓度。
样品处理包括：off-line SPE固相萃取装置，off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，off-line SPE固相萃取装置所使用的萃取柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm；萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi；高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为1290Infinity In-lineFilter，所使用的分析色谱柱为 Phenomennex，Kinetex F5，设置的柱温为40℃，进样量为1uL，分析色谱柱流动相含有95:5 比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.25mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式；高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素 166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1；含甲酸量为体积比的含甲酸量。
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度(156.25-10000ng/mL)的去甲变肾上腺素、(125-8000pg/mL) 的变肾上腺素、(156.25-10000pg/mL)的3-甲氧基酪胺的混合标准工作液，加入80μL 4％牛血请白蛋白混匀，经off-line SPE前处理后进样，去甲变肾上腺素浓度在15.625ng/mL到1000 ng/mL、变肾上腺素浓度在12.5ng/mL到800ng/mL、3-甲氧基酪胺浓度在15.625ng/mL到1000 ng/mL范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：
去甲变肾上腺素：0.30ng/mL；变肾上腺素：0.17ng/mL；3-甲氧基酪胺：0.13ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：
去甲变肾上腺素：0.90ng/mL；变肾上腺素：0.51ng/mL；3-甲氧基酪胺：0.38ng/mL。
(3)线性范围：
去甲变肾上腺素在15.625ng/mL到1000ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900；
变肾上腺素在12.5ng/mL到800ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900；
3-甲氧基酪胺在15.625ng/mL到1000ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
二、该方法的回收率和精密度
取去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为98.48％～109.57％，相对标准偏差为0.15％～2.44％，表1为去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的加标回收率和精密度。
表1
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测24H尿液中儿茶酚胺三种代谢物含量，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
尿液样本中儿茶酚胺三种代谢物色谱图见图5，标准溶液中儿茶酚胺三种代谢物色谱图见图4，去甲变肾上腺素的保留时间为1.21min，变肾上腺素的保留时间为1.63min，3-甲氧基酪胺的保留时间为2.68min，由图4和图5可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲变肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL；
精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液B，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL；
精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL；
将标准储备液A、B和C以11:101.9:43.3的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，在含有156.25-10000ng/mL去甲变肾上腺素、125-8000ng/mL变肾上腺素和156.25-10000ng/mL的3-甲氧基酪胺的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)、标准内标液的配制：
取去甲变肾上腺素同位素内标储备液D，其去甲变肾上腺素同位素的浓度为100μg/mL；取变肾上腺素同位素内标储备液E，其变肾上腺素同位素的浓度为100μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到3-甲氧基酪胺同位素内标储备液F，其3-甲氧基酪胺同位素的浓度为68.44μg/mL，将内标储备液D、E和F以3:3:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，得到含有1500ng/mL去甲变肾上腺素同位素、含有1500ng/mL变肾上腺素同位素和含有342.2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度标准工作液分别与10μL标准内标液和80μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入5μL含有1-5mol/L盐酸的水解液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，在80-100℃条件下水浴20-30min，再依次加入5μL含有1-5mol/L氢氧化钠的中和液和100μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将处理好的上述标准溶液分别全部转移至SPE柱，然后用100-300μL水进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.05-1mol/L盐酸的洗脱液，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比分别作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得到的至少九组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测尿液的采集
收集24小时的尿液，在上述尿液中添加防腐剂，并置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；其中在成人的尿液中添加10克硼酸或25毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂；在儿童的尿液中添加3克硼酸或15毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂：
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的100uL的尿液于上述离心管中，加入5μL含有1-5mol/L盐酸的水解液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，在80-100℃条件下水浴20-30min，再依次加入5μL含有1-5mol/L氢氧化钠的中和液和100μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，然后用100-300μL水进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.05-1mol/L盐酸的洗脱液，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺峰面积及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的峰面积之比y1、y2和y3分别代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺浓度分别与标准内标液中对应的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测尿液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和-甲氧基酪胺浓度。
2.如权利要求1所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：
含有156.25ng/mL去甲变肾上腺素、含有125ng/mL变肾上腺素和含有156.25ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有312.5ng/mL去甲变肾上腺素、含有250ng/mL变肾上腺素和含有312.5ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有625ng/mL去甲变肾上腺素、含有500ng/mL变肾上腺素和含有625ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有1250ng/mL去甲变肾上腺素、含有1000ng/mL变肾上腺素和含有1250ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有2500ng/mL去甲变肾上腺素、含有2000ng/mL变肾上腺素和含有2500ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有5000ng/mL去甲变肾上腺素、含有4000ng/mL变肾上腺素和含有5000ng/mL的3-甲氧基酪胺；
含有10000ng/mL去甲变肾上腺素、含有8000ng/mL变肾上腺素和含有10000ng/mL的3-甲氧基酪胺。
3.如权利要求2所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成，在步骤(a)和(b)中，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液，所述溶解液是含有0.1mol/L盐酸的水溶液。
4.如权利要求3所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和(d)中，所述水解液是含有3mol/L盐酸的水溶液；所述中和液是含有3mol/L氢氧化钠的水溶液；所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵的水溶液。
5.如权利要求4所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。
6.如权利要求5所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为1μL。
7.如权利要求6所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相为含有95:5比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.25mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
8.如权利要求7所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1。
9.如权利要求8所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
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