CN109187834A - 一种空白尿液基质及其用途 - Google Patents

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李维
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Abstract

本发明公开了一种空白尿液基质，通过如下制备方法获得：(1)收集尿液；(2)向步骤(1)收集的尿液中加碱调节pH值至碱性，去除儿茶酚胺类物质；(3)向步骤(2)获得的尿液中加酸调节pH值至接近中性；(4)使用弱阳离子交换柱吸附去除步骤(3)获得的尿液中儿茶酚胺的代谢产物，即得所述空白尿液基质。本发明还公开了所述空白尿液基质在尿液儿茶酚胺及其代谢产物的定性和/或定量检测中的用途。本发明所述空白尿液基质制备方法简单，可操作性强，不仅有效地去除了干扰物质，与实际样本基质匹配度高，避免了基质效应，而且具有成本较低，能够用于实际临床检测等优势。

Description

一种空白尿液基质及其用途
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种空白尿液基质及其在尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物检测中的用途。
背景技术
儿茶酚胺类物质包含多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素，其代谢产物包括甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧基酪胺，儿茶酚胺及其代谢产物一方面来源于人体自身代谢，一方面直接来源于嗜铬细胞。儿茶酚胺及其代谢产物大量分泌通常会引起血浆与尿液中相关化合物浓度的增加。尿液中代谢产物的检测具有含量高、易检出、无创性等特点。24h尿液儿茶酚胺及其代谢产物可用于PPGL患者的初步筛查。基于液相色谱-串联质谱法检测内分泌性疾病的代谢产物，目前已广泛应用于各种临床色谱质谱实验室，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)是以儿茶酚胺及其代谢产物大量分泌为特征的肿瘤。液相色谱-串联质谱法的引入可以更有效、更准确、快速地检出PPGL患者的儿茶酚胺及其代谢产物水平。
对于生物样品(血液，血清，尿液，积液等)而言，若分析物为外源性物质(大多数药物，环境污染物等)都可以方便的使用正常人的标本作为空白基质；但如果分析物为内源性物质(人体内本身含有的，如类固醇、维生素、儿茶酚胺类等)，就很难获得空白基质用于标准曲线和质控的配制。
对于尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的检测，现有空白尿液基质获取的主要方式及存在的问题有：1、目前临床上存在的商业化试剂盒产品批次间差异大，保存时间短，主要靠国外进口，成本高，不利于实验室大批量样本的检测；2、由于内源性化合物儿茶酚胺及其代谢产物在尿液中大量存在，致使很难直接全面地去除空白样本基质中的儿茶酚胺及甲氧基肾上腺素类物质；3、有部分研究采用缓冲盐或纯水作为尿液替代基质，用于配制标准曲线或质控，虽然基质效应较弱，但该替代基质无法反应实际样本的真实基质状态，使尿液样本的检测结果可能会不准确。
基于以上原因，迫切需要一种制备简单、成本较低、基质效应等均符合要求的用于尿液中内源性儿茶酚胺及其代谢物检测的空白尿液基质。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种空白尿液基质，其制备方法简单、成本较低、基质效应等均符合要求，可应用于儿茶酚胺和/或其代谢产物检测中标准曲线和质控的配制，基质效应满足检测要求，稳定性好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种空白尿液基质，通过如下制备方法获得：
(1)收集尿液；
(2)向步骤(1)收集的尿液中加碱调节pH值至碱性，去除儿茶酚胺类物质；
(3)向步骤(2)获得的尿液中加酸调节pH值至接近中性；
(4)使用弱阳离子交换柱吸附去除步骤(3)获得的尿液中儿茶酚胺的代谢产物，即得所述空白尿液基质。
优选地，所述步骤(1)中收集的尿液为健康人尿液。
优选地，所述步骤(1)中收集的尿液为不同年龄和不同性别的健康人群的混合尿液。
优选地，所述步骤(1)中收集的尿液为随机尿液或24h尿液。
优选地，所述步骤(2)中去除尿液中儿茶酚胺类物质的方法为：向尿液中加碱调节pH值至碱性，然后室温放置24小时。
优选地，所述步骤(2)中碱为13～16mol/L NaOH溶液。
优选地，所述13～16mol/L NaOH溶液与尿液的体积比为1：(400～500)。
优选地，所述步骤(3)中加酸调节尿液pH值至6～7。
优选地，所述酸为10～15mol/L HCl溶液。
优选地，所述10～15mol/L HCl溶液与尿液的体积比为1：(400～500)。
优选地，所述步骤(4)中尿液中儿茶酚胺的代谢产物去除方法包括以下步骤：
A、活化和平衡所述弱阳离子交换柱；
B、将步骤(3)获得的尿液过步骤A获得的弱阳离子交换柱；
C、收集步骤(B)获得的尿液。
优选地，所述步骤A中弱阳离子交换柱的填料为经羧基修饰的混合型弱阳离子吸附剂。
经羧基修饰的混合型弱阳离子吸附剂能够提供双重保留模式，即离子交换与反相保留。所述经羧基修饰的混合型弱阳离子吸附剂填料在pH 0～14范围内都很稳定，同时具有很大的结合容量，且只针对于生物基质中的碱性化合物有很好的保留效果，甲氧基肾上腺素类物质刚好符合该特性。
优选地，所述步骤A中先使用甲醇活化所述弱阳离子交换柱，然后使用水平衡所述弱阳离子交换柱。
优选地，所述甲醇与弱阳离子交换柱的体积比为(1～2)：1；所述水与甲醇体积相同。
优选地，所述步骤B中可将步骤(3)获得的尿液分多次上样，每次上样的量可根据弱阳离子交换柱的规格而定。
优选地，收集完所述步骤(4)获得的空白尿液后，可对弱阳离子交换柱进行回收，回收的方法为：待尿液收集完毕后，依次加入1-2倍柱体积的水、甲醇和0.1-0.5％wt甲酸乙腈淋洗小柱，然后使用2-4倍柱体积的2-5％wt甲酸乙腈进一步清洗，最后将弱阳离子交换柱填料浸泡在甲醇中保存供二次利用。
本发明所述弱阳离子交换柱的其中一种制备方法，包括以下步骤：a、取注射器，除去针头与柱塞杆，在靠近注射器针头的底部垫入脱脂棉；b、将弱阳离子填料装填至注射器中；c、在所述弱阳离子填料上部放入一个与注射器圆筒直径相当的滤纸片固定弱阳离子填料，即得所述弱阳离子交换柱。
优选地，所述步骤a中脱脂棉的厚度为1-2mm。
优选地，所述步骤b中弱阳离子填料与注射器柱体积的重量体积比为(0.1～0.2):1。
对所述注射器的规格无限制，可根据需要制备的空白尿液基质的用量和时间来进行任意的调整。
本发明还提供了所述的空白尿液基质在尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物检测中的用途。
优选地，所述尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物的检测方法为液相色谱-串联质谱法。
本发明还提供了一种尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物检测试剂盒，包含所述的空白尿液基质。
优选地，所述试剂盒为液相色谱-串联质谱法检测尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物用试剂盒。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明空白尿液基质同时去除了尿液中内源性化合物儿茶酚胺及其代谢产物甲氧基肾上腺素类物质，本底测试(基质特异性验证)、基质效应均满足要求；(2)本发明空白尿液基质制备简单快速，可操作性强，每3g弱阳离子交换柱填料可制备70-100mL空白尿液，如需大量制备，可一次性装填大规格的弱阳离子交换柱或装填多根小规格的弱阳离子交换柱，可节约大量的时间成本；(3)本发明空白尿液基质制备方法中弱阳离子填料经过适当的处理可重复利用，制备成本低；(4)可实验室自行制作，价格低廉，随用随配。
附图说明
图1为弱阳离子交换柱的外观图及填料装填顺序。
图2为儿茶酚胺及其代谢产物标准物质的总离子流色谱图。
图3为本发明空白尿液基质中多巴胺标准出峰位置与基质特异性色谱图。
图4为本发明空白尿液基质中3-甲氧酪胺标准出峰位置与基质特异性色谱图。
图5为本发明空白尿液基质中去甲肾上腺素标准出峰位置与基质特异性色谱图。
图6为本发明空白尿液基质中肾上腺素标准出峰位置与基质特异性色谱图。
图7为本发明空白尿液基质中甲氧基去甲肾上腺素标准出峰位置与基质特异性色谱图。
图8为本发明空白尿液基质中甲氧基肾上腺素标准出峰位置与基质特异性色谱图。
图9为本发明空白尿液基质儿茶酚胺的总离子流色谱图。
图10为本发明空白尿液基质代谢产物的总离子流色谱图。
图11为对照组市售空白尿液基质中儿茶酚胺的总离子流色谱图。
图12为对照组市售空白尿液基质中代谢产物的总离子流色谱图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本发明空白尿液基质制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)收集尿液：收集3-5个健康人的尿液每人各40-50mL，3000rpm 25℃下离心5分钟，取上清液混匀后备用；
(2)尿液中加碱去除儿茶酚胺类物质：向200mL步骤(1)收集的混合尿液中加入0.5mL的13mol/L NaOH溶液，调节尿液pH值至8-9，室温放置24小时；
(3)向步骤(2)获得的尿液中加入0.5mL的10mol/L HCl溶液，调节pH值至6～7；
(4)使用弱阳离子交换柱吸附去除步骤(3)获得的尿液中儿茶酚胺的代谢产物：A、活化和平衡所述弱阳离子交换柱：取5mL甲醇活化弱阳离子交换柱，待自然滴落完全后，加入5mL的水平衡弱阳离子交换柱，备用；B、将步骤(3)获得的尿液过步骤A获得的弱阳离子交换柱，每次上样量大约为5mL；C、收集步骤(B)获得的尿液：分开收集每次上样后得到的尿液，并分别采用液相色谱-串联质谱对每次上样后得到的尿液基质进行检测，将无待测物检出的空白尿液进行混合，即得所述的空白尿液基质。
所述弱阳离子交换柱如图1所示，其制备方法包括以下步骤：a、将5mL医用规格的注射器除去针头与胶塞，在靠近注射器针头的底部垫入约1-2mm厚的医用脱脂棉；b、称取约0.5g WCX弱阳离子填料，装填至注射器中；c、在WCX弱阳离子填料上部放入一个与注射器圆筒直径相当的滤纸片固定弱阳离子填料，即得所述弱阳离子交换柱。
待所述空白尿液基质制备完成后，可对弱阳离子交换柱进行回收，回收的方法为：待空白尿液收集完毕后，依次分别加入5mL的水、甲醇和0.1％wt甲酸乙腈淋洗弱阳离子交换柱，然后使用10mL的2％wt甲酸乙腈进一步清洗弱阳离子交换柱，最后将弱阳离子交换柱填料浸泡在甲醇中保存供二次利用。
实施例2
本发明空白尿液基质制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)收集尿液：收集3-5个健康人的尿液每人各40-50mL，3000rpm 25℃下离心5分钟，取上清液混匀后备用；
(2)尿液中加碱去除儿茶酚胺类物质：向250mL步骤(1)收集的混合尿液中加入0.5mL的16mol/L NaOH溶液，调节尿液pH值至8-9，室温放置24小时；
(3)向步骤(2)获得的尿液中加入0.5mL的15mol/L HCl溶液，调节pH值至6～7；
(4)使用弱阳离子交换柱吸附去除步骤(3)获得的尿液中儿茶酚胺的代谢产物：A、活化和平衡所述弱阳离子交换柱：取10mL甲醇活化弱阳离子交换柱，待自然滴落完全后，加入10mL的水平衡弱阳离子交换柱，备用；B、将步骤(3)获得的尿液过步骤A获得的弱阳离子交换柱，每次上样量大约为5mL；C、收集步骤(B)获得的尿液：分开收集每次上样后得到的尿液，并分别采用液相色谱-串联质谱对每次上样后得到的尿液基质进行检测，将无待测物检出的空白尿液进行混合，即得所述的空白尿液基质。
所述弱阳离子交换柱的制备方法包括以下步骤：a、将5mL医用规格的注射器除去针头与胶塞，靠近注射器针头的底部垫入约1-2mm厚的医用脱脂棉；b、称取约1g WCX弱阳离子填料，装填至注射器中；c、在WCX弱阳离子填料上部放入一个与注射器圆筒直径相当的滤纸片固定弱阳离子填料，即得所述弱阳离子交换柱。
待所述空白尿液基质制备完成后，可对弱阳离子交换柱进行回收，回收的方法为：待空白尿液收集完毕后，依次分别加入6mL的水、甲醇和0.5％wt甲酸乙腈淋洗弱阳离子交换柱，然后使用12mL的5％wt甲酸乙腈进一步清洗弱阳离子交换柱，最后将弱阳离子交换柱填料浸泡在甲醇中保存供二次利用。
实施例3
(1)收集尿液：收集3-5个健康人的尿液每人各40-50mL，3000rpm 25℃下离心5分钟，取上清液混匀后备用；
(2)尿液中加碱去除儿茶酚胺类物质：向220mL步骤(1)收集的混合尿液中加入0.5mL的14mol/L NaOH溶液，调节尿液pH值至8-9，室温放置24小时；
(3)向步骤(2)获得的尿液中加入0.5mL的12mol/L HCl溶液，调节pH值至6～7；
(4)使用弱阳离子交换柱吸附去除步骤(3)获得的尿液中儿茶酚胺的代谢产物：A、活化和平衡所述弱阳离子交换柱：取7.5mL甲醇活化弱阳离子交换柱，待自然滴落完全后，加入7.5mL的水平衡弱阳离子交换柱，备用；B、将步骤(3)获得的尿液过步骤A获得的弱阳离子交换柱，每次上样量大约为5mL；C、收集步骤(B)获得的尿液：分开收集每次上样后得到的尿液，并分别采用液相色谱-串联质谱对每次上样后得到的尿液基质进行检测，将无待测物检出的空白尿液进行混合，即得所述的空白尿液基质。
所述弱阳离子交换柱的制备方法包括以下步骤：a、将5mL医用规格的注射器除去针头与胶塞，靠近注射器针头的底部垫入约1-2mm厚的医用脱脂棉；b、称取约0.75g WCX弱阳离子填料，装填至注射器中；c、在WCX弱阳离子填料上部放入一个与注射器圆筒直径相当的滤纸片固定弱阳离子填料，即得所述弱阳离子交换柱。
待所述空白尿液基质制备完成后，可对弱阳离子交换柱进行回收，回收的方法为：待空白尿液收集完毕后，依次分别加入10mL的水、甲醇和0.2％wt甲酸乙腈淋洗弱阳离子交换柱，然后使用20mL的3％wt甲酸乙腈进一步清洗弱阳离子交换柱，最后将弱阳离子交换柱填料浸泡在甲醇中保存供二次利用。
实施例4
本实施例以实施例1中的空白尿液基质为例，对本发明提供的空白尿液基质进行本底测试(空白尿液基质特异性)。
利用液相色谱-串联质谱法对实施例1中的空白尿液基质进行检测(不加内标)，对待测化合物和内标物出峰处检出情况进行评估，并与待测化合物标准出峰位置进行对比。所述待测化合物包括多巴胺、3-甲氧酪胺、去甲肾上腺、肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素。
图2为儿茶酚胺及其代谢产物的总离子流色谱图；各待测化合物基质特异性检测详细结果如图3-8所示。结果表明，实施例1制备得到的空白尿液基质在待测化合物及其内标出峰处均无检出。说明实施例1中的空白尿液基质本底测试符合要求，特异性好。本发明其他实施例中的空白尿液基质本底测试结果如本实施例类似，具体数据省略。
实施例5
本实施例以实施例1中的空白尿液基质为例，对本发明提供的空白尿液基质进行基质效应评价。
(一)评价方法
a.收集六个不同来源的病人尿液样本(三男三女)；
b.使用实施例1中制备得到的空白尿液基质溶解高、低两个不同浓度水平的标准溶液；
c.分别将标准溶液和6个不同来源的病人尿液样本按不同比例进行混合得混合样本；
d.将标准溶液、病人尿液样本和混合样本各平行处理3个样，使用液相色谱-串联质谱仪对儿茶酚胺及其代谢产物进行检测。
(二)结果
检测结果如表1所示，混合样本的响应值(待分析物/内标的比值)与病人样本和标准溶液响应均值的差异均小于20％(介于-1.5％～-18.％之间)，说明实施例1中空白尿液基质的基质效应满足要求。本发明其他实施例中的空白尿液基质的基质效应评价结果如本实施例类似，具体数据省略。
表1本发明空白尿液基质效应评价结果
对比例1
为研究本发明空白尿液基质与现有空白尿液基质的差异，分别对本发明制备的空白尿液基质与现有商业化空白尿液基质中的儿茶酚胺及其代谢产物进行检测。
(一)实验方法
设置实验组和对照组，具体如表2所示。其中，对照组中的空白尿液基质为市售产品。
表2实验组别设计
组别 空白尿液基质类型
实验组 实施例1中空白尿液基质
对照组 市售商业化空白尿液基质
分别对表2中的2种空白尿液基质中的儿茶酚胺及其代谢产物进行检测，方法如下：
利用液相色谱-串联质谱法对2种空白尿液基质进行检测，对待测化合物出峰处检出情况进行评估。所述待测化合物包括多巴胺、3-甲氧酪胺、去甲肾上腺、肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素。
(二)实验结果
图9-10为实验组空白尿液基质儿茶酚胺及其代谢产物的总离子流色谱图；图11-12为对照组市售空白尿液基质中儿茶酚胺及其代谢产物的总离子流色谱图。结果表明，实验组和对照组空白尿液基质在待测化合物出峰处均无检出。说明对比例1中实验组空白尿液基质与对照组市售空白尿液基质均符合要求，特异性好，实验组可用于替代对照组，满足临床检测需求的同时，能够节约实验室成本。
最后所应当说明的是，以上实施例和对比例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种空白尿液基质，其特征在于，通过如下制备方法获得：
(1)收集尿液；
(2)向步骤(1)收集的尿液中加碱调节pH值至碱性，去除儿茶酚胺类物质；
(3)向步骤(2)获得的尿液中加酸调节pH值至接近中性；
(4)使用弱阳离子交换柱吸附去除步骤(3)获得的尿液中儿茶酚胺的代谢产物，即得所述空白尿液基质。
2.根据权利要求1所述的空白尿液基质，其特征在于，所述步骤(2)中碱为13～16mol/LNaOH溶液。
3.根据权利要求1所述的空白尿液基质，其特征在于，所述步骤(3)中加酸调节尿液pH值至6～7。
4.根据权利要求3所述的空白尿液基质，其特征在于，所述酸为10～15mol/L HCl溶液。
5.根据权利要求1所述的空白尿液基质，其特征在于，所述步骤(4)中尿液中儿茶酚胺的代谢产物去除方法包括以下步骤：
A、活化和平衡所述弱阳离子交换柱；
B、将步骤(3)获得的尿液过步骤A获得的弱阳离子交换柱；
C、收集步骤(B)获得的尿液。
6.根据权利要求5所述的空白尿液基质，其特征在于，所述步骤A中弱阳离子交换柱的填料为经羧基修饰的混合型弱阳离子吸附剂。
7.根据权利要求5所述的空白尿液基质，其特征在于，所述步骤A中先使用甲醇活化所述弱阳离子交换柱，然后使用水平衡所述弱阳离子交换柱。
8.根据权利要求7所述的空白尿液基质，其特征在于，所述甲醇与弱阳离子交换柱的体积比为(1～2)：1；所述水与甲醇体积相同。
9.根据权利要求1～8任一项所述的空白尿液基质在尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物检测中的用途。
10.一种尿液儿茶酚胺和/或其代谢产物检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～8任一项所述的空白尿液基质。
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