CN109932456A - 检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明检测血液中儿茶酚胺代谢物含量液质分析方法是用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，在该待检测血液处理后，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测的样品进行检测，得到待测血液y1、y2和y3值，将其代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液中儿茶酚胺三种物质的相对浓度x1、x2和x3，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的儿茶酚胺代谢物浓度，本发明血浆经off‑line SPE处理后直接进样，使检测过程简便快速，检测灵敏度高，利于对患者体内儿茶酚胺含量进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及神经类物质的临床含量浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中神经类物质儿茶酚胺代谢物含量的方法。
背景技术
嗜铬细胞瘤是起源于肾上腺髓质，交感神经节，旁交感神经节可分泌过量儿茶酚胺并可出现在肾上腺、膀胱、腹主动脉旁、腹膜后及心脏等的嗜铬组织的肿瘤。由于瘤组织可阵发性或持续性地分泌大量的儿茶酚胺，常出现阵发性或持续性高血压临床症状，并表现多样化，以心血管系统症状为主兼有其他代谢紊乱症群。嗜铬细胞瘤病情凶险，变化剧烈，如不及时治疗易引起心脑血管并发症而导致死亡。因此嗜铬细胞瘤的早期诊断，具有重要的临床意义。
嗜铬细胞瘤早期诊断非常重要，但早期在影像学中较难定位，特别是肾上腺以外包括主动脉旁，膀胱内，直肠后，胸内等部位的瘤体更难发现，而这些部位的嗜铬细胞瘤多数为恶性。嗜铬细胞瘤体大小与儿茶酚胺的释放不成正比，巨大的肿瘤因儿茶酚胺在瘤体内转换速度较慢，降解较充分故释放到血液中的儿茶酚胺较少，在较小的瘤体内，情况则相反。由于肿瘤分泌大量的儿茶酚胺，其代谢产物邻苯二酚胺在周围组织，尤其是肝肾组织中NN甲基转换酶作用下转变为去甲变肾上腺素、变肾上腺素及3-甲氧基酪胺(具体化学结构如下图1、图2、图3所示)，是引起嗜铬细胞瘤患者高血压及一切伴随症状的生化基础，因此，血儿茶酚胺代谢物的测定，成为嗜铬细胞瘤的重要诊断依据。
儿茶酚胺代谢物物质的化学结构特点是：带有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链，在生物样品中儿茶酚胺类物质含量低，儿茶酚胺代谢物质活性的稳定性极差，极易氧化，此外加上生物样品中同时存在的各种结构相似和/或带有相同化学集团的代谢产物的内源性化学干扰物，导致了生物样本中儿茶酚胺代谢物浓度精确测定的困难。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，使儿茶酚胺代谢物含量的测定快速准确，前处理操作简单易行，灵敏度高，精确定量相关物质并且可以广泛适用。
本发明采用的技术方案是：
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：它包括以下步骤：
(一)、标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲变肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲变肾上腺素的浓度为3μg/mL；
精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其变肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；
精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其3-甲氧基酪胺的浓度为1.5μg/mL；
将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸稀释液进行稀释，在含有469-30000pg/mL去甲变肾上腺素、240-15000pg/mL变肾上腺素和240-15000pg/mL的3-甲氧基酪胺的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)标准内标液的配制
取去甲变肾上腺素同位素内标储备液G，其去甲变肾上腺素内标浓度为100μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲变肾上腺素内标的浓度为100ng/mL；
取变肾上腺素同位素内标储备液I，其肾上腺素内标浓度为100μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其变肾上腺素内标的浓度为100ng/mL；
精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其3-甲氧基酪胺内标浓度为68.44μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其3-甲氧基酪胺内标的浓度为100ng/mL；
将内标中间液H、J和K以2:2:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸稀释液进行稀释，得到含有2ng/mL去甲变肾上腺素同位素、1ng/mL变肾上腺素同位素和2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，然后分别用100-300μL1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有2％甲酸和5-85％甲醇的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得至少九组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL血浆于上述离心管中，再加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，依次用100-300μL1:1乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有2％甲酸和含有5-85％甲醇的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的峰面积和其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比y1、y2和y3代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：
含有468.75pg/mL去甲变肾上腺素、含有234.4pg/mL变肾上腺素和含有234.4pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有937.5pg/mL去甲变肾上腺素、含有468.75pg/mL变肾上腺素和含有468.75pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有1875pg/mL去甲变肾上腺素、含有937.5pg/mL变肾上腺素和含有937.5pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有3750pg/mL去甲变肾上腺素、含有1875pg/mL变肾上腺素和含有1875pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有7500pg/mL去甲变肾上腺素、含有3750pg/mL变肾上腺素和含有3750pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有15000pg/mL去甲变肾上腺素、含有7500pg/mL变肾上腺素和含有7500pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有30000pg/mL去甲变肾上腺素、含有15000pg/mL变肾上腺素和含有15000pg/mL3-甲氧基酪胺。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白超声溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成的，在步骤(a)和(b)，所述的溶解液是含有0.1mol/L盐酸的水溶液，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)和(d)中，所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵水溶液，所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵水溶液，所述的洗脱液是由2:5:93的甲酸：甲醇：水组成的洗脱液。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为20μL。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述分析色谱柱的流动相含有95:5比例的水和甲醇，分析色谱柱流速为0.3mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其中：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，血浆样本经off-line SPE前处理后直接进样，整个前处理过程可在30min内完成，效率得到了极大提高，使检测过程简便快速，另外，该方法的检测灵敏度高，均在ppt级别，大大提高了定量结果的准确性，更利于在临床治疗中对患者体内的儿茶酚胺代谢物含量进行监测，为嗜铬细胞瘤的前期诊断提供实验基础。
附图说明
图1为去甲变肾上腺素化学结构式；
图2为变肾上腺素化学结构式；
图3为3-甲氧基酪胺化学结构式；
图4为实施例中标准溶液中儿茶酚胺代谢物三种物质色谱图；
图5为实施例中加标血浆样本中儿茶酚胺三种物质色谱图。
在图4和图5中，标注1为去甲变肾上腺素的色谱峰；标注2为变肾上腺素的色谱峰；标注3为3-甲氧基酪胺的色谱峰；标注4为去甲变肾上腺素同位素内标的色谱峰；标注5为变肾上腺素同位素内标的色谱峰；标注6为3-甲氧基酪胺同位素内标的色谱峰。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，它包括以下步骤：
(一)、标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL，用0.04％甲酸水溶液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲变肾上腺素的浓度为3μg/mL；精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL，用0.04％甲酸水溶液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其变肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL，用0.04％甲酸水溶液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其3-甲氧基酪胺的浓度为1.5μg/mL；将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后，用含有0.04％甲酸水溶液进行稀释，在含有469-30000pg/mL去甲变肾上腺素、240-15000pg/mL变肾上腺素和240-15000pg/mL的3-甲氧基酪胺的浓度范围内配制出七种浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；七种不同浓度的标准工作液分别为：含有468.75pg/mL去甲变肾上腺素、含有234.4pg/mL变肾上腺素和含有234.4pg/mL3-甲氧基酪胺；含有937.5pg/mL去甲变肾上腺素、含有468.75pg/mL变肾上腺素和含有468.75pg/mL3-甲氧基酪胺；含有1875pg/mL去甲变肾上腺素、含有937.5pg/mL变肾上腺素和含有937.5pg/mL3-甲氧基酪胺；含有3750pg/mL去甲变肾上腺素、含有1875pg/mL变肾上腺素和含有1875pg/mL3-甲氧基酪胺；含有7500pg/mL去甲变肾上腺素、含有3750pg/mL变肾上腺素和含有3750pg/mL3-甲氧基酪胺；含有15000pg/mL去甲变肾上腺素、含有7500pg/mL变肾上腺素和含有7500pg/mL3-甲氧基酪胺；含有30000pg/mL去甲变肾上腺素、含有15000pg/mL变肾上腺素和含有15000pg/mL3-甲氧基酪胺；
(b)标准内标液的配制
取去甲变肾上腺素同位素内标储备液G，其去甲变肾上腺素内标浓度为100μg/mL，用含有0.04％甲酸水溶液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲变肾上腺素同位素内标的浓度为100ng/mL；取变肾上腺素同位素内标储备液I，其肾上腺素内标浓度为100μg/mL，用含有0.04％甲酸水溶液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其变肾上腺素同位素内标的浓度为100ng/mL；精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.1mol/L盐酸溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其3-甲氧基酪胺内标浓度为68.44μg/mL，用含有0.04％甲酸水溶液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其3-甲氧基酪胺同位素内标的浓度为100ng/mL；将内标中间液液H、J和L以2:2:1体积比混合后，用甲酸含量为0.04％的水溶液进行稀释，得到含有2ng/mL去甲变肾上腺素同位素、1ng/mL变肾上腺素同位素和2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素浓度的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取七种不同浓度的标准工作液10μL，将上述七种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL 4％牛血清白蛋白分别置于1.5ml离心管中混合制成七种标准溶液，然后加入300μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，并在转速为2000rpm下涡旋混匀1min。用200μL甲醇和200μL水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，然后依次用200μL1:1乙腈与异丙醇和200μL含有20mmol/L乙酸铵水溶液进行洗涤，最后加入100μL含有2％甲酸和含有5％甲醇的水溶液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述七种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，以上述七个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺峰面积与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得二十一组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL的血浆于上述离心管中,再加入300μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，在转速为2000rpm下涡旋混匀1min；用200μL甲醇和200μL水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的全部溶液转移至SPE柱，依次用200μL1:1乙腈与异丙醇和200μL含有20mmol/L乙酸铵的水溶液进行洗涤，最后加入100μL含有2％甲酸和含有5％甲醇的水溶液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100uL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，得出上述待测样品的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺色谱图和其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺峰面积和其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的峰面积之比y1、y2和y3分别代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，在标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺浓度。
样品处理包括：off-line SPE固相萃取装置，off-line SPE固相萃取装置所使用的萃取柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm；off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，萃取柱采用正压模式，气体为纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi；高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为1290Infinity In-lineFilter，所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，设置的柱温为40℃，进样量为20uL，分析色谱柱流动相含有含有95:5比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.3mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式；高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1；所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
本实施例中技术方法论证如下：
该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL含有469-30000pg/mL的去甲变肾上腺素、含有240-15000pg/mL的变肾上腺素和含有240-15000pg/mL的3-甲氧基酪胺的混合标准工作液，加入290μL替代基质混匀，经off-line SPE前处理后进样，去甲变肾上腺素浓度在15.625pg/mL到1000pg/mL、变肾上腺素浓度在7.81pg/mL到500pg/mL、3-甲氧基酪胺浓度在7.81pg/mL到500pg/mL范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：
去甲变肾上腺素：1.34pg/mL；变肾上腺素：0.44pg/mL；3-甲氧基酪胺：0.72pg/mL。
(2)定量限(LOQ)：
去甲变肾上腺素：4.01pg/mL；变肾上腺素：1.31pg/mL；3-甲氧基酪胺：2.17pg/mL。
(3)线性范围：
去甲变肾上腺素在15.625pg/mL到1000pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900；
变肾上腺素在7.81pg/mL到500pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900；
3-甲氧基酪胺在7.81pg/mL到500pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
二、该方法的回收率和精密度
取去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为93.77％～109.04％，相对标准偏差为0.36％～3.21％，表1为去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的加标回收率和精密度。
表1
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中儿茶酚胺三种代谢物含量，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
血清样本中儿茶酚胺三种代谢物色谱图见图5，标准溶液中儿茶酚胺三种代谢物色谱图见图4，去甲变肾上腺素的保留时间为1.793min，变肾上腺素的保留时间为2.134min，3-甲氧基酪胺的保留时间为2.521min，由图4和图5可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)、标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲变肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲变肾上腺素的浓度为3μg/mL；
精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其变肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；
精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其3-甲氧基酪胺的浓度为1.5μg/mL；
将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸稀释液进行稀释，在含有469-30000pg/mL去甲变肾上腺素、240-15000pg/mL变肾上腺素和240-15000pg/mL的3-甲氧基酪胺的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)标准内标液的配制
取去甲变肾上腺素同位素内标储备液G，其去甲变肾上腺素内标浓度为100μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲变肾上腺素内标的浓度为100ng/mL；
取变肾上腺素同位素内标储备液I，其肾上腺素内标浓度为100μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其变肾上腺素内标的浓度为100ng/mL；
精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其3-甲氧基酪胺内标浓度为68.44μg/mL，用含有0.01％-1％甲酸稀释液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其3-甲氧基酪胺内标的浓度为100ng/mL；
将内标中间液H、J和K以2:2:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸稀释液进行稀释，得到含有2ng/mL去甲变肾上腺素同位素、1ng/mL变肾上腺素同位素和2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，然后分别用100-300μL1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有2％甲酸和5-85％甲醇的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得至少九组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL血浆于上述离心管中，再加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，依次用100-300μL1:1乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有2％甲酸和含有5-85％甲醇的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的峰面积和其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比y1、y2和y3代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：
含有468.75pg/mL去甲变肾上腺素、含有234.4pg/mL变肾上腺素和含有234.4pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有937.5pg/mL去甲变肾上腺素、含有468.75pg/mL变肾上腺素和含有468.75pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有1875pg/mL去甲变肾上腺素、含有937.5pg/mL变肾上腺素和含有937.5pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有3750pg/mL去甲变肾上腺素、含有1875pg/mL变肾上腺素和含有1875pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有7500pg/mL去甲变肾上腺素、含有3750pg/mL变肾上腺素和含有3750pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有15000pg/mL去甲变肾上腺素、含有7500pg/mL变肾上腺素和含有7500pg/mL3-甲氧基酪胺；
含有30000pg/mL去甲变肾上腺素、含有15000pg/mL变肾上腺素和含有15000pg/mL3-甲氧基酪胺。
3.如权利要求2所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白超声溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成的，在步骤(a)和(b)，所述的溶解液是含有0.1mol/L盐酸的水溶液，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液。
4.如权利要求3所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和(d)中，所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵水溶液，所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵水溶液，所述的洗脱液是由2:5:93的甲酸：甲醇：水组成的洗脱液。
5.如权利要求4所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCX μElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。
6.如权利要求5所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，KinetexF5，所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为20μL。
7.如权利要求6所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相含有95:5比例的水和甲醇，分析色谱柱流速为0.3mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
8.如权利要求7所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1。
9.如权利要求8所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
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