CN116148387A

CN116148387A - 一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN116148387A
Application number: CN202310112589.3A
Authority: CN
Inventors: 周兵; 吴超超; 高强; 薛建有
Original assignee: Hangzhou Baichen Medical Instrument Co ltd
Current assignee: Hangzhou Baichen Medical Instrument Co ltd
Priority date: 2023-02-14
Filing date: 2023-02-14
Publication date: 2023-05-23

Abstract

本发明公开了一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒，包括：采用肌酐Cre校正，利用丹磺酰氯衍生法将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪进行分离，经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度以及处理数据。本发明选择以随机尿液样本为检测对象，解决临床门诊患者依从度差，收样困难弊端，不增加肌酐检测实验，8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物与丹磺酰氯反应后生成稳定的衍生物，再经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度，本发明的检测方法简单快捷、准确高效，临床应用价值高。

Description

一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，涉及儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测，尤其涉及一种随机尿液样本中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒。

背景技术

高血压可造成脑卒中、心肌梗死、心力衰竭、引发死亡等恶性事件，成为威胁人类健康的主要疾病；继发性高血压约占总高血压10％左右；高血压的诊断评估中需判断高血压的原因，区分原发性或继发性高血压，及时作出高血压病因的鉴别诊断并积极针对病因进行治疗：且新诊断高血压患者应该进行常见的继发性高血压筛查。

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma,PPGL)是继发性高血压的主要原因之一，嗜铬细胞瘤约占总高血压人群1％，至少270万，即每1000个人里面就有1.7个人是嗜铬细胞瘤患者；另一方面，每年新发300万高血压，其中约3万人是嗜铬细胞瘤。嗜铬细胞瘤可引起患者血压升高，造成心、脑、肾等严重并发症，临床表现可为引起持续性(50％)、阵发性高血压(30％)、血压正常(10％)；常伴头痛、心悸、多汗三联征，并伴有糖、脂代谢异常，患者可因长期高血压致严重的心、脑、肾损害或因突发严重高血压而导致危象(出现心、脑、肾等多器官系统功能障碍，如心肌梗塞、心律失常、心源性休克；肺水肿、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；脑血管意外；肾功能衰竭等；严重者导致休克，最终致呼吸、循环衰竭死亡)，危及生命；但如能及时、早期获得诊断和治疗，是一种可治愈的继发性高血压病，约90％的嗜铬细胞瘤可通过手术得以治愈。因而其早期诊断甚为重要；然而美国大型第三方诊断机构梅奥诊所Mayo Clinic尸检结果显示，早期嗜铬细胞瘤误(漏)诊率高达75％，约25％的嗜铬细胞瘤系影像学偶然发现，因此嗜铬细胞瘤的筛查必须采用高灵敏高特异的指标及先进的检测方法。

嗜铬细胞瘤最大的特点是分泌大量的儿茶酚胺及其代谢产物，根据《内科学》高等教育出版社第8版、《中国高血压防治指南》2018版、《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断和治疗临床实践指南》2014版、《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》2020版及重要杂志(如Lancet、N Engl J Med、JAMA)：血、尿儿茶酚胺类及其代谢产物浓度监测是嗜铬细胞瘤筛查、诊断的首选生化指标。

随着技术的不断进步，液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS法由于灵敏度高、特异性强和干扰相对较低、多指标同时分析等优势，被誉为小分子定量分析的金标准，相关专家共识及国内外临床实践指南均建议使用LC-MS/MS法测定儿茶酚胺类物质，降低实验成本、提高检测通量。因而通过LC-MS/MS全面检测儿茶酚胺及代谢物能明显提高嗜络细胞瘤诊断的敏感性和特异性，高效筛查由此引发的继发性高血压等心脑血管疾病。

嗜铬细胞瘤在人体内转移速度较慢，释放到血液中的儿茶酚胺含量较低，但儿茶酚胺最终会通过代谢物的方式以尿的形式排出，患者的尿液中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢物会显著升高，这对嗜铬细胞瘤的准确诊断有较大帮助。由于患者饮水及肾功能代谢水平的差异等原因，会影响患者尿中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物浓度，因此临床上一般以患者24小时尿液作为检测样本。

临床上24小时尿液留样周期较长，儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物等物质极易氧化，稳定性较差；同时取样不便捷，病人依从性较差，不适合门诊检查尤其是门诊检查中的外地患者，因此临床上主要以采血，检测血液中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物。随机尿采样便捷，可改善临床留样流程，随时可取尿液样本，不严格要求定时，缩短检测周期，诊断时间短，同时减少医疗费用支出(如住院床位占用等)。尿中肌酐常用于尿液中非法物质排泄时的浓度校正，以尿中肌酐的含量校正尿液中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物浓度，能降低肾功能、饮水等因素对结果的影响。尿液中肌酐含量较高，每mL尿液中肌酐含量以mg计，而尿液中儿茶酚胺含量为ng水平；肌酐极性大在普通色谱柱上无保留；此外分别测定肌酐及儿茶酚胺浓度会增加检测时长及检测费用。

中国专利申请公布号CN109959738A，发明名称“检测24H尿中儿茶酚胺含量的液质分析方法”针对尿液样本中的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺三种儿茶酚胺进行测定，该专利方法在样本前处理过程中使用到固相萃取技术，增加了方法的成本及时间，且检测指标未涉及儿茶酚胺代谢物及肌酐。

中国专利申请公布号CN113917007A，发明名称“检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢产物的试剂盒及检测方法”对24H尿液中6种儿茶酚胺及中间代谢产物进行测定，该专利方法使用乙醛溶液衍生技术对24H尿液中的6种儿茶酚胺及中间代谢产物进行测定，该专利技术样本前处理简单快捷，儿茶酚胺衍生后状态更为稳定，但是该专利技术未包含儿茶酚胺的最终代谢产物香草扁桃酸、高香草酸进行测定，且试用样本类型为24H尿液样本。

中国专利申请公布号CN10746262647A嗜铬细胞瘤诊断试剂盒及其使用方法，该专利采用固相萃取法测定随机尿液中的3种儿茶酚胺代谢产物及肌酐，固相萃取柱经活化平衡后，将待测样本溶液上样至固相萃取柱，固相萃取柱选择吸附目标成分，通过淋洗将干扰物去除，再用洗脱溶剂将目标物从固相萃取柱洗脱，达到分离和净化的目的，洗脱液经真空浓缩旋干复溶后，经液相色谱仪测定。其缺点在于操作步骤繁琐、耗时较长，包括活化、上样、淋洗、洗脱、旋干等步骤，又未使用内标物质进行定量，这对稳定性较差的儿茶酚胺类物质检测结果有较大影响，且液相色谱法检测通量及定性能力相比三重四级杆质谱均较差。

因此，临床迫切需求一种能同时快速测定随机尿中肌酐及8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种能同时快速测定随机尿中肌酐及8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，利用丹磺酰氯衍生技术将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为较为成稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪将肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物进行分离后，经三重四级杆质谱仪检测。经过一系列实验证明方法的可靠性和稳定性。

本发明还提供了一种能同时快速测定随机尿中肌酐及8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，所述检测方法包括：采用肌酐Cre校正，利用丹磺酰氯衍生法将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪将肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物进行分离后，经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度以及处理数据；其中，所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物为：香草扁桃酸VMA、高香草酸HVA、去甲变肾上腺素NMN、去甲变肾上腺素MN、3-甲氧酪胺3-MT、去肾上腺素NE、去甲变肾上腺素E以及多巴胺DA。

作为本发明的一种优选方案，所述检测方法的具体步骤为：

1)定标曲线配制：配制六种浓度的校准品1-6，每种浓度的校准品中均含所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物以及肌酐；

2)混合内标工作液的配制：配制所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的甲醇溶液混合母液以及肌酐母液，用释放剂A稀释至混合内标工作液；其中，混合内标工作液中8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度为：8μg/mL的VMA-d3，8μg/mL的HVA-d3，100ng/mL的NMN-d3，100ng/mL的MN-d3，500ng/mL的3-MT-d4，100ng/mL的NE-d3，100ng/mL的E-d6与500ng/mL的DA-13C6，混合内标液中肌醇的浓度为50μg/mL的Cre-d3；

3)质控品配制：将经过测试后的人工尿液基质，按照99mL人工尿液，加入1mL浓盐酸，混匀后作为质控基质，加入儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物混合标准品，配制低浓度以及高浓度质控品；

4)样品前处理：中段尿液样本采集；将中段尿液样本、步骤1)的标准品1-6、步骤2)的混合内标工作液、步骤3)的低浓度以及高浓度质控品于离心管中，涡旋混匀，离心，取上清液；向上清液中加入释放剂B与衍生液，涡旋混匀，恒温震荡反应，加入释放剂C涡旋后，高速离心，取上清液；

5)将步骤4)的上清液经相色谱三重四级杆串联质谱检测；

6)数据处理：由仪器自带软件MassLynx采集分析物及其内标的色谱图并正确积分，采用同位素内标法定量，1/x为权重，以各化合物与其同位素内标峰面积之比为纵坐标，各化合物的浓度为横坐标绘制校准工作曲线，用校准曲线校准样本及质控品，得出各化合物的浓度。

作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，所述的释放剂A为0.1％甲酸，50-100％乙腈水溶液。

作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，所述的释放剂B为0.05-0.2％M氢氧化钠溶液，所述的释放剂C为1-10％甲酸水溶液；衍生液为1-10mg/mL丹磺酰氯溶液。

作为本发明的一种优选方案，步骤5)中，液相色谱的色谱参数为：色谱柱：watersBEH C18色谱柱+在线过滤器；流动相：流动相A，流动相B；液相色谱洗脱梯度：0～1.4min2％B，1.4-2.0min 2～40％B，2.0～3.0min 40～55％B，3.0～4.0min 55～65％B，4.0～5.0min 65～80％B，5.0～8.0min 80～95％B，9.0～9.1min 95～2％B，2.5-2.6min 80％B，2.6-3min 80％B；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样：10μL。

作为本发明的一种优选方案，所述的流动相A为10％甲酸1M乙酸铵的水溶液；所述的流动相B为10％甲酸的乙腈溶液。

作为本发明的一种优选方案，步骤5)中，质谱参数为质谱型号为H-class WatersTQD；电离模式：正离子模式；电喷雾毛细管电压：3.2kV；离子源温度：150℃；锥孔电压：40V；锥孔气流速：150L/Hr；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂流速：950L/Hr。

作为本发明的一种优选方案，步骤3)，8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的低质控值分别为：VMA为1.5μg/mL、HVA为1.5μg/mL、NMN为15ng/mL、MN为15ng/mL、3-MT为37.5ng/mL、NE为15ng/mL、E为1.5ng/mL以及DA为75ng/mL，肌酐的低质控值为0.375mg/mL；

8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的高质控值分别为：VMA为12μg/mL、HVA为12μg/mL、NMN为120ng/mL、MN为120ng/mL、3-MT为300ng/mL、NE为120ng/mL、E为36ng/mL以及DA为600ng/mL，肌酐的高质控值为3.0mg/mL。

作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，恒温震荡反应的条件为：温度60℃，转速1000rpm，反应时间10min。

本发明第二方面提供了一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的试剂盒，包括校准品溶液、质控品、混合内标工作液、释放剂A、释放剂B、释放剂C以及衍生液，所述校准品溶液、质控品、混合内标工作液的配制方法如上所述。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明选择以随机尿液样本为检测对象，解决临床门诊患者依从度差，收样困难弊端，采用肌酐校正解决因为患者肾功能代谢及饮水差异等因素对检测结果的影响，不增加肌酐检测实验，8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物与丹磺酰氯反应后生成稳定的衍生物，再经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度，本发明的检测方法简单快捷、准确高效，临床应用价值高。

附图说明

图1是Cre及其同位素内标质谱图。

图2是VMA及其同位素内标质谱图。

图3是HVA及其同位素内标质谱图。

图4是NMN及其同位素内标质谱图。

图5是MN及其同位素内标质谱图。

图6是3-MT及其同位素内标质谱图。

图7是NE及其同位素内标质谱图。

图8是E及其同位素内标质谱图。

图9是DA及其同位素内标质谱图。

图10是肌酐(Cre)定标曲线。

图11是香草扁桃酸(VMA)定标曲线。

图12是高香草酸(HVA)定标曲线。

图13是去甲变肾上腺素(NMN)定标曲线。

图14是变肾上腺素(MN)定标曲线。

图15是3-甲氧基酪胺(3-MT)定标曲线。

图16是去甲肾上腺素(NE)定标曲线。

图17是肾上腺素(E)定标曲线.

图18是多巴胺(DA)定标曲线。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

一、肌酐及儿茶酚胺及其代谢产物定标曲线配制

表1.随机尿儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物标准品组成

原料	配置体积/mL	溶剂	计算重量/mg
				肌酐(Cre)	10	水	1000
香草扁桃酸(VMA)	10	甲醇	10
				高香草酸(HVA)	10	甲醇	10
去甲变肾上腺素(NMN)	10	甲醇0.1M HCl	10
				去甲变肾上腺素(MN)	10	甲醇0.1M HCl	10
3甲氧酪胺(3-MT)	10	甲醇0.1M HCl	10
				去肾上腺素(NE)	10	甲醇0.1M HCl	10
去甲变肾上腺素(E)	10	甲醇0.1M HCl	10
				多巴胺(DA)	10	甲醇0.1M HCl	10

取表1中的原料，称取对应重量分别放入干净烧杯中，用对应溶剂溶解后转移至10mL容量瓶定容至10mL，混匀。制得各标准品母液。使用0.1M盐酸水配制成表2的混合标准曲线。

表2.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物定标曲线浓度

表3.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物内标母液配制方法

简称	原料使用量/mg	溶剂	配制体积/mL	母液浓度mg/mL
					Cre-d3	10	水	2	5.0
VMA-d3	1	甲醇	1	1.0
					HVA-d3	1	甲醇	1	1.0
NMN-d3	1	甲醇0.1M HCl	1	1.0
					MN-d3	1	甲醇0.1M HCl	1	1.0
3-MT-d4	1	甲醇0.1M HCl	1	1.0
					NE-d6	0.1	甲醇0.1M HCl	1	0.1
E-d6	0.1	甲醇0.1M HCl	1	0.1
					DA-13C6	1	甲醇0.1M HCl	1	1.0

表4.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物混合内标浓度

按表3配制儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物内标母液，使用时，按照表4的浓度，将儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物内标母液用释放剂A稀释20倍配制成儿茶酚胺及儿茶酚胺混合内标工作液。

二、儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物质控品配置

将经过测试后的人工尿液基质，按照99mL人工尿液，加入1mL浓盐酸，混匀后作为质控基质，加入儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物混合标准品，配制低、高浓度质控品，见表5，所有质控品均用1.5mL离心管分装，每管80μL，装入100孔冻存盒中，-80℃低温保存。

表5.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物质控靶值表

三、流动相配制

流动相A：10％甲酸1M乙酸铵的水溶液：取0.77g乙酸铵加入9mL纯净水和1mL甲酸的混合配置。使用时用纯净水稀释100倍。

流动相B：10％甲酸的乙腈溶液：取9mL乙腈和1mL甲酸的混合配置。使用时用乙腈稀释100倍。

四、试剂盒配制

使用佰辰医疗产品试剂盒，试剂盒主要成分如下：

1.释放剂A：0.1％甲酸，50～100％乙腈水溶液；

2.释放剂B：0.05～0.2％M氢氧化钠溶液；

3.释放剂C：1～10％甲酸水溶液；

4.衍生液：1～10mg/mL丹磺酰氯溶液；.

5.混合内标工作液；

6.校准品溶液；

7.质控品

五、样品前处理

1)样本采集：遵循医嘱在采样前不得服用任何含有儿茶酚胺的食物及饮料，不进行剧烈运动，保持日常生活方式，使用采尿管收集中段尿液。

2)提取：用移液器吸取采集到的中段尿液样本、标准品1-6，低高质控50μL于1.5mL离心管中，分别加入450μL儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物混合内标工作液，涡旋混匀3min，11000rpm离心3min，取100μL上清至另一洁净1.5mL离心管。

3)衍生：向盛有100μL上述提取液的离心管中加入50μL释放剂B，再加入50μL衍生液，涡旋混匀10秒；于60℃1000rpm振荡仪上恒温震荡反应10min；然后再加入30μL释放剂C涡旋10秒后于高速离心机上11000rpm离心3min，然后移取150μL上清液至96孔板经经液相色谱三重四级杆串联质谱检测。

六、样本检测

色谱参数：1、色谱柱：waters BEH C18色谱柱+在线过滤器；2、流动相：流动相A，流动相B；3、液相色谱洗脱梯度：0～1.4min 2％B，1.4-2.0min 2～40％B，2.0～3.0min 40～55％B，3.0～4.0min 55～65％B，4.0～5.0min 65～80％B，5.0～8.0min 80～95％B，9.0～9.1min 95～2％B，2.5-2.6min 80％B，2.6-3min 80％B。流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样：10μL。

质谱参数：质谱型号为H-class Waters TQD；电离模式：正离子模式；电喷雾毛细管电压：3.2kV；离子源温度：150℃；锥孔电压：40V；锥孔气流速：150L/Hr；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂流速：950L/Hr；表6为各化合物多反应监测参数。

表6.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物多反应监测(MRM)

七、数据处理

由仪器自带软件MassLynx采集分析物及其内标的色谱图并正确积分，采用同位素内标法定量，1/x为权重，以各化合物与其同位素内标峰面积之比为纵坐标，各化合物的浓度为横坐标绘制校准工作曲线，用校准曲线校准样本及质控品，得出各化合物的浓度。

八、精密度

分别检测低、高2个浓度水平样品浓度，每天各进行3次重复，连续测5天。

九、正确度验证

选择实际病人尿液作为回收实验基础样品，按照50μL低、中、高标准样品分别与450μL的基础样品混合，如表7所示，要求：低浓度为线性范围下限的3倍；中浓度为线性范围中间浓度；高浓度为线性范围上限的70％。将上述“基础样品”和“实验样品”重复平行测定6次，记录实验结果并进行统计分析低、中、高3个浓度水平的加标回收情况，回收率＝(检测值-基础样品值)/理论值×100％，85％＜回收率＜115％。

表7.加标回收配制表

十、定量下限

定量下限为LC-MS/MS方法在满足实验室对准确度和精密度要求的前提下检测出的目标分析物的最低值。定量下限选择3个浓度接近检测限的样本，每个浓度样本分为5份进行处理，每份样本重复测定3次，连续测定3个批次，分别评估每个浓度样本的总精密度(CV)及其浓度测定均值与理论浓度的偏差，将CV≤20％、偏倚<15％的最低浓度样本的测定均值作为方法的定量下限。

实验结果

肌酐与儿茶酚胺及儿茶酚儿茶酚胺代谢产物及其内标的质谱图如图1-图9所示。

儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物定标曲线结果

肌酐与8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物化合物的保留时间及线性范围如表8所示，线性图如图10-图18所示，从实验结果可见，肌酐及各儿茶酚类化合物的相关系数均大于0.99，表示线性区间可接受，符合实际实验要求。本实验以120例临床实际尿液样本的结果为依据设置线性范围，而未设置更广的线性范围。

表8.各化合物保留时间和线性结果

低浓度水平各化合物的精密度如表9所示，高浓度水平的精密度如表10所示，从表9-10得知，低高浓度的批内与批间精密度均小于6.25％(实验项目允许总误差TEa＝25％),结果显示本实验方法精密度符合临床对精密度的要求。

表9.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物低浓度精密度验证结果

表10.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物高浓度精密度验证结果

加标回收实验结果如表11所示，回收实验的判定标准为：80％＜低浓度平均回收率＜120,85％＜中、高浓度平均回收率＜115％为正确度验证通过，由表11可知，本实验方法准确可靠。

表11.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物回收率

通过Waters TQD测试各化合物的定量下限见表12。120例临床样本各化合物检测结果远高于其定量下限，表明本实验方法满足临床样本检测需求。

表12.儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物定量下限

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：采用肌酐Cre校正，利用丹磺酰氯衍生法将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪将肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物进行分离后，经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度以及处理数据；其中，所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物为：香草扁桃酸VMA、高香草酸HVA、去甲变肾上腺素NMN、去甲变肾上腺素MN、3-甲氧酪胺3-MT、去肾上腺素NE、去甲变肾上腺素E以及多巴胺DA。

2.根据权利要求1所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤为：

5)将步骤4)的上清液经相色谱三重四级杆串联质谱检测；

3.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述的释放剂A为0.1％甲酸，50-100％乙腈水溶液。

4.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述的释放剂B为0.05-0.2％M氢氧化钠溶液，所述的释放剂C为1-10％甲酸水溶液；衍生液为1-10mg/mL丹磺酰氯溶液。

5.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤5)中，液相色谱的色谱参数为：色谱柱：waters BEH C18色谱柱+在线过滤器；流动相：流动相A，流动相B；液相色谱洗脱梯度：0～1.4min 2％B，1.4-2.0min 2～40％B，2.0～3.0min 40～55％B，3.0～4.0min 55～65％B，4.0～5.0min 65～80％B，5.0～8.0min 80～95％B，9.0～9.1min 95～2％B，2.5-2.6min 80％B，2.6-3min 80％B；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样：10μL。

6.根据权利要求5所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，所述的流动相A为10％甲酸1M乙酸铵的水溶液；所述的流动相B为10％甲酸的乙腈溶液。

7.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤5)中，质谱参数为质谱型号为H-class Waters TQD；电离模式：正离子模式；电喷雾毛细管电压：3.2kV；离子源温度：150℃；锥孔电压：40V；锥孔气流速：150L/Hr；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂流速：950L/Hr。

8.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤3)，8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的低质控值分别为：VMA为1.5μg/mL、HVA为1.5μg/mL、NMN为15ng/mL、MN为15ng/mL、3-MT为37.5ng/mL、NE为15ng/mL、E为1.5ng/mL以及DA为75ng/mL，肌酐的低质控值为0.375mg/mL；

9.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤4)中，恒温震荡反应的条件为：温度60℃，转速1000rpm，反应时间10min。

10.一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的试剂盒，其特征在于，包括校准品溶液、质控品、混合内标工作液、释放剂A、释放剂B、释放剂C以及衍生液，所述校准品溶液、质控品、混合内标工作液的配制方法如权利要求2中所述。