CN109959739A - 检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法是用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，在该待检测血液经过处理后，同样用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测的样品进行检测，得到待测血液y1、y2和y3值，将其代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液中儿茶酚胺三种物质的相对浓度x1、x2和x3，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液中的儿茶酚胺三种物质浓度，本发明血浆经off‑line SPE处理后直接进样，使检测过程简便快速，检测灵敏度高，利于对患者体内儿茶酚胺含量进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及神经类物质的临床含量浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中神经类物质儿茶酚胺含量的方法。
背景技术
嗜铬细胞瘤是起源于肾上腺髓质，交感神经节，旁交感神经节可分泌过量儿茶酚胺(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺，具体化学结构如下图1、图2、图3所示)并可出现在肾上腺、膀胱、腹主动脉旁、腹膜后及心脏等的嗜铬组织的肿瘤。由于瘤组织可阵发性或持续性地分泌大量的儿茶酚胺，常出现阵发性或持续性高血压临床症状，并表现多样化，以心血管系统症状为主兼有其他代谢紊乱症群。嗜铬细胞瘤病情凶险，变化剧烈，如不及时治疗易引起心脑血管并发症而导致死亡。因此嗜铬细胞瘤的早期诊断，具有重要的临床意义。
嗜铬细胞瘤早期诊断非常重要，但早期在影像学中较难定位，特别是肾上腺以外包括主动脉旁，膀胱内，直肠后，胸内等部位的瘤体更难发现，而这些部位的嗜铬细胞瘤多数为恶性。嗜铬细胞瘤体大小与儿茶酚胺的释放不成正比，巨大的肿瘤因儿茶酚胺在瘤体内转换速度较慢，降解较充分故释放到血液中的儿茶酚胺较少，在较小的瘤体内，情况则相反。由于肿瘤分泌大量的儿茶酚胺，其代谢产物邻苯二酚胺在周围组织，尤其是肝肾组织中NN甲基转换酶作用下转变为去甲变肾上腺素及变肾上腺素，是引起嗜铬细胞瘤患者高血压及一切伴随症状的生化基础，因此，血儿茶酚胺的测定，成为嗜铬细胞瘤的重要诊断依据。
儿茶酚胺物质的化学结构特点是：带有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链，在生物样品中儿茶酚胺类物质含量极低，多数文献报道实际生物样品中儿茶酚胺含量极微，儿茶酚胺物质活性的稳定性极差，极易氧化，此外加上生物样品中同时存在的各种结构相似和/或带有相同化学集团的代谢产物的内源性化学干扰物，导致了生物样本中儿茶酚胺浓度精确测定的困难，高选择性且高灵敏度地测定生物样本中某一种特定的儿茶酚胺类物质，例如精确测定血清中去甲肾上腺素和/或肾上腺素，是目前临床尚难以达到的目标。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，使儿茶酚胺含量的测定快速准确，前处理操作简单易行，灵敏度高，精确定量相关物质并且可以广泛适用。
本发明采用的技术方案是：
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)标准工作液的配制：
精确称取去甲肾上腺素标准品3.2mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲肾上腺素的浓度为1324.5μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲肾上腺素的浓度为6μg/mL；
精确称取肾上腺素标准品2.80mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其肾上腺素的浓度为1400μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；
精确称取多巴胺标准品1.15mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其多巴胺的浓度为928.9μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其多巴胺的浓度为300ng/mL；
将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行稀释，在含有940-60000pg/mL去甲肾上腺素、240-15000pg/mL肾上腺素和50-3000pg/mL多巴胺的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)、标准内标液的配制
精确称取去甲肾上腺素同位素内标标准品1.529mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液G，其去甲肾上腺素同位素的浓度为650μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲肾上腺素同位素内标的浓度为1.35μg/mL；
精确称取肾上腺素同位素内标标准品1.4mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液I，其肾上腺素同位素的浓度为700μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其肾上腺素同位素内标的浓度为300ng/mL；
精确称取多巴胺同位素内标标准品5.78mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其多巴胺同位素的浓度为2348.6μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其多巴胺同位素内标的浓度为500ng/mL；
将内标中间液H、J和L以2:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行稀释，得到含有27ng/mL去甲肾上腺素同位素、含有3ng/mL肾上腺素同位素和含有5ng/mL多巴胺同位素浓度的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取至少三种不同浓度的标准工作液10μL，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min；用100-300μL含有0.5％-2％甲醇的水溶液对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，依次加入100-300μL含有1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵水溶液的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.5％-4％甲酸的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的色谱图及其对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的峰面积和对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度与对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得至少九组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL的血浆于上述离心管中，加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，用100-300μL含有0.5％-2％甲醇的水溶液对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，依次加入100-300μL含有1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵水溶液的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.5％-4％甲酸的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的色谱图及其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的峰面积与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素峰面积之比y1、y2和y3，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，，标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：
含有937.5pg/mL去甲肾上腺素、含有234.4pg/mL肾上腺素和含有46.875pg/mL多巴胺；
含有1875pg/mL去甲肾上腺素、含有468.75pg/mL肾上腺素和含有93.75pg/mL多巴胺；
含有3750pg/mL去甲肾上腺素、含有937.5pg/mL肾上腺素和含有187.5pg/mL多巴胺；
含有7500pg/mL去甲肾上腺素、含有1875pg/mL肾上腺素和含有375pg/mL多巴胺；
含有15000pg/mL去甲肾上腺素、含有3750pg/mL肾上腺素和含有750pg/mL多巴胺；
含有30000pg/mL去甲肾上腺素、含有7500pg/mL肾上腺素和含有1500pg/mL多巴胺；
含有60000pg/mL去甲肾上腺素、含有15000pg/mL肾上腺素和含有3000pg/mL多巴胺。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成的；在步骤(a)和(b)中，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：在步骤(c)和步骤(d)中，所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵的水溶液；所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵的水溶液，所述洗脱液是由0.5:99.5的甲酸和水组成的洗脱液。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：所述off-lineSPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElutionPlate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为20μL。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：所述分析色谱柱的流动相为含有98:2比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲肾上腺素152.1-107；肾上腺素184.1-107.1；多巴胺154.1-91.1。
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其中：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，血浆样本经off-lineSPE前处理后直接进样，整个前处理过程可在30min内完成，效率得到了极大提高，使检测过程简便快速，另外，该方法的检测灵敏度高，均在ppt级别，大大提高了定量结果的准确性，更利于在临床治疗中对患者体内的儿茶酚胺含量进行监测，为嗜铬细胞瘤的前期诊断提供实验基础。
附图说明
图1为去甲肾上腺素化学结构式；
图2为肾上腺素化学结构式；
图3为多巴胺化学结构式；
图4为实施例中标准溶液中儿茶酚胺三种物质色谱图；
图5为实施例中加标血浆样本中儿茶酚胺三种物质色谱图。
在图4和图5中，标注1为去甲肾上腺素的色谱峰；标注2为肾上腺素的色谱峰；标注3为多巴胺的色谱峰；标注4为去甲肾上腺素同位素内标的色谱峰；标注5为肾上腺素同位素内标的色谱峰；标注6为多巴胺同位素内标的色谱峰。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本发明的一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，它包括以下步骤：
(一)、标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲肾上腺素标准品3.2mg置于2mL容量瓶中，用含有0.04％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲肾上腺素的浓度为1324.5μg/mL，用0.04％甲酸水溶液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲肾上腺素的浓度为6μg/mL；精确称取肾上腺素标准品2.80mg置于2mL容量瓶中，用含有0.04％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其肾上腺素的浓度为1400μg/mL，用0.04％甲酸水溶液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；精确称取多巴胺标准品1.15mg置于2mL容量瓶中，用含有0.04％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其多巴胺的浓度为928.9μg/mL，用0.04％甲酸水溶液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其多巴胺的浓度为300ng/mL；将标准中间液B、D和F以1:1:1体积比混合后，用含有0.04％甲酸水溶液进行稀释，在含有940-60000pg/mL去甲肾上腺素、240-15000pg/mL肾上腺素和50-3000pg/mL多巴胺的浓度范围内配制出七种浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存，七种不同浓度的标准工作液分别为：含有937.5pg/mL去甲肾上腺素、含有234.4pg/mL肾上腺素和含有46.875pg/mL多巴胺；含有1875pg/mL去甲肾上腺素、含有468.75pg/mL肾上腺素和含有93.75pg/mL多巴胺；含有3750pg/mL去甲肾上腺素、含有937.5pg/mL肾上腺素和含有187.5pg/mL多巴胺；含有7500pg/mL去甲肾上腺素、含有1875pg/mL肾上腺素和含有375pg/mL多巴胺；含有15000pg/mL去甲肾上腺素、含有3750pg/mL肾上腺素和含有750pg/mL多巴胺；含有30000pg/mL去甲肾上腺素、含有7500pg/mL肾上腺素和含有1500pg/mL多巴胺；含有60000pg/mL去甲肾上腺素、含有15000pg/mL肾上腺素和含有3000pg/mL多巴胺；
(b)、标准内标液的配制
精确称取去甲肾上腺素同位素内标标准品1.529mg于2mL容量瓶中，用含有0.04％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液G，其去甲肾上腺素内标浓度为650μg/mL，用含有0.04％甲酸水溶液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲肾上腺素同位素内标的浓度为1.35μg/mL；精确称取肾上腺素同位素内标标准品1.4mg于2mL容量瓶中，用含有0.04％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液I，其肾上腺素内标浓度为700μg/mL，用含有0.04％甲酸水溶液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其肾上腺素同位素内标的浓度为300ng/mL；精确称取多巴胺同位素内标标准品5.78mg于2mL容量瓶中，用含有0.04％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其多巴胺内标浓度为2348.6μg/mL，用含有0.04％甲酸水溶液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其多巴胺同位素内标的浓度为500ng/mL，将内标中间液H、J和L以2:1:1体积比混合后，用含有0.04％甲酸水溶液进行稀释，得到含有27ng/mL去甲肾上腺素同位素、3ng/mL肾上腺素同位素和5ng/mL多巴胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取七种不同浓度的10μL标准工作液，将上述七种不同浓度标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL的4％牛血清白蛋白分别置于1.5ml离心管中混合制成七种标准溶液，然后加入300μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，并在转速为2000rpm下涡旋混匀1min；分别用200μL甲醇和200μL含有2％甲酸的水溶液对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部溶液转移至SPE柱，然后，依次用200μL1:1的乙腈与异丙醇和200μL含有20mmol/L乙酸铵水溶进行洗涤，最后加入100μL含有0.5％甲酸水溶液的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100uL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述七种标准溶液中的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺色谱图及其对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，以上述七个标准溶液的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺峰面积和对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度与对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得二十一组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)、检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)、待测样品处理
(c)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL的血浆于上述离心管中，再加入300μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，在转速为2000rpm下涡旋混匀1min；分别用200μL甲醇和200μL含有2％甲酸水溶液对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液全部溶液转移至SPE柱，再依次用200μL1:1的乙腈与异丙醇和200μL含有20mmol/L乙酸铵的水溶液进行洗涤，最后加入100μL含有0.5％甲酸水溶液的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(c)待测样品100uL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺色谱图及其对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺峰面积和其对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的峰面积之比y1、y2和y3，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中的去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，，标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度。
样品处理包括：off-line SPE固相萃取装置，off-line SPE固相萃取装置所使用的萃取柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm；off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi；高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为1290Infinity In-lineFilter，所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，设置的柱温为40℃，进样量为20uL，分析色谱柱流动相含有含有98:2比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式；高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲肾上腺素152.1-107；肾上腺素184.1-107.1；多巴胺154.1-91.1；含甲酸量为体积比的含甲酸量。
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度(940-60000pg/mL)的去甲肾上腺素、(240-15000pg/mL)的肾上腺素、(50-3000pg/mL)的多巴胺的混合标准工作液，加入290μL替代基质混匀，经off-line SPE前处理后进样，去甲肾上腺素浓度在31.25pg/mL到2000pg/mL、肾上腺素浓度在7.81pg/mL到500pg/mL、多巴胺浓度在1.56pg/mL到100pg/mL范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：
去甲肾上腺素：8.20pg/mL；肾上腺素：0.73pg/mL；多巴胺：0.50pg/mL。
(2)定量限(LOQ)：
去甲肾上腺素：24.60pg/mL；肾上腺素：2.11pg/mL；多巴胺：1.49pg/mL。
(3)线性范围：
去甲肾上腺素在31.25pg/mL到2000pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900；
肾上腺素在7.81pg/mL到500pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900；
多巴胺在1.56pg/mL到100pg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。
二、该方法的回收率和精密度
取去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为93.77％～109.04％，相对标准偏差为0.36％～3.21％，表1为去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的加标回收率和精密度。
表1
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中儿茶酚胺含量，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
血浆样本中儿茶酚胺色谱图见图5，标准溶液中儿茶酚胺色谱图见图4，去甲肾上腺素的保留时间为1.793min，肾上腺素的保留时间为2.134min，多巴胺的保留时间为2.521min，由图4和图5可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)、标准溶液的标定
(a)、标准工作液的配制：
精确称取去甲肾上腺素标准品3.2mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲肾上腺素的浓度为1324.5μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲肾上腺素的浓度为6μg/mL；
精确称取肾上腺素标准品2.80mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其肾上腺素的浓度为1400μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；
精确称取多巴胺标准品1.15mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其多巴胺的浓度为928.9μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其多巴胺的浓度为300ng/mL；
将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行稀释，在含有940-60000pg/mL去甲肾上腺素、240-15000pg/mL肾上腺素和50-3000pg/mL多巴胺的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)、标准内标液的配制
精确称取去甲肾上腺素同位素内标标准品1.529mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液G，其去甲肾上腺素同位素的浓度为650μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲肾上腺素同位素内标的浓度为1.35μg/mL；
精确称取肾上腺素同位素内标标准品1.4mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液I，其肾上腺素同位素的浓度为700μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其肾上腺素同位素内标的浓度为300ng/mL；
精确称取多巴胺同位素内标标准品5.78mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其多巴胺同位素的浓度为2348.6μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其多巴胺同位素内标的浓度为500ng/mL；
将内标中间液H、J和L以2:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行稀释，得到含有27ng/mL去甲肾上腺素同位素、含有3ng/mL肾上腺素同位素和含有5ng/mL多巴胺同位素浓度的标准内标液，并在-80℃条件下保存；
(c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：
用移液枪分别移取至少三种不同浓度的标准工作液10μL，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min；用100-300μL含有0.5％-2％甲醇的水溶液对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，依次加入100-300μL含有1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵水溶液的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.5％-4％甲酸的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的色谱图及其对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的峰面积和对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度与对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得至少九组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f并且得出权重系数a、b、c、d、e和f；
(二)、检测血液的离心
取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL的血浆于上述离心管中，加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，用100-300μL含有0.5％-2％甲醇的水溶液对off-lineSPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，依次加入100-300μL含有1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵水溶液的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.5％-4％甲酸的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的色谱图及其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的峰面积与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素峰面积之比y1、y2和y3，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝a*x 1+b、y2＝c*x2+d和y3＝e*x3+f中，通过计算得到待检测样品中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，，标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：
含有937.5pg/mL去甲肾上腺素、含有234.4pg/mL肾上腺素和含有46.875pg/mL多巴胺；
含有1875pg/mL去甲肾上腺素、含有468.75pg/mL肾上腺素和含有93.75pg/mL多巴胺；
含有3750pg/mL去甲肾上腺素、含有937.5pg/mL肾上腺素和含有187.5pg/mL多巴胺；
含有7500pg/mL去甲肾上腺素、含有1875pg/mL肾上腺素和含有375pg/mL多巴胺；
含有15000pg/mL去甲肾上腺素、含有3750pg/mL肾上腺素和含有750pg/mL多巴胺；
含有30000pg/mL去甲肾上腺素、含有7500pg/mL肾上腺素和含有1500pg/mL多巴胺；
含有60000pg/mL去甲肾上腺素、含有15000pg/mL肾上腺素和含有3000pg/mL多巴胺。
3.如权利要求2所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成的；在步骤(a)和(b)中，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液。
4.如权利要求3所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和步骤(d)中，所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵的水溶液；所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵的水溶液，所述洗脱液是由0.5:99.5的甲酸和水组成的洗脱液。
5.如权利要求4所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。
6.如权利要求5所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为20μL。
7.如权利要求6所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相为含有98:2比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
8.如权利要求7所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲肾上腺素152.1-107；肾上腺素184.1-107.1；多巴胺154.1-91.1。
9.如权利要求8所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
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