CN113866315A - 液质联用技术检测大鼠血浆yg-18血药浓度的定量分析方法 - Google Patents

Abstract

液质联用技术检测大鼠血浆YG‑18血药浓度的定量分析方法，本发明属于药物分析学临床前药代动力学技术领域，包括以下步骤，在YG‑18给药后的SD大鼠血浆中，依次加入乙腈和内标工作液，涡旋离心后取上清用流动相溶解后进样，所述内标工作液为乙氧苯柳胺的乙腈溶液；采用液质联用技术，乙腈‑甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，Alltima C18色谱柱进行色谱分离，进行定量分析。该方法专属性强，灵敏度高，样品取样量少，预处理简单、快速，分析周期短，经方法学验证此方法准确可靠，适用于SD大鼠血浆中YG‑18药物浓度测定和药代动力学研究。

Description

液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法

技术领域

本发明属于药物分析学临床前药代动力学技术领域，尤其涉及液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法(基于HPLC-MS/MS技术检测SD大鼠血浆中新型α-葡萄糖苷酶抑制剂YG-18血药浓度的定量分析方法)，HPLC-MS/MS为高效液相色谱仪-质谱/质谱。

背景技术

传统上对于α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发与研究大多基于其拟糖骨架结构，例如亚胺糖、硫糖或二糖等结构。然而，传统的研究开发面临着诸多问题，比如活性差、自然丰度低和立体化学过于复杂等。因此，对于非糖α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发具有广阔前景。将苯磺酰胺查尔酮结构整合到苯并吡喃中，设计得到的3-[4-(苯基磺酰胺)苯甲酰]-2H-1-苯并吡喃-2-酮结构，具有成为非糖α-葡萄糖苷酶抑制剂的巨大潜力。在之前的研究中，该系列化合物中体外活性最强的化合物YG-18的半数抑制浓度(IC50)可以达到0.014±0.003μmol·L^-1。

化合物YG-18的制备方法可参阅申请日为2012-05-29、申请号为201210169320.0、专利名称为“具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的2H-1-苯并吡喃-2-酮类化合物及其药用组合物”的发明专利，YG-18为该专利中序号为39的化合物，为方便于区分，采用YG-18为该化合物代号。从该专利文中可知，YG-18的化学名称是3-[4-(4-溴苯磺酰基)氨基]苯甲酰基-2H-1-苯并吡喃-2-酮，化学结构式如图1所示，由于YG-18是创新药物，其生物样品中药物浓度的测定方法国内外尚无文献报道，为了能够开展关于其在体内的吸收、分布、代谢和排泄有关特征的药代动力学研究，有必要建立一个灵敏度高、方便快捷的YG-18血药浓度定量分析方法。

发明内容

本发明目的在于提供液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，操作简便、快速、血浆用量少、专属性强、准确度高、重现性好且得到满意的峰形。

为实现上述目的，采用了以下技术方案：

(1)血浆样品预处理。

血浆样品采集于7-9周、体重为200g±20g的体成熟SD大鼠(Sprague Dawley，美国，斯泼雷格多雷)，经眼眶静脉丛下取血0.2mL，离心取上层血浆制成，取样量为100μL。

在EP管中依次加入乙腈10μL、乙氧苯柳胺(IS，internal standard)的乙腈溶液10μL和采集的血浆样品20μL，涡旋3min后加入40μL乙腈后再涡旋2min，以13000r·min^-1高速离心机离心8min，移出20μL上清液并加入180μL流动相(流动相A和流动相B各90μL，混合)，涡旋2min充分混合均匀，移入进样瓶。

EP管是一种小型离心管，又称eppendorf管，艾本德管。

(2)样品分离。

采用Alltima C18色谱柱(100×4.6mm，3μm)进行成分分离，流速为0.7mL·min^-1，柱温为35℃，通用型二元泵与自动进样器进行样品分离，每次进样量为20μL；内标化合物(IS)为乙氧苯柳胺；流动相A是浓度为0.1％(体积)的甲酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈，采用梯度洗脱，洗脱梯度程序见表1。

表1洗脱梯度程序

时间(min)	A(体积％)	B(体积％)
			0	50	50
2	10	90
			6	10	90
7	50	50
			12	50	50

Alltima C18色谱柱，奥泰碳18色谱柱(型号：Alltima)。

(3)样品检测。

设备为Agilent Ultivo三重四级杆串联质谱仪，离子源采用ESI离子源，应用多反应监测模式(MRM)进行负离子模式检测。定量分析的离子反应分别为：YG-18：m/z 484→416.1，乙氧苯柳胺(IS)：m/z 256→227；碰撞能量分别为：YG-18：35eV，乙氧苯柳胺(IS)：17eV；Fragmentor(毛细管电压)分别为：YG-18：160V，乙氧苯柳胺(IS)：95V。

Agilent Ultivo三重四级杆串联质谱仪，安捷伦三重四级杆串联质谱仪(型号：Ultivo)。

ESI离子源为电喷雾离子源。

MRM为质谱多反应监测。

即，将预处理的SD大鼠血浆样品在混合流动相梯度洗脱下，经高效液相色谱柱分离后，采用二级质谱检测器检测。

其优点在于：

1、采样量少：测定一份样品只需0.2mL血浆样本，样品预处理取样只需20μL。

2、预处理简便：样品只需乙腈沉淀蛋白，涡旋混合后加入流动相即可检测。

3、灵敏度高：通过二级质谱检测，明显提高测定的检测灵敏度，最低定量限为3ng·mL^-1。

4、线性范围跨度大：YG-18的线性范围为3-2000ng·mL^-1，能够很好地满足药物在体内动态分析变化的测定。

5、选择性强；空白血浆中的内源性物质不干扰药物和内标的测定。

6、回收率稳定：日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于15％，符合生物样品测定要求。

7、测定时间短：整个色谱分析测定过程为12min。

8、该方法专属性强，灵敏度高，样品取样量少，预处理简单、快速，分析周期短，经方法学验证此方法准确可靠，适用于SD大鼠血浆中YG-18药物浓度测定和药代动力学研究。

附图说明

图1是本发明方法中YG-18的化学结构式。

图2是本发明方法实施例中YG-18的质谱扫描图。

图3是三种情况的离子检测色谱图。

A部分是本发明方法实施例中空白血浆的离子检测色谱图。

B部分是本发明方法实施例中空白血浆中加入YG-18(150ng·mL^-1)的离子检测色谱图。

C部分是本发明方法实施例中实际血浆样品的离子检测色谱图。

图4是SD大鼠血浆中YG-18浓度测定的标准曲线。

图5是图3中A部分的局部放大图。

图6是图3中B1部分的局部放大图。

图7是图3中B2部分的局部放大图。

图8是图3中C1部分的局部放大图。

图9是图3中C2部分的局部放大图。

具体实施方式

方法学研究。

1、所需的仪器与试剂。

(1)仪器。

Agilent 1260Infinity II型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

Agilent Ultivo三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司，安捷伦公司，型号Ultivo)。

恒温超声仪(上海柯祁仪器设备有限公司)。

XW-80A涡旋混匀器(上海青浦沪西仪器厂)。

CPA124S电子分析天平(德国Sartorius科学仪器有限公司，赛多利斯公司)。

体重秤(慈溪市天东衡器厂)。

(2)试剂。

YG-18(纯度，含量≥98.0％)(沈阳药科大学药物化学教研室)。

乙氧苯柳胺(纯度含量≥99.9％，批号：200901)(中国药品生物制品检定所)。

乙腈(色谱纯)(美国Thermo Fisher Scientific公司，赛默飞世尔公司)。

纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2、实验方法。

(1)血浆样品预处理方法。

血浆样品是采用7-9周体成熟的SD大鼠，体重为200g±20g，经眼眶静脉丛下取血0.2mL，离心取上清液制成，取样量为100μL。

在EP管中依次加入乙腈10μL、乙氧苯柳胺(IS)的乙腈溶液10μL和采集的血浆样品20μL，涡旋3min后加入40μL乙腈后再涡旋2min，以13000r·min^-1离心8min，移出20μL上清液并加入180μL流动相((流动相A和流动相B各90μL，混合液)，涡旋2min充分混合均匀，移入进样瓶。

乙氧苯柳胺的乙腈溶液为内标工作液，浓度为400.0ng·mL^-1。

(2)色谱条件。

采用Alltima C18色谱柱(100×4.6mm，3μm)进行成分分离，流速为0.7mL·min^-1，柱温为35℃，每次进样量为20μL；内标化合物(IS)为乙氧苯柳胺；流动相A是浓度为0.1％(体积)的甲酸水溶液，流动相B为色谱纯乙腈，采用梯度洗脱，洗脱梯度程序见前述的表1。

(3)质谱条件。

离子源采用ESI离子源，应用多反应监测模式(MRM)进行负离子模式检测。定量分析的离子反应分别为：YG-18：m/z 484→416.1，乙氧苯柳胺(IS)：m/z 256→227；碰撞能量分别为：YG-18：35eV，乙氧苯柳胺(IS)：17eV；Fragmentor分别为：YG-18：160V，乙氧苯柳胺(IS)：95V。

上述的色谱条件为典型条件，实际应用中根据使用的仪器的不同特点，可对各参数进行适当的调整，以获得最佳的效果。

3、方法确证。

(1)专属性。

按“血浆样品预处理方法”项下操作处理空白血浆，处理中不加入乙氧苯柳胺的乙腈(IS)内标工作液，在之前确定的质谱条件下检测样品，获得空白血浆的图谱(图3中A部分)；将一定体积YG-18标准溶液(150ng·mL^-1)10μL和内标工作液(400.0μg·mL^-1)10μL加入到空白血浆中，依照上述操作，得对应色谱图(图3中的B部分)；灌胃方式给予健康SD大鼠一定体积的YG-18溶液，1h后采集其血浆样品，依照同法操作，得对应色谱图(图3中C部分)。

结果表明，SD大鼠血浆中的内源性物质对于YG-18和乙氧苯柳胺(IS)的测定无干扰。

其中：精密称取YG-18粉末2.0mg，乙腈配置得浓度为200μg·mL^-1的YG-18溶液。精密量取上述储备溶液200μL并置于20mL容量瓶中，用乙腈稀释至质量浓度为2μg·mL^-1的YG-18储备液。精密量取浓度为2μg·mL^-1的储备液，用乙腈逐级稀释制成所需浓度的标准系列溶液。

(2)标准曲线。

精密量取SD大鼠空白血浆20μL，加入YG-18标准系列溶液10μL，配制成浓度为3、15、75、150、300、600、1000和2000ng·mL^-1的模拟梯度血浆样品，按“血浆样品预处理方法”项下操作，在上述液质条件下检测分析，每个浓度进行双样本检测分析。设定待测物YG-18的浓度为横坐标(x)，YG-18与内标的峰面积比值为纵坐标(y)，进行线性回归计算，计算得到的直线回归方程即为YG-18的标准曲线。其典型的回归方程为：y＝0.0003781x+0.002486，r＝0.9996，如图4。

(3)准确度与精密度。

取定量下限溶液(3ng·mL^-1)和低、中、高三个浓度的质控溶液(5，100，1600ng·mL^-1)按“血浆样品预处理方法”项下操作处理质控(QC，Quality control)样品，每个浓度平行测定6个样本，每天重新测定标准曲线计算浓度，连续分析3天，分别计算YG-18在三种浓度下的准确度和精密度(见表2)。精密度用相对标准偏差(RSD，％)表示，准确度用相对误差(RE，％)表示。试验结果证明本研究建立的HPLC-MS/MS法对YG-18测定的日内、日间精密度和准确度均在±15％内，符合生物样品测定规定要求。

表2血浆样品中YG-18测定方法的准确度与精密度

(4)提取回收率。

取所述的低、中、高三个浓度的质控溶液按“血浆样品预处理”项下操作处理质控样品，每个浓度平行测定6个样本，得对应的色谱峰面积A。同时，于EP管中分别加入空白血浆20μL、乙腈40μL，涡旋3min后取上清液60μL并加入低、中、高三个浓度的质控溶液和乙氧苯柳胺(IS)的乙腈溶液(内标工作液)各10μL，涡旋2min后移出上清液并加入180μL流动相(流动相AB体积各一半)，涡旋2min充分混匀，每个浓度平行测定6个样本，得对应的色谱峰面积B。由上述结果计算YG-18和乙氧苯柳胺(IS)的提取回收率(见表3)。试验结果证明本研究建立的HPLC-MS/MS法对YG-18和乙氧苯柳胺(IS)测定的提取回收率的RSD均在±15％内，符合规定要求。

表3 YG-18和乙氧苯柳胺(IS)的提取回收率(n＝6)

(5)基质效应。

于EP管中分别加入空白血浆20μL和乙腈40μL，涡旋3min取上清液60μL并加入各个浓度质控溶液(5，100，1600ng·mL^-1)、乙氧苯柳胺(IS)的乙腈溶液(内标工作液)各10μL，涡旋2min后移出上清液并加入180μL流动相(流动相AB体积各一半)，涡旋2min充分混合均匀，每个浓度平行测定6个样本，得对应的色谱峰面积B。以取低、中、高三个浓度的质控溶液替代处理样品用到的乙腈，加入与血浆同等体积的纯净水，按“血浆样品预处理”项下操作处理，每个浓度平行测定6个样本，得色谱峰面积C。由上述结果计算YG-18和乙氧苯柳胺(IS)的基质效应(见表4)。试验结果证明本研究建立的HPLC-MS/MS法对YG-18和乙氧苯柳胺(IS)测定的基质效应的RSD均在±15％内，符合规定要求。

表4 YG-18和乙氧苯柳胺(IS)的基质效应(n＝6)

(6)稳定性。

取低、中、高三个浓度的质控溶液(5，100，1600ng·mL^-1)代替“血浆样品预处理方法”中的乙腈，分别加入SD大鼠的空白血浆中，每个浓度平行测定3个样本，分别考察血浆样品在室温条件12h、冻融交替三次、待测样品于进样器中24h、在-80℃冻存一个月的稳定性(见表5)。试验结果证明本研究建立的HPLC-MS/MS法对YG-18测定的稳定性的RSD均在±15％内，符合生物样品测定规定要求。

表5 YG-18在血浆样品中的稳定性考察结果(n＝3)

4、本发明的检测方法能够简便、准确、快速、高效、可靠的检测新型α-葡萄糖苷酶抑制剂YG-18。此方法具有很高的灵敏度，且操作简便，通过药代动力学研究进而为研究此类化合物提供了客观数据和研究基础。

Claims (7)

1.液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：将预处理的SD大鼠血浆样品在混合流动相梯度洗脱下，经高效液相色谱柱分离后，采用质谱检测器检测。

2.根据权利要求1所述的液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)血浆样品预处理；

在YG-18灌胃给药后的SD大鼠血浆中，加入乙腈和内标工作液，涡旋后离心，取上清用流动相稀释即得；

(2)待测样品和内标化合物分离；

采用C18色谱柱(100×4.6mm，3μm)，柱温：35℃，采用乙腈-甲酸溶液作为流动相，梯度洗脱。

3.根据权利要求1所述的液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：

所述的血浆样品采集于7-9周、体重为200g±20g的体成熟SD大鼠，经眼眶静脉丛下取血0.2mL，利用离心取上层血浆制成，取样量为100μL。

4.根据权利要求1所述的液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：

所述内标工作液为乙氧苯柳胺的乙腈溶液。

5.根据权利要求4所述的液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：

乙氧苯柳胺的乙腈溶液的浓度为400.0ng·mL^-1。

6.根据权利要求1所述的液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：

流动相为：流动相A和流动相B的混合液，流动相A为乙腈，流动相B为浓度为0.1％(体积)的甲酸溶液；采用梯度洗脱的方法，流动相配比随时间的变化见表1：

时间(min) A(体积％) B(体积％) 0 50 50 2 10 90 6 10 90 7 50 50 12 50 50

表1洗脱梯度程序。

7.根据权利要求1所述的液质联用技术检测大鼠血浆YG-18血药浓度的定量分析方法，其特征在于包括下列步骤：

二级质谱检测；

设备为Agilent Ultivo三重四级杆串联质谱仪，采用离子源为ESI离子源，多反映监测模式进行负离子检测。定量分析的离子分别为：YG-18：m/z 484→416.1，碰撞能量为35eV；乙氧苯柳胺(IS)：m/z 484→416.1，碰撞能量为17eV，毛细管电压分别为：YG-18：160V，乙氧苯柳胺(IS)：95V。

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