CN108072712A

CN108072712A - 一种sd大鼠血浆中新化合物wsj-557的血药浓度定量分析方法

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Publication number: CN108072712A
Application number: CN201710052486.7A
Authority: CN
Inventors: 林建阳; 张东虎; 杨恬
Original assignee: First Hospital of China Medical University
Current assignee: First Hospital of China Medical University
Priority date: 2017-01-22
Filing date: 2017-01-22
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2037-01-22
Also published as: CN108072712B

Abstract

一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ‑557的血药浓度定量分析方法，包括以下步骤：(1)在WSJ‑557灌胃给药后的SD大鼠血浆中，加入甲醇和内标工作液，涡旋后加入乙酸乙酯进行液液萃取，再进行涡旋，离心，并取上清；(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，柱温：40℃；超高效液相系统采用通用型二元高压泵和进样器，采用甲醇‑醋酸铵水溶液的混合液为流动相，梯度洗脱；(3)采用离子源为ESI离子源，多反应监测模式(MRM)进行正离子检测。定量分析的离子分别为：WSJ‑557：m/z316.1→260.0，m/z237.0→194.0，碰撞能量为15eV。本发明具有专属性强，灵敏度高，样品取样少、预处理简单、快速，分析周期短等优点，特别适用于SD大鼠血浆中WSJ‑557的血药浓度测定和药代动力学研究。

Description

一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法

技术领域

本发明涉及药物分析学临床前药代动力学研究范畴，尤其涉及一种SD大鼠血浆中化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法。

背景技术

控制血尿酸水平在痛风防治中起着关键的作用，而降尿酸的药物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的种类很少并且副作用多。WSJ-557是一个全新的非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，其体外的药效学实验表明WSJ-557(IC50＝0.003μM)的抑制活性比近几年刚上市的非布司他(IC50＝0.01μM)高很多。注：IC50(Half maximal inhibitory concentration)是指被测量拮抗剂的半抑制浓度(或称半抑制率)。

化合物WSJ-557的制备方法可参阅申请日为2012-08-07、申请号为201210279511.2、专利名称为“具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的化合物及其盐、制备方法和用途”的发明专利。从该专利文中可知，WSJ-557的化学名称是2-(3-氰基-4-仲丁氧基)苯基-1-羟基-4-甲基-1H-咪唑-5-甲酸，化学结构式为：

由于WSJ-557是创新药物，其生物样品的测定方法国内外尚无文献报道，为了能够开展关于其在体内的吸收、分布、代谢、排泄有关特征的动物及人体药代动力学研究，有必要建立一个灵敏度高、方便快捷的WSJ-557血药浓度定量分析方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种操作简便、快速、血浆用量少、专属性强、准确度高、重现性好、分析时间短、可得到满意的峰形及色谱保留时间的SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法。

为实现上述目的，采用了以下技术方案：本发明方法中血浆样品采自SD大鼠，选取化合物WSJ-557为药品；所述方法是将血浆样品预处理后，在混合流动相梯度洗脱下，经色谱柱分离后，采用二级质谱检测器检测；具体步骤如下：

步骤1，血浆样品预处理；

在WSJ-557灌胃给药后的SD大鼠血浆中，加入甲醇和内标工作液，涡旋后加入乙酸乙酯进行液液萃取，再进行涡旋，离心，并取上清；

步骤2，样品分离；

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，其填料为ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈(2.1mm×50mm,1.7μm)，柱温：40℃；超高效液相系统采用通用型二元高压泵和进样器，采用甲醇-醋酸铵水溶液的混合液为流动相，梯度洗脱；

步骤3，二级质谱仪检测样品；

采用离子源为ESI离子源，多反应监测模式(MRM)进行正离子检测；定量分析的离子分别为：WSJ-557：m/z316.1→260.0，IS：m/z237.0→194.0，最佳碰撞能量为15eV。

进一步的，所述的血浆样品采至7～9周、体重为200g±50g的体成熟SD大鼠；经眼眶静脉丛下取血0.3mL，经高速离心机离心取上清液制成；取样量为100μL。

进一步的，步骤1中，所述甲醇为色谱级甲醇溶液，其加入血浆的作用是沉淀血浆蛋白。

进一步的，步骤1中，所述内标工作液为卡马西平甲醇溶液，浓度为46ng·mL^-1。

进一步的，步骤2中，所述醋酸铵水溶液浓度为5mmol·L^-1。

进一步的，步骤2中，所述流动相为甲醇(有机相A)-醋酸铵水溶液的混合液，采用梯度洗脱的方法，流动相配比随时间的变化见表1：

表1

进一步的，步骤3中，所述质谱仪条件为毛细管电压4.0KV，锥孔电压25V，脱溶剂气温度和源温度分别为400℃和120℃。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、采样量少：测定一份样品只需0.3mL血浆样本；

2、预处理简便：样品甲醇沉蛋白，涡旋混合后乙酸乙酯萃取，氮气吹干后残留物用100μL流动相复溶进样。简便易行，适用于常规定量分析检测；

3、灵敏度高，通过二级质谱检测，明显提高测定的检测灵敏度，最低定量限为10ng·mL^-1；

4、选择性强，空白血浆中的内源性物质不干扰药物和内标的测定；

5、测定时间短：整个色谱分析测定过程为4Min；

6、WSJ-557的线性范围为10–1000ng·mL^-1，线性范围跨度大，能够很好地满足药物在体内动态分析变化的测定。

7、回收率稳定，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于15％。

附图说明

图1是本发明方法中WSJ-557的化学结构式。

图2是本发明方法实施例中WSJ-557的质谱扫面图。

图3a是空白血浆离子检测(MRM)色谱图。

图3b是空白血浆中加入WSJ-557(10ng·mL^-1)的离子检测(MRM)色谱图。

图3c是实际血浆样品的离子检测(MRM)色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明方法做进一步说明：

实施例

1.所需的仪器与试剂

1)仪器

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Quattro micro TM API三重四级杆串联质谱仪配备电喷雾离子源(ESI源，美国Waters公司)。

2)试剂

卡马西平(纯度99.3％)，购自中国药品生物制品检定所；甲醇，醋酸铵为色谱级；其他化学试剂均为分析纯。

2.实验部分

1)血浆样品预处理方法：

血浆样品是采用7～9周体成熟的SD大鼠，体重为200g±50g；经眼眶静脉丛下取血0.3mL，经高速离心机离心取上清液制成；取样量为100μL。

取100μL血浆于10mL玻璃试管中，分别加入50μL内标(卡马西平)(46ng·mL^-1)和50μL甲醇，涡旋30s，并用2.0mL乙酸乙酯萃取，然后涡旋90s，3500r·min^-1离心10min。转移上清液至一新的玻璃试管并在40℃氮气流下吹干，残留物用100μL流动相复溶并涡旋30s，取10μL至进样瓶中进样。

2)UPLC-MS/MS分析条件

色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈(2.1mm×50mm,1.7μm)；柱温：40℃；流动相为甲醇(有机相A)-醋酸铵水溶液，梯度洗脱，流动相配比随时间的变化见表1：表1

流动相流速为：0.2mL·min^-1；进样量：10μL。

质谱条件

离子源为ESI离子源，采用多反应监测模式(MRM)进行正离子检测；定量分析的离子分别为：WSJ-557：m/z316.1→260.0，IS：m/z237.0→194.0；毛细管电压4.0KV，锥孔电压25V，脱溶剂气温度和源温度分别为400℃和120℃。WSJ-557的最佳碰撞能量为15eV。

上述的色谱条件为典型条件，实际应用中根据使用的仪器的不同特点，可对各参数进行适当的调整，以获得最佳的效果。

3)UPLC-MS/MS分析结果

样品WSJ-557的质谱扫描图参见附图2。

3方法确证

1)专属性

本方法中待测物与内标的专属性由标准曲线最低浓度点与同法操作的空白血浆进行对比来评价。空白血浆、空白血浆中加入WSJ-557(10ng·mL^-1)、实际血浆样品的色谱图分别见图3a、图3b和图3c，从图中可以看出，空白血浆中的内源性物质不干扰WSJ-557和内标的测定。

2)标准曲线

WSJ-557的标准曲线系列溶液由甲醇配制：取SD大鼠空白血浆，加入WSJ-557标准系列溶液，配制成含WSJ-557浓度为10、20、40、100、250、500、1000ng·mL^-1的标准血浆；各取100μL按血浆样品预处理项下方法操作并进行UPLC-MS/MS分析，采用加权最小二乘法进行回归分析，得到标准曲线，标准曲线方程为：y＝0.098715x-0.347727(r＝0.9934)，y表示待测药物与内标的峰面积之比，x表示待测药物浓度。本方法WSJ-557定量测定的线性范围为10–1000ng·mL^-1，最低定量限为10ng·mL^-1。

3)提取回收率

按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备低、中、高三个浓度分别为25，150，800ng·mL^-1的质控样品，每个浓度进行6次样本分析，记录色谱峰。然后配制最终测定浓度的不含基质的纯样品溶液进行分析，得到相应的峰面积，以二者峰面积之比，考察样品的提取回收率。分析与测定结果见表2：

表2 WSJ-557的提取回收率(n＝6)

如表2所示，WSJ-557三个浓度的提取回收率分别为77.38％、77.71％和88.80％。

4)精密度与准确度

按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备WSJ-557低、中、高三个浓度分别为25，150，800ng·mL^-1的质量控制(QC)样品，每个浓度进行6次样本分析，连续测定三天，方法精密度由求得的日内、日间RSD(％)来评价，准确度由实际测得值与理论值的比值来评价，分析结果如表3所示。

表3血浆样品中WSJ-557UPLC-MS/MS测定方法的准确度与精密度

如表3所示，WSJ-557的日内、日间精密度分别在3.2％-11.1％和5.3％-10.1％，准确度范围为-14.1％-9.0％；均＜±15％，说明本方法具有良好的精密度与准确度。

5)稳定性

SD大鼠血浆样品稳定性试验是按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备WSJ-557二种浓度为25、800ng·mL^-1低、高二种QC血浆样品来考察。考察条件为：在-20℃冰箱放置15天，室温下放置4小时后提取，样品处理后自动进样器放置6小时、冻融三次循环，稳定性试验结果见表4所示。

表4血浆样品中WSJ-557的稳定性结果

如表4所示，WSJ-557的实测值与理论值的偏差在±15％以内，说明本方法具有良好的稳定性。

6)基质效应

按标准曲线系列溶液配制方法项下操作，制备低、中、高三个浓度分别为 25，150，800ng·mL^-1的质控样品，每个浓度进行6次样本分析，记录色谱峰。然后配制最终测定浓度的不含基质的纯样品溶液进行分析，得到相应的峰面积，以二者峰面积之比，考察样品的提取回收率。分析与测定结果见表5，表明基质效应对样品测定的影响比不大。

表5 WSJ-557的基质效应(n＝6)

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于，血浆样品采自SD大鼠，选取化合物WSJ-557为药品；所述方法是将血浆样品预处理后，在混合流动相梯度洗脱下，经色谱柱分离后，采用二级质谱检测器检测；具体步骤如下：

步骤1，血浆样品预处理；

步骤2，样品分离；

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，其填料为ACQUITY UPLC^TMBEH C₁₈(2.1mm×50mm,1.7μm)，柱温：40℃；超高效液相系统采用通用型二元高压泵和进样器，采用甲醇-醋酸铵水溶液的混合液为流动相，梯度洗脱；

步骤3，二级质谱仪检测样品；

采用离子源为ESI离子源，多反应监测模式(MRM)进行正离子检测；定量分析的离子分别为：WSJ-557：m/z316.1→260.0，IS：m/z237.0→194.0，碰撞能量为15eV。

2.根据权利要求1所述的一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于：所述的血浆样品采至7～9周、体重为200g±50g的体成熟SD大鼠；经眼眶静脉丛下取血0.3mL，经高速离心机离心取上清液制成；取样量为100μL。

3.根据权利要求1所述的一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于：步骤1中，所述甲醇为色谱级甲醇溶液。

4.根据权利要求1所述的一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于：步骤1中，所述内标工作液为卡马西平甲醇溶液，浓度为46ng·mL^-1。

5.根据权利要求1所述的一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于：步骤2中，所述醋酸铵水溶液浓度为5mmol·L^-1。

6.根据权利要求1所述的一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于：步骤2中，所述流动相为甲醇(有机相A)-醋酸铵水溶液的混合液，采用梯度洗脱的方法，流动相配比随时间的变化见表1：

表1

7.根据权利要求1所述的一种SD大鼠血浆中新化合物WSJ-557的血药浓度定量分析方法，其特征在于：步骤3中，所述质谱仪条件为毛细管电压4.0KV，锥孔电压25V，脱溶剂气温度和源温度分别为400℃和120℃。