CN110231412A - 绞股蓝中皂苷含量的检测方法 - Google Patents

绞股蓝中皂苷含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及绞股蓝中皂苷含量的检测方法。该方法只需检测一种皂苷的含量，然后通过各皂苷之间的内在关系即可推算出其余皂苷的含量，从而可以同步检测绞股蓝中各皂苷的含量。该方法节约对照品，灵敏度高，成本低，效率高，稳定性和重现性好，准确度高。

Description

绞股蓝中皂苷含量的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及绞股蓝中皂苷含量的检测方法。
背景技术
绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino的干燥全草，又被称为五叶参、七叶胆、公罗锅底等，因含有人参皂苷类成分，被称为南方人参。绞股蓝首载于明代朱橚所著的《救荒本草》，性凉味苦，微甘，归肺、脾、肾经，有清热、补虚、解毒的功效。绞股蓝的主要药效成分为绞股蓝皂苷，药理研究表明其具有抗肿瘤、调节血脂、降血糖、免疫调节、肝脏保护等作用。
目前主要采用紫外分光光度法测定绞股蓝中总皂苷的含量，该方法操作简便、成本较低，是目前应用测定总皂苷含量的通用方法。然而，此方法存在检测误差大，效率低，灵敏度低；所使用对照品人参皂苷不是药材中的主要成分，缺乏专属性和代表性；绞股蓝皂苷A有市售，但价格昂贵，检测成本高以及绞股蓝皂苷XLIX无市售对照品等缺点。
因此，一种灵敏度高，成本低，效率高，稳定性和重现性好的绞股蓝中皂苷含量的检测方法急需研究开发。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
由于目前绞股蓝皂苷类市售对照品十分有限，甚至一些绞股蓝皂苷如绞股蓝皂苷XLIX尚无市售对照品，从而造成了绞股蓝皂苷类多成分同步定量检测的成本过高甚至无法实现，极大地限制了绞股蓝皂苷类多成分同步质量评价模式在实际生产、科研和监管领域的应用与普及。基于上述问题，发明人发现，绞股蓝的主要有效成分绞股蓝皂苷具有母核结构相似而仅取代基不同的特点，由于同类成分在HPLC中的响应相似，因此，只需检测廉价易得的一种皂苷的含量，然后通过各皂苷之间的内在关系即可推算出其余皂苷的含量，从而可以同步检测绞股蓝中各皂苷的含量。发明人采用高纯绞股蓝皂苷对照品，经过无数的实验探索，建立了同步定量检测绞股蓝皂苷类成分的最佳HPLC检测条件，该同步定量检测方法节约对照品，灵敏度高，成本低，效率高，稳定性和重现性好，准确度高。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种绞股蓝中皂苷含量的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将对照品溶液以及待测溶液分别进行高效液相色谱检测，所述待测溶液为待测绞股蓝提取液，所述对照品溶液为绞股蓝任一皂苷对照液；(2)基于高效液相色谱检测结果，获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量；(3)将所述与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量与相对校正因子相乘，获得所述绞股蓝中其余绞股蓝皂苷的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：
采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，
洗脱条件为：
需要说明的是，所述相对校正因子反映了绞股蓝各皂苷之间的内在关系，具体计算过程参照具体实施方式部分的内容。该洗脱条件是发明人经过无数的实验探索后摸索出来的，采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，分析时间短，色谱峰峰形较好，无前拖和后延现象，分离度良好，且待测成分色谱峰出峰时间适中，有利于含量测定。该梯度洗脱条件可以将绞股蓝皂苷类成分进行有效分离，各峰没有重叠，便于后续能够准确计算相对校正因子，保证各成分定量评价结果的准确性。其余洗脱条件对待测成分的分离度较差，可能会导致绞股蓝皂苷类成分的峰相互重叠，导致无法准确计算各峰面积，造成后续相对校正因子计算时准确度降低，检测方法的准确度降低。根据本发明实施例的方法可以同步定量检测绞股蓝皂苷类成分，节约对照品，灵敏度高，成本低，效率高，稳定性和重现性好，准确度高。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：检测波长为200-250nm。该检测波长是发明人经过无数的实验探索后摸索出来的，检测波长在该范围时绞股蓝皂苷类成分紫外吸收较好，基线平稳。若检测波长过小，会导致基线不稳，导致皂苷含量测定方法的稳定性、重复性和准确度降低。根据本发明实施例的方法可以同步定量检测绞股蓝皂苷类成分，节约对照品，灵敏度高，成本低，效率高，稳定性和重现性好，准确度高。
根据本发明的实施例，所述检测波长为200-210nm。检测波长在该范围时绞股蓝皂苷类成分紫外吸收好，基线平稳。若检测波长过大或过小，会导致基线不稳或者紫外吸收强度弱甚至无紫外吸收，导致皂苷含量测定方法的稳定性、重复性和准确度降低。根据本发明实施例的方法可以同步定量检测绞股蓝皂苷类成分，节约对照品，灵敏度更高，成本低，效率高，稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述检测波长为203nm。根据本发明实施例的方法可以同步定量检测绞股蓝皂苷类成分，节约对照品，灵敏度更高，成本低，效率高，稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述绞股蓝提取液是通过如下方式获得的：将待测绞股蓝依次进行过筛、与甲醇混合、超声以及过滤处理，以便获得滤液；将所述滤液依次进行蒸干、加水复溶以及离心处理，取上清液，以便获得所述绞股蓝提取液。发明人发现，通过该方式制备绞股蓝提取液可以将干扰检测的杂质有效去除，将绞股蓝皂苷类成分充分提取出来，并且除杂效果好，重复性良好。该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述离心处理后，进一步包括：将所述上清液用固相萃取柱进行除杂处理。发明人发现，采用固相萃取小柱除杂后，除杂效果更佳，排除干扰后，目标峰峰高适中，色谱图美观，易于积分，且重复性、稳定性良好。该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述除杂处理的条件包括：采用甲醇-水体系进行洗脱。发明人发现，该洗脱体系除杂效果更佳。该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述甲醇-水体系中，所述甲醇与水的体积比为1:1。发明人发现，50％甲醇洗脱除杂效果更佳，既可以保证除去前面杂峰，又可以保证目标成分不被洗脱。该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述对照品溶液是通过将绞股蓝皂苷对照品与甲醇进行混合处理获得的。发明人发现，绞股蓝皂苷在甲醇中溶解度较好，呈均一透明溶液，并且甲醇对样品洗脱影响较小，不影响目标色谱峰之间的分离度，不干扰目标成分的准确定量。该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，步骤(2)中获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量是通过如下方式进行的：基于所述对照品溶液的高效液相色谱检测结果，获得对照品皂苷的浓度-峰面积标准曲线；基于所述待测溶液的高效液相色谱检测结果，将所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的峰面积比对所述标准曲线，获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：高效液相色谱仪为安捷伦1260高效液相色谱仪或Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪。发明人发现，采用所述高效液相色谱仪进行检测时，相对校正因子的重现性良好，该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：色谱柱为C18色谱柱。发明人发现，采用所述色谱柱进行检测时，相对校正因子的重现性良好，该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：流速为0.9～1.1mL/min。发明人发现，采用所述流速进行检测时，相对校正因子的重现性良好，该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：柱温为30～35℃。发明人发现，采用所述柱温进行检测时，相对校正因子的重现性良好，该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述色谱柱为MACHERE Y-NAGEL C18色谱柱、PhenomenexC18色谱柱或Diamonsil C18色谱柱。发明人发现，采用所述色谱柱进行检测时，相对校正因子的重现性更好，该检测方法的稳定性和重现性更好，准确度更高。
根据本发明的实施例，所述绞股蓝中的皂苷包括选自绞股蓝皂苷XLVI、绞股蓝皂苷LVI、人参皂苷Rd、绞股蓝皂苷B的至少之一。其中，绞股蓝皂苷B的系统命名为2α,3β,12β,20S-tetrahydroxydammar-24-ene-3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-[β-D-6-O-acetylglucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，即2α,3β,12β,20S-四羟基达玛树脂-24-烯-3-O-β-D-葡萄糖基-20-O-[β-D-6-O-乙酰葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖]。
根据本发明的实施例，以所述绞股蓝皂苷XLVI为参照物，所述参照物对所述绞股蓝皂苷LVI的相对校正因子为1.107～1.117，所述参照物对所述人参皂苷Rd的相对校正因子为1.446～1.496，所述参照物对所述绞股蓝皂苷B的相对校正因子为1.057～1.089。
根据本发明的实施例，以所述绞股蓝皂苷XLVI为参照物，所述参照物对所述绞股蓝皂苷LVI的相对校正因子为1.11，所述参照物对所述人参皂苷Rd的相对校正因子为1.48，所述参照物对所述绞股蓝皂苷B的相对校正因子为1.08。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种绞股蓝中皂苷含量的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
将绞股蓝过65目筛，加入60体积％甲醇，在温度为50℃的条件下进行超声提取，过滤，将滤液在温度为50℃的条件下进行蒸干，用水溶解蒸干产物，将溶解液在6000r/min的条件下进行离心，以便获得上清液；分别用甲醇和水活化固相萃取柱，将部分所述上清液转移至所述固相萃取柱内，采用50体积％甲醇进行洗脱；将洗脱液旋干，将旋干产物用乙腈-水溶解，以便获得待测溶液；
将绞股蓝皂苷对照品与甲醇进行混合处理，以便获得对照品溶液；
将对照品溶液以及待测溶液分别进行高效液相色谱检测；
基于所述对照品溶液的高效液相色谱检测结果，获得对照品皂苷的浓度-峰面积标准曲线；基于所述待测溶液的高效液相色谱检测结果，将所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的峰面积比对所述标准曲线，获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量；
将所述与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量与相对校正因子相乘，获得所述绞股蓝中其余绞股蓝皂苷的含量；
其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
高效液相色谱仪为安捷伦1260高效液相色谱仪或Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，
色谱柱为MACHERE Y-NAGEL C18色谱柱、Phenomenex C18色谱柱或Diamonsil C18色谱柱，
流速为0.9～1.1mL/min，
柱温为30～35℃，
采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，
检测波长为200-210nm，
洗脱条件为：
根据本发明实施例的方法可以同步定量检测绞股蓝皂苷类成分，节约对照品，灵敏度高，成本低，效率高，稳定性和重现性好，准确度高。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述绞股蓝中的皂苷包括绞股蓝皂苷XLVI、绞股蓝皂苷LVI、人参皂苷Rd以及绞股蓝皂苷B，以所述绞股蓝皂苷XLVI为参照物，所述参照物对所述绞股蓝皂苷LVI的相对校正因子为1.11，所述参照物对所述人参皂苷Rd的相对校正因子为1.48，所述参照物对所述绞股蓝皂苷B的相对校正因子为1.08。该方法只需测定绞股蓝皂苷XLVI一个成分的含量(对照品廉价、易得)，即可同步定量测定4种成分的含量，建立了绞股蓝药材HPLC多成分定量评价方法，提升了其质量控制水平，降低了实验成本。根据本发明实施例的方法可以同步定量检测绞股蓝皂苷类成分，节约对照品，灵敏度更高，成本更低，效率更高，稳定性和重现性更好，准确度更高。
附图说明
图1是根据本发明实施例的绞股蓝皂苷混标色谱图和绞股蓝待测样品色谱图，
其中，A为绞股蓝皂苷混标色谱图，B为绞股蓝待测样品色谱图，a为绞股蓝皂苷XLVI，b为绞股蓝皂苷LVI，c为人参皂苷Rd，d为绞股蓝皂苷B；
图2是根据本发明实施例的200-205nm波长下本发明洗脱条件和其他洗脱条件对比的高效液相色谱检测示意图，
其中，A为其他洗脱条件高效液相色谱检测示意图，B为本发明洗脱条件下高效液相色谱检测示意图；
图3是根据本发明实施例的不同检测波长下高效液相色谱检测示意图，
其中，A为192nm波长下高效液相色谱检测示意图，B为203nm波长下高效液相色谱检测示意图，C为210nm波长下高效液相色谱检测示意图，D为230nm波长下高效液相色谱检测示意图；
图4是根据本发明实施例的样品未进行固相萃取小柱除杂处理，直接进样的高效液相色谱检测示意图；以及
图5是根据本发明实施例的使用固相萃取小柱进行除杂处理后的高效液相色谱检测示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
1.材料
1.1仪器与试剂
Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；MACHEREY-NAGEL C18(250mm×4.6mm,5u)、Phenomenex C18(250mm×4.6mm,5u)、Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5u)色谱柱；甲醇(分析纯，北京化工厂)；乙腈(色谱纯，Fisher Scientific)娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)
1.2对照品
绞股蓝皂苷XLVI(a)、绞股蓝皂苷LVI(b)、人参皂苷Rd(c)和绞股蓝皂苷B(d)，均为实验室自制，制备方法如下：药材经30％乙醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，过HPD-500大孔树脂，吸附24h，分别用20％-70％乙醇洗脱，其中50％乙醇洗脱部位过硅胶柱，乙酸乙酯：甲醇洗脱，根据薄层情况对洗脱液进行合并，得到馏分1～馏分5，其中馏分2经反相硅胶填料柱层析，经不同比例甲醇水洗脱，再经制备液相色谱仪制备得到上述化合物b、c、d；其中馏分4经正相硅胶柱层析，不同比例二氯甲烷：甲醇：水洗脱，再经制备液相得到化合物a。化合物a、b、c、d纯度均＞98％。
1.3药材
绞股蓝药材采自福建省漳州市南靖县，经中国科学院华南植物园叶华谷研究员鉴定为绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thumb.)Makino，具体见下表1。
表1：样品信息表
2.方法与结果
2.1色谱条件
Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5u)，流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，0～5min，25％-35％A，5～20min，35％-42％A，20～30min，42％-85％A，30～35min，85％-95％A，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长200-210nm。
2.2混标溶液的制备
精密称取绞股蓝皂苷LVI、绞股蓝皂苷XLVI、人参皂苷Rd和绞股蓝皂苷B适量，加甲醇制成每1mL含绞股蓝皂苷LVI 1.9980mg、绞股蓝皂苷XLVI 2.0560mg、人参皂苷Rd0.6615mg和绞股蓝皂苷B 0.6675mg的混合溶液。
分别取以上溶液0.8mL、0.7mL、0.5mL、0.3mL、0.2mL、0.15mL、0.1mL、0.05mL定容至1mL以便进行梯度稀释，最终一共获得9个不同浓度的混标溶液。
参考图1，将图1中的A(混标)与B(样品)进行对比分析可知，混标溶液中各待测成分和样品中保留时间一致，峰形对称，无前拖和后延现象，基线平稳。
2.3供试品溶液制备
取绞股蓝粉末(过65目筛)约0.4g，精密称定，加入60％甲醇24mL，50℃超声提取30min，过滤，滤液50摄氏度旋干，1mL水溶解，离心(6000r/min，15min)，备用。
固相萃取柱处理：
a、活化：分别用12mL甲醇和水进行洗脱。
b、上样：精密量取0.5mL备用溶液转移至固相萃取柱内，控制流速，使样品充分吸附。
c、洗脱：分别测试了用18mL水、10％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、100％甲醇进行洗脱。
d、将洗脱部位旋干(50℃)，体积比1:1乙腈-水溶解，即得供试品溶液。
2.4内参物对照品溶液的制备
精密称取绞股蓝皂苷XLVI(内参物)适量，配置成约2mg/mL的母液，分别稀释成浓度为1.6、1.4、1.0、0.6、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL左右的对照品溶液，即得不同浓度的对照品溶液。
3.本发明方法的建立
3.1相对校正因子的建立
在一定的范围内(线性范围内)检测器响应(峰面积，A)与某一组分的量(质量或浓度，C)成正比，即A＝f×C。在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分(有对照品供应者，且性质稳定)为标准，建立该组分对照品与其他组分对照品之间的相对校正因子(fs/i)，相对校正因子计算公式如下：
于是测得的fs/i可作为某一色谱条件下某一组分的通用参数。通过使用一个对照品(内参物)和相对校正因子(fs/i)计算其它组分的含量。待测成分含量计算公式如下：
备注：s为内参物，i为待测成分；fs/i为内参物s对待测成分i的相对校正因子；As为内参物峰面积，Cs为内参物浓度，Ai为某待测成分i的峰面积；Ci为某待测成分i的浓度。
以绞股蓝皂苷XLVI为内参物，分别计算各待测成分绞股蓝皂苷LVI、人参皂苷Rd和绞股蓝皂苷B与内参物绞股蓝皂苷XLVI的相对校正因子，具体相对校正因子计算方法参照公式(1)，具体结果见下表2。
表2：绞股蓝皂苷相对校正因子的考察
备注：以绞股蓝皂苷XLVI为内参物，fa/b为绞股蓝皂苷LVI相对校正因子，fa/c为人参皂苷Rd的相对校正因子，fa/d为绞股蓝皂苷B的相对校正因子。
3.2相对校正因子的重现性考察
不同实验条件可能影响相对校正因子的重现性，因此发明人设计了一系列实验进行相关考察。
3.2.1不同仪器对相对校正因子的影响
采用Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5u)色谱柱，分别考察了两种不同色谱系统对待测成分相对校正因子的影响，结果表明各成分相对校正因子重现性良好(RSD＜3％)，具体见下表3。
表3：不同色谱系统对校正因子的重现性考察结果
3.2.2不同色谱柱对相对校正因子的影响
采用安捷伦1260高效液相色谱系统，分别考察了3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明各所测成分相对校正因子重现性良好(RSD＜2％)，具体见下表4。
表4：不同色谱柱对校正因子的重现性考察结果
3.2.3不同流速对相对校正因子的影响
采用安捷伦1260高效液相色谱系统和Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5u)色谱柱分别考察了不同流速(0.9，1.0，1.1mL·min-1)对绞股蓝皂苷的相对校正因子的影响，结果表明各待测成分相对校正因子在不同流速下重复性良好，具体见下表5。
表5：不同流速对校正因子的重现性考察结果
3.2.4不同柱温对相对校正因子的影响
采用安捷伦1260高效液相色谱系统和Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5u)色谱柱分别考察了不同柱温(30和35℃)对绞股蓝皂苷的相对校正因子的影响，结果表明各待测成分相对校正因子在不同柱温下重复性良好，具体见下表6。
表6：不同柱温对校正因子的重现性考察结果
3.2.5本发明检测方法待测成分色谱峰定位
一测多评法一般采用保留时间差或者相对保留值等参数结合色谱峰特性来定位其他待测成分的色谱峰(a,b,c……)。本发明主要考察不同仪器和不同品牌色谱柱对相对保留值和保留时间差的影响。结果表明保留时间差和相对保留值的波动均较小(RSD＜5％)，但相对保留值波动更小(RSD＜2％)，因此本发明采用相对保留值法针对绞股蓝中皂苷类待测成分色谱峰定位更为合适，具体见下表7和下表8。
表7：一测多评法待测成分色谱峰定位——相对保留值法
表8：一测多评法待测成分色谱峰定位——保留时间差法
下面通过实施例进一步详细描述本发明的具体实施方式，下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明的具体实施方式，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
本发明检测方法和外标法含量测定对比分析
1、线性关系考察
分别吸取2.3项下的9个不同浓度的混标溶液，分别进样10微升，以峰面积为纵坐标，以被测物的浓度为横坐标，分别绘制绞股蓝皂苷LVI、绞股蓝皂苷XLVI、人参皂苷Rd和绞股蓝皂苷B的线性方程，具体结果见下表9。
表9：绞股蓝皂苷的线性范围
由上表9分析可知，各成分标准曲线线性良好，因此使用该标准曲线所得的校正因子和含量测定结果可信度高。
2、一测多评法计算结果和外标法测定结果比较
分别吸取不同批次供试品溶液样品，注入高效液相色谱仪进行含量测定。采用外标法和本发明方法计算4个化合物的含量，具体结果见下表10。
表10：外标法和本发明方法测定样品中皂苷类成分的含量
备注：待测成分b含量由公式计算得到；待测成分c含量由公式计算得到；待测成分d含量由公式计算得到。
由上表10分析可知，两种方法检测结果RSD％＜5％，无显著性差异，但本发明方法与外标法相比，在保证检测结果准确度的前提下，节省了对照品，降低成本，并且检测效率大大提高。本方法尤其适用于没有对照品供应者的定量，或者稳定性差成分的定量检测。
对比例1：不同洗脱条件考察
申请人考察了不同洗脱条件对样品分离效果的影响。
其中，本发明中高效液相色谱条件为：柱温：30℃；流速：1.0mL min-1；流动相：A为乙腈，B为水；洗脱条件：0min，25％A；0-5min，25％-35％C；5-20min，35％-42％C；20-30min，42％-85％C；30-35min，85％-95％C；检测波长：203nm；进样量10微升。
其他高效液相色谱条件为：柱温：30℃；流速：1.0mL min-1；流动相：A为乙腈，B为水；洗脱条件：0min，10％A；0-15min，10％-65％C；15-40min，65％-75％C；40-50min，75％C；50-60min，70％-80％C；60-65min，80％-95％C；65-70min，95％C；检测波长：203nm；进样量10微升。高效液相色谱检测结果参见图2。
图2中A为其他洗脱条件色谱图，B为本发明洗脱条件下色谱图。与A相比，本发明所采用的洗脱条件分析时间短，色谱峰峰形较好，无前拖和后延现象，分离度良好，且待测成分色谱峰出峰时间适中，有利于含量测定。
对比例2：不同检测波长考察
申请人分别考察了192nm，203nm，210nm，230nm等4组检测波长下被检测样品的紫外吸收情况。检测结果如图3所示。
由图3分析可知，检测波长在200-210nm处绞股蓝皂苷类成分紫外吸收好且噪音小，基线平稳，检测波长过大或过小，会导致基线不稳、紫外吸收强度弱或者无紫外吸收，或者溶剂干扰强等多种因素，导致相对校正因子的重复性和稳定性差，检测方法的稳定性、重复性和准确度降低。
对比例3：样品处理方法考察
申请人考察了固相萃取对样品处理的影响，分别对固相萃取小柱除杂前和除杂后的溶液进行了高效液相色谱检测，并将检测结果进行了对比，检测结果见图4-5所示。
对比图4和图5可以发现，固相萃取小柱除杂前的样品溶液HPLC指纹图谱中1-5min内存在几个响应值特别大的干扰峰，导致后面的目标峰(保留时间18-28min)被掩盖，本发明采用固相萃取小柱除杂后，除杂效果佳，排除干扰后，目标峰峰高适中，色谱图美观，易于积分，且重复性、稳定性良好，因此选择用固相萃取小柱进行样品除杂。
本发明采用固相萃取小柱除杂，具体操作包括：将SPE小柱用甲醇、水依次进行活化；用活化后的SPE小柱对所述样品溶液进行分离提纯，分别考察了固相萃取除杂洗脱溶剂比例，分别考察了10％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、100％甲醇依次进行洗脱；将不同梯度洗脱馏分减压蒸干；用乙腈-水溶液复溶，过滤膜，分别进行高效液相色谱检测。
其中，50％甲醇洗脱除杂效果最佳，既可以保证除去前面杂峰，又可以保证目标成分不被洗脱。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种绞股蓝中皂苷含量的检测方法，其特征在于，包括：
(1)将对照品溶液以及待测溶液分别进行高效液相色谱检测，所述待测溶液为待测绞股蓝提取液，所述对照品溶液为绞股蓝任一皂苷对照液；
(2)基于高效液相色谱检测结果，获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量；
(3)将所述与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量与相对校正因子相乘，获得所述绞股蓝中其余绞股蓝皂苷的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：
采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，
洗脱条件为：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：
检测波长为200-250nm；
优选地，所述检测波长为200-210nm；
优选地，所述检测波长为203nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绞股蓝提取液是通过如下方式获得的：
将待测绞股蓝依次进行过筛、与甲醇混合、超声以及过滤处理，以便获得滤液，
将所述滤液依次进行蒸干、加水复溶以及离心处理，取上清液，以便获得所述绞股蓝提取液；
优选地，所述离心处理后，进一步包括：将所述上清液用固相萃取柱进行除杂处理；
优选地，所述除杂处理的条件包括：采用甲醇-水体系进行洗脱；
优选地，所述甲醇-水体系中，所述甲醇与水的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液是通过将绞股蓝皂苷对照品与甲醇进行混合处理获得的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量是通过如下方式进行的：
基于所述对照品溶液的高效液相色谱检测结果，获得对照品皂苷的浓度-峰面积标准曲线；
基于所述待测溶液的高效液相色谱检测结果，将所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的峰面积比对所述标准曲线，获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件进一步包括：
高效液相色谱仪为安捷伦1260高效液相色谱仪或Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪；
任选地，色谱柱为C18色谱柱；
任选地，流速为0.9～1.1mL/min；
任选地，柱温为30～35℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为MACHERE Y-NAGEL C18色谱柱、Phenomenex C18色谱柱或Diamonsil C18色谱柱。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述绞股蓝中的皂苷包括选自绞股蓝皂苷XLVI、绞股蓝皂苷LVI、人参皂苷Rd、绞股蓝皂苷B的至少之一。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以所述绞股蓝皂苷XLVI为参照物，
所述参照物对所述绞股蓝皂苷LVI的相对校正因子为1.107～1.117，
所述参照物对所述人参皂苷Rd的相对校正因子为1.446～1.496，
所述参照物对所述绞股蓝皂苷B的相对校正因子为1.057～1.089；
优选地，以所述绞股蓝皂苷XLVI为参照物，
所述参照物对所述绞股蓝皂苷LVI的相对校正因子为1.11，
所述参照物对所述人参皂苷Rd的相对校正因子为1.48，
所述参照物对所述绞股蓝皂苷B的相对校正因子为1.08。
10.一种绞股蓝中皂苷含量的检测方法，其特征在于，包括：
将绞股蓝过65目筛，加入60体积％甲醇，在温度为50℃的条件下进行超声提取，过滤，将滤液在温度为50℃的条件下进行蒸干，用水溶解蒸干产物，将溶解液在6000r/min的条件下进行离心，以便获得上清液；分别用甲醇和水活化固相萃取柱，将部分所述上清液转移至所述固相萃取柱内，采用50体积％甲醇进行洗脱；将洗脱液旋干，将旋干产物用乙腈-水溶解，以便获得待测溶液；
将绞股蓝皂苷对照品与甲醇进行混合处理，以便获得对照品溶液；
将对照品溶液以及待测溶液分别进行高效液相色谱检测；
基于所述对照品溶液的高效液相色谱检测结果，获得对照品皂苷的浓度-峰面积标准曲线；基于所述待测溶液的高效液相色谱检测结果，将所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的峰面积比对所述标准曲线，获得所述绞股蓝中与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量；
将所述与对照品种类相同的绞股蓝皂苷的含量与相对校正因子相乘，获得所述绞股蓝中其余绞股蓝皂苷的含量；
其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
高效液相色谱仪为安捷伦1260高效液相色谱仪或Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪，
色谱柱为MACHERE Y-NAGEL C18色谱柱、Phenomenex C18色谱柱或Diamonsil C18色谱柱，
流速为0.9～1.1mL/min，
柱温为30～35℃，
采用乙腈-水体系进行梯度洗脱，
检测波长为200-210nm，
洗脱条件为：
任选地，所述绞股蓝中的皂苷包括绞股蓝皂苷XLVI、绞股蓝皂苷LVI、人参皂苷Rd以及绞股蓝皂苷B，
以所述绞股蓝皂苷XLVI为参照物，
所述参照物对所述绞股蓝皂苷LVI的相对校正因子为1.11，
所述参照物对所述人参皂苷Rd的相对校正因子为1.48，
所述参照物对所述绞股蓝皂苷B的相对校正因子为1.08。
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