CN112858497B - 一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法，属于中药分析及质量鉴别、控制技术领域。在本技术方案中，基于高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制北豆根标准汤剂中的特征成分，弥补了现有质量控制技术的不足，所得特征图谱中的特征峰信息量丰富，能有效保证北豆根标准汤剂的整体质量的稳定性，使北豆根标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的特征图谱的构建方法，尤其涉及一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法，属于中药分析及质量鉴别、控制技术领域。
背景技术
北豆根(别名蝙蝠葛根，Menispermum dauricum DC.)，为防己科植物蝙蝠葛的根茎，具有清热解毒、消肿止痛的功能；主治咽喉肿痛、肺热咳嗽、肝炎、便秘、毒蛇咬伤等症。其主产于我国东北部、北部和东部，目前，市场以黑龙江、辽宁、山东、河北四省产量最大，河南产量亦占部分比例。北豆根标准汤剂是由北豆根饮片经水提、浓缩、干燥等而成的冻干粉，与药材和饮片相比，已失去固有的形态，以及对应的活性成分也有相应的变化，因此仅采用药材或饮片的含量指示性成分定量分析，难以全面反映其内在质量，而目前对于北豆根标准汤剂的定性检测技术几乎没有。
特征图谱是一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法，对中药及其制剂的真实性、质量的一致性和稳定性均可有效地加以检测和控制。因此，有必要建立一种快速鉴
现有技术“北豆根生物碱电喷雾质谱电离规律及其特征图谱研究，陈勇等，2006年”中公开：用电喷雾离子阱质谱(ESI-QITMS)研究了粉防已碱和青藤碱在正离子检测方式下的一级质谱和二级质谱，总结出各自的ESI碎裂规律，并以北豆根中16种已知主要生物碱(其中有一种存在同分异构体)为对象，应用选择离子检测(SIM)模式制作了北豆根对照药材生物碱提取物的特征指纹图谱。
现有技术“北豆根配方颗粒质量标准的研究，胡辉等，2019”中公开：目的建立北豆根配方颗粒(北豆根)的质量标准，方法TLC法进行定性鉴别，热浸法测定醇浸出物含有量，HPLC法测定蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含有量，建立10批样品指纹图谱。
现有技术“高效液相色谱法测定北豆根中蝙蝠葛碱的含量，闫倩倩，2015”中公开：目的建立北豆根药材中有效成分蝙蝠葛碱的含量测定方法；方法采用HPLC法，色谱柱为Discovery C18柱(250×4.6mm,5μm)，以乙腈-0.05％三乙胺水溶液(40:60)为流动相，流速为1.0ml·min-1，检测波长为282nm；结果表明：蝙蝠葛碱浓度在0.829.84μg·ml-1范围内，浓度与其峰面积呈良好线性关系，平均回收率为99.03％，RSD为1.41％。
以及现有技术“RP-HPLC法测定北豆根药材中4种生物碱的含量，李可强等，2008”中公开：采用RP-HPLC法同时测定巾药材北豆根中青藤碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱和粉防己碱4种生物碱的含量；方法为采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，以甲醇(A)-乙腈(B)-0.05％乙胺的水溶液(C)为流动相，梯度洗脱[0～20min,B-C(20:80)，20～40min]，B-C(20:80)→A—B—C(5:40:55)，40～60min，A-B-C(5:40:55)→B，保持10min]；流速1.0mL·min-1；检测波长为262nm(0～20min)；282nm(20～70min)。
发明内容
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法。在本技术方案中，基于高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制北豆根标准汤剂中的特征成分，弥补了现有质量控制技术的不足，所得特征图谱中的特征峰信息量丰富，能有效保证北豆根标准汤剂的整体质量的稳定性，使北豆根标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取蝙蝠葛苏林碱对照品，置棕色量瓶中，加甲醇，制成每1mL含蝙蝠葛苏林碱20μg的溶液，即得蝙蝠葛苏林碱对照品溶液(本品临用前新制，避光保存)；
取蝙蝠葛碱对照品，加甲醇，制成每1mL含35μg的溶液，即得蝙蝠葛碱对照品；
取木兰花碱对照品，加甲醇，制成每1mL含40μg的溶液，即得木兰花碱对照品；
B.对照药材溶液的制备：取北豆根对照药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.供试品溶液的制备：取本品0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05％三乙胺溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：284nm；
理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000；
流动相按梯度洗脱程序为：
进一步的，所述北豆根标准汤剂的HPLC特征图谱包括五个特征峰，其中，各特征峰与对照药材参照物特征峰保留时间相对应，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为1.665(峰2)；与蝙蝠葛碱参照物相应的峰为S2峰，计算峰3-4与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±8％之内，规定值为0.925(峰3)、0.944(峰4)。
一种北豆根标准汤剂的质量检测方法，包括如下步骤：
S1.待测供试品溶液的制备：取本品，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2.检测：取经步骤S1所得的待测供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测北豆根标准汤剂的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05％三乙胺溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：284nm；
理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000；
流动相按梯度洗脱程序为：
北豆根标准汤剂涉及的炮制方法如下：
取北豆根饮片100g，加水煎煮二次，一煎加10倍水，浸泡30min，煮沸，保持微沸煎煮30min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮20min，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，浓缩，冷冻干燥，分装，即得。
其中，所得北豆根标准汤剂为棕黄色至棕褐色粉沫，气微，味苦。制备工艺符合《中华人民共和国药典》2015年版一部北豆根【炮制】项下的相关规定。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1)本发明提供一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法，确定了蝙蝠葛碱、木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱等五个共有峰，所构建的HPLC特征图谱中色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好，可以全面的反应北豆根标准汤剂的主要化学成分信息，检测方法具有良好的稳定性和重复性，便于大规模推广应用；
2)本发明构建的北豆根标准汤剂的HPLC特征图谱，填补了现有技术北豆根标准汤剂质量控制的空白，为后续北豆根配方颗粒等研究提供了有效研究基础；
3)本发明基于高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制北豆根标准汤剂中的特征成分，能有效保证北豆根标准汤剂的整体质量的稳定性，使北豆根标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。
附图说明
图1为实施例1中北豆根标准汤剂对照特征图谱(其中，峰1(S1)：木兰花碱；峰4：蝙蝠葛苏林碱；峰5(S2)：蝙蝠葛碱)；
图2为实施例3中提取溶剂考察结果色谱图；
图3为实施例3中提取方法考察结果色谱图；
图4为实施例3中提取时间考察结果色谱图；
图5为实施例3中溶剂加入量考察结果色谱图；
图6为实施例4的波长考察中木兰花碱紫外吸收光谱图；
图7为实施例4的波长考察中蝙蝠葛苏林碱紫外吸收光谱图；
图8为实施例4的波长考察中蝙蝠葛碱紫外吸收光谱图；
图9为实施例4中北豆根标准汤剂不同波长色谱图；
图10为实施例4中柱温考察结果色谱图；
图11为实施例4中流速考察结果色谱图；
图12为实施例5中色谱峰指认结果图(其中，峰1：木兰花碱，峰4：蝙蝠葛苏林碱，峰5(S)：蝙蝠葛碱)；
图13为实施例5中北豆根标准汤剂特征图谱(其中，S1(5)-S22(5)分别对应供试品批号BDGBT181101、BDGBT181102、BDGBT181103、BDGBT181104、BDGBT181105、BDGBT181106、BDGBT181107、BDGBT181108、BDGBT181109、BDGBT181110、BDGBT181201、BDGBT181202、BDGBT181203、BDGBT181204、BDGBT181205、BDGBT181206、BDGBT181207、BDGBT181208、BDGBT181209、BDGBT181210、BDGBT181211、BDGBT181212)。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中，所涉及的仪器包括：
高效液相色谱仪：岛津20-AD型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters2695型高效液相色谱仪，
色谱柱：InertSustain-C18(5μm，4.6×250mm)、Diamonsil-C18(5μm，4.6×250mm)、Kromasil-C18(5μm，4.6×250mm)，
电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)，
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)，
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
在以下实施例中，所涉及的试剂包括：
乙腈(SIGMA公司，色谱纯)、三乙胺(色谱纯)、水(超纯水)，其余试剂均为分析纯；
在以下实施例中，所涉及的供试品包括：
北豆根标准汤剂(冻干粉)批号：BDGBT181101、BDGBT181102、BDGBT181103、BDGBT181104、BDGBT181105、BDGBT181106、BDGBT181107、BDGBT181108、BDGBT181109、BDGBT181110、BDGBT181201、BDGBT181202、BDGBT181203、BDGBT181204、BDGBT181205、BDGBT181206、BDGBT181207、BDGBT181208、BDGBT181209、BDGBT181210、BDGBT181211、BDGBT181212；
在以下实施例中，所涉及的对照品包括：
蝙蝠葛碱(中国食品药品检定研究院，批号：11867-201804)
蝙蝠葛苏林碱(Standford Chemicals，批号：DRL-374266，含量99.37％计)
木兰花碱对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：111901-201603)。
实施例1
一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取蝙蝠葛苏林碱对照品，置棕色量瓶中，加甲醇，制成每1mL含蝙蝠葛苏林碱20μg的溶液，即得蝙蝠葛苏林碱对照品溶液(本品临用前新制，避光保存)；
取蝙蝠葛碱对照品，加甲醇，制成每1mL含35μg的溶液，即得蝙蝠葛碱对照品；
取木兰花碱对照品，加甲醇，制成每1mL含40μg的溶液，即得木兰花碱对照品；
B.对照药材溶液的制备：取北豆根对照药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C.供试品溶液的制备：取本品0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D.建立：分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱(如图1所示)；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05％三乙胺溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：284nm；
理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000；
流动相按下表1梯度洗脱程序为：
表1梯度洗脱程序
最终规定：北豆根标准汤剂的特征图谱中应呈现五个特征峰，并应与对照药材特征峰保留时间相对应，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为1.665(峰2)；与蝙蝠葛碱参照物相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±8％之内，规定值为0.925(峰3)、0.944(峰4)
即：北豆根标准汤剂的HPLC特征图谱包括五个特征峰，其中，各特征峰与对照药材参照物特征峰保留时间相对应，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为1.665(峰2)；与蝙蝠葛碱参照物相应的峰为S2峰，计算峰3-4与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±8％之内，规定值为0.925(峰3)、0.944(峰4)。
实施例2
一种北豆根标准汤剂的质量检测方法，包括如下步骤：
S1.待测供试品溶液的制备：取本品，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2.检测：取经步骤S1所得的待测供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与所得HPLC特征图谱进行比较，检测北豆根标准汤剂的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05％三乙胺溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：284nm；
理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000；
流动相按下表2梯度洗脱程序为：
表2梯度洗脱程序
实施例3
基于实施例1-2，本实施例对供试品溶液制备中的提取溶剂、提取方法、提取时间、溶剂加入量进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
一、提取溶剂考察
取本品(批号：BDGBT181101)0.2g，五份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇25mL、50％甲醇25mL、水25mL、50％乙醇25mL、乙醇25mL时进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用对应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图2所示。
结果表明：当提取溶剂为50％甲醇时，色谱峰信息量大，故，供试品提取溶剂确定为50％甲醇。
二、提取方法考察
取本品(批号：BDGBT181101)0.2g，两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，分别回流处理20min、超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图3所示。
结果表明：超声提取与回流提取时，效果一致，因超声提取操作更为简便，故，供试品提取方法确定为超声处理。
三、提取时间考察
取本品(批号BDGBT181101)0.2g，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)10min、20min、30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图4所示。
结果表明：当提取时间为20min时，即可充分提取，故，供试品提取时间确定为20min。
四、溶剂加入量考察
取本品(批号BDGBT181101)0.2g，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇10mL、25mL、50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图5所示。
结果表明：在溶剂加入量为25mL时，特征图谱色谱峰面积适中，故，供试品溶剂加入量确定为25mL。
综上所述，北豆根标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例4
基于实施例1-3，本实施例对特征图谱构建中的色谱条件(波长、柱温、流速)进行考察，以对本技术方案作进一步的说明。
一、波长考察
利用二极管阵列检测器分别对木兰花碱、蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱、供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在250nm、270nm、284nm、300nm波长下的色谱图，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图6-9所示。
结果表明：在检测波长为284nm时，色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故，将检测波长确定为284nm。
二、柱温考察
将柱温分别设定为25℃、30℃、35℃，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如下图10所示。
结果表明：柱温为30℃时，色谱图峰形较为对称，分离度好，故，将柱温限定为30℃。
三、流速考察
将流速分别设定为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图11所示。
结果表明，流速分别为0.8mL/min、1.0mL/min时，各特征峰峰形均较好，分离度适中，故，流速确定为1.0mL/min，便于进行后续考察。
综上所述，北豆根标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.05％三乙胺溶液为流动相B，按下表3中的规定进行梯度洗脱，柱温为30℃，检测波长为284nm；理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000。
表3梯度洗脱程序
实施例5
基于实施例1中的北豆根标准汤剂的HPLC特征图谱的构建方法，本实施例还进行了如下的方法学考察，具体包括：
一、色谱峰指认
1.对照品溶液的制备：取蝙蝠葛苏林碱对照品，置棕色量瓶中，加甲醇，制成每1mL含蝙蝠葛苏林碱20μg的溶液，即得蝙蝠葛苏林碱对照品溶液；
取蝙蝠葛碱对照品，加甲醇，制成每1mL含35μg的溶液，即得蝙蝠葛碱对照品；
取木兰花碱对照品，加甲醇，制成每1mL含40μg的溶液，即得木兰花碱对照品；
2.空白对照溶液的制备：取50％甲醇25mL，置具塞锥形瓶中，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，即得；
3.供试品溶液的制备：取本品0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25mL，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
对北豆根标准汤剂特征图谱峰进行指认，所得结果如图12，其中，峰1为木兰花碱，峰4为蝙蝠葛苏林碱，峰5(S)为蝙蝠葛碱，在后续的方法学考察中，对供试品图谱中的五个峰进行考察。
二、精密度试验
取北豆根标准汤剂(批号：BDGBT181101)供试品溶液，连续进样六次，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，所得结果如下表4-5。
表4精密度考察-保留时间
表5精密度考察-峰面积
结果表明：该仪器精密度良好。
三、重复性考察
精密称取北豆根标准汤剂(批号：BDGBT181101)六份，按前述的北豆根标准汤剂的HPLC特征图谱的构建方法进行供试品溶液制备及测定，所得结果如下表6-7。
表6重复性考察-相对保留时间
表7重复性考察-相对峰面积
结果表明：六份样品的相对保留时间的RSD值为0.01～0.09％，相对峰面积RSD值为0.34～6.30％，说明该方法重复性良好。
四、中间精密度考察
1.不同仪器
基于前述的北豆根标准汤剂的特征图谱的构建方法，分别精密称取北豆根标准汤剂(批号：BDGBT181101)，两份，制备供试品溶液，分别在岛津20-AD、安捷伦1260、Waters2965型三台高效液相色谱仪上进行测定，结果如表8-9所示。
表8仪器耐用性考察-相对保留时间
表9仪器耐用性考察-相对峰面积
结果表明：上述三个品牌仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD值为0.25～15.31％。
2.不同人员和时间考察
基于前述的北豆根标准汤剂的特征图谱的构建方法，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取北豆根标准汤剂(批号：BDGBT181101)各两份，制备供试品溶液，进行测定，结果如表10-11所示。
表10人员和时间考察-相对保留时间
表11人员和时间考察-相对峰面积
结果表明：由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。
五、耐用性考察(色谱柱耐用性)
基于前述的北豆根标准汤剂的特征图谱的构建方法，分别对InertSustain-C18(5μm，4.6×250mm)、Diamonsil-C18(5μm，4.6×250mm)、Kromasil-C18(5μm，4.6×250mm)三种色谱柱进行考察，所得结果如下表12-13所示。
表12色谱柱耐用性考察-相对保留时间
表13色谱柱耐用性考察-相对峰面积
结果表明：用上述三种色谱柱对北豆根标准汤剂供试品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD值为0.02～5.40％，特征峰相对峰面积的RSD值为2.20～12.7％，表明该方法色谱柱耐用性良好。
六、稳定性考察
基于前述的北豆根标准汤剂的特征图谱的构建方法，取同一北豆根标准汤剂供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、18h、24h时测定，所得结果如下表14-15所示。
表14稳定性考察-保留时间
表15稳定性考察-峰面积
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD值为0.20～1.33％，特征峰峰面积的RSD值为0.78～8.14％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述：各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好，并将上述五个特征峰纳入后续考察。
七、总结
选择峰5为S峰时，各阶段相对保留时间的RSD值如下表16；选择峰1为S峰时，各阶段相对保留时间的RSD值如下表17。
表16峰5为S峰时，RSD值表—相对峰保留时间
表17峰1为S峰时，RSD值表—相对峰保留时间
综上所述：峰2选择峰1作为S峰时，耐用性均满足±8％的要求；峰3、峰4选择峰5作为S峰时，耐用性均满足±8％的要求，因此，选择峰1作为S1，峰5作为S2峰。
八、特征峰的确定及对照图谱的建立
1.二十二批北豆根标准汤剂验证结果
基于前述的北豆根标准汤剂的特征图谱的构建方法，对二十二批北豆根供试品进行特征图谱的分析，计算相对保留时间和相对峰面积，因色谱柱耐用性考察时，不同色谱柱色谱峰相对保留时间RSD最大值为5.4％，固规定值范围定为±8％，各色谱峰相对保留时间与相对峰面积分别如下表18-19及图13所示。
表18二十二批北豆根标准汤剂特征峰-相对保留时间
表19二十二批北豆根标准汤剂特征峰-相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了峰1、峰2、峰3、峰4、峰5即合计五个耐用性较好的峰作为特征峰。
2.相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总如下表20。
表20方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间
故将各峰的相对保留时间规定值暂定为8％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现五个特征峰，并应与对照药材参照物特征峰保留时间相对应，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内，规定值为1.665(峰2)；与蝙蝠葛碱参照物相应的峰为S2峰，计算峰3、峰4与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±8％之内，规定值为0.925(峰3)、0.944(峰4)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对二十二批北豆根标准汤剂进行合成，建立了北豆根标准汤剂特征图谱的对照图谱，可较为准确地整体控制北豆根标准汤剂的质量，如图1所示(其中，峰1(S1)：木兰花碱；峰4：蝙蝠葛苏林碱；峰5(S2)：蝙蝠葛碱)。
Claims (7)
1.一种北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取蝙蝠葛苏林碱对照品，置棕色量瓶中，加甲醇，制成每1mL含蝙蝠葛苏林碱20μg的溶液，即得蝙蝠葛苏林碱对照品溶液；
取蝙蝠葛碱对照品，加甲醇，制成每1mL含35μg的溶液，即得蝙蝠葛碱对照品；
取木兰花碱对照品，加甲醇，制成每1mL含40μg的溶液，即得木兰花碱对照品；
B．对照药材溶液的制备：取北豆根对照药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇，超声处理20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C．供试品溶液的制备：取本品，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇，超声处理20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
D．建立：分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，建立HPLC特征图谱；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%三乙胺溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：284nm；
理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000；
流动相按梯度洗脱程序为：
2.根据权利要求1所述的北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，所述北豆根标准汤剂的HPLC特征图谱包括五个特征峰，其中，各特征峰与对照药材参照物特征峰保留时间相对应，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，计算峰2与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8%之内，峰2规定值为1.665；与蝙蝠葛碱参照物相应的峰为S2峰，计算峰3-4与S2峰的相对保留时间，其相对保留之间规定值在±8%之内，峰3规定值为0.925，峰4规定值为0.944。
3.根据权利要求1所述的北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，在步骤B中，取北豆根对照药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，在步骤C中，取本品0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.根据权利要求1所述的北豆根标准汤剂特征图谱的构建方法，其特征在于，在步骤B及C的超声处理中，功率600W，频率40kHz。
6.一种根据权利要求1-5中任意一项所述的北豆根标准汤剂的质量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1．待测供试品溶液的制备：取本品，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇，超声处理20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2．检测：取经步骤S1所得的待测供试品溶液，注入至高效液相色谱仪，测定，并将所得高效液相色谱图与权利要求1-5中任意一项所得HPLC特征图谱进行比较，检测北豆根标准汤剂的质量及真伪；
高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
色谱柱柱温：30℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%三乙胺溶液为流动相B；
流动相流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：284nm；
理论板数按蝙蝠葛碱峰计算应不低于6000；
流动相按梯度洗脱程序为：
7.根据权利要求6所述的北豆根标准汤剂的质量检测方法，其特征在于，在步骤S1的超声处理中，功率600W，频率40kHz。
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