CN110274980B - 一种林下山参与园参新的区分鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,具体涉及通过二者低聚糖的含量大小和比例及低聚糖指纹图谱区分林下山参和园参。通过对林下山参与园参中低聚糖的分析结果表明,园参中低聚糖主要为蔗糖;林下山参中低聚糖主要为麦芽糖,且麦芽糖与蔗糖的比例为4:1至1:1;同时指纹图谱中蔗糖及麦芽糖的比例有较大差别,较容易区分。所以通过低聚糖的含量大小和比例及低聚糖指纹图谱能够成功实现对林下山参和园参的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明属于中药材鉴别方法领域,特别涉及一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,通过测定林下山参与园参中低聚糖的含量和比例,并采用低聚糖指纹图谱区分林下山参和园参。
背景技术
人参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey)的干燥根和根茎。栽培的俗称“园参”;播种在山林野生状态下自然生长的称“林下山参”(国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版.一部[M].中国医药科技出版社,2015.)。经大量研究证明,人参的主要有效成分为人参皂苷、人参低聚糖和人参多糖等(窦德强,黄力强主编.中国林下山参研究[M].沈阳:辽宁科学技术出版社, 2013.)。
低聚糖又称寡聚糖,指2-9个单糖基通过糖苷键连接而成直链或支链的一类糖。低聚糖的分类方法有多种,一种是均低聚糖,由一种单糖组合而成,例如麦芽糖,环糊精等;另一种是杂低聚糖,由多种单糖结合而成,如蔗糖,棉籽糖等。根据低聚糖的生物学功能又可将其分为功能性低聚糖,如异麦芽低聚糖,水苏糖等,及普通低聚糖,如蔗糖等。功能性低聚糖的生物活性众所周知,具有低热量,高稳定性,安全无毒等特点,低聚糖几乎不被人体消化吸收,含有能量接近于零。因此添加在食品中为肥胖者提供了放心的食物,在近些年的保健食品大潮中备受青睐。除此之外,人参低聚糖还可去除有害物质,预防和治疗便秘腹泻以及保护肝脏,有效降低血清胆固醇和血压,具有增强免疫力,抗衰老等功效(曲帅.人参有效活性成分的提取分离及含量测定[D].吉林大学,2013.)。人参低聚糖的研究及应用具有巨大的发展潜力和市场,在食品工业上具有良好的发展前景。发明人通过对不同年限的不同品系人参的低聚糖含量进行研究,发现园参与林下山参低聚糖含量和比例均有差别。
目前对食品中低聚糖检测的方法较多,主要包括化学检测法、高效液相色谱-荧光散射检测法、高效液相色谱-示差折光检测法、离子色谱法等。但是化学法耗时较长,只能测定总糖和还原糖的含量,无法进行准确的定性定量分析;高效液相色谱-荧光散射法由于需要目的物具有荧光特性,用于糖的检测时需要对其进行衍生化处理,降低了其通用性;而示差折光法的灵敏度较低、检测限较高,对于高含量的低聚糖产品尚可检出,但对于添加量较小而干扰成分较多的食品往往力所不及。同时示差检测法对环境温度,流动相组成的微小变化非常敏感,所以对实验过程要求较高,实验过程中必须控温,流动相不能走梯度等,使得其难以用于多种糖的同时分离检测;离子色谱法在糖含量的检测研究中较多,其灵敏度较好,但是糖类在电极表面能将某些分子氧化或还原,从而影响方法的准确性,并且受环境温度的影响。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷,本发明的目的在于提供一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,通过采用HPLC-ELSD方法对林下山参和园参中的低聚糖进行含量测定和指纹图谱研究,测定林下山参与园参中低聚糖的含量和比例,建立对二者进行区分鉴别的方法。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案。
一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,通过二者低聚糖的含量和比例区分林下山参和园参。
进一步地,所述的林下山参与园参新的区分鉴别方法,园参中低聚糖主要为蔗糖,林下山参中低聚糖主要是麦芽糖,且麦芽糖与蔗糖的比例为4:1至1:1。
一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,具体包括以下步骤。
1) 对照品溶液的制备:分别准确称取果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖各10mg,定容至10 mL容量瓶中,并用超纯水定容至刻度,配成各糖浓度均1 mg/mL 的混标液,4℃冰箱保存,待液HPLC分析。
2) 供试品溶液的制备:取人参药材粉末100mg(过60目筛),加10mL水饱和正丁醇超声30min(功率250W,频率35kHz),过滤,滤渣挥干后用10mL 80%乙醇超声提取30min(功率250W,频率35kHz),过滤。所得正丁醇提取液用5 mL水反洗。水反洗液与80%乙醇提取液合并,蒸干(水浴锅温度80~90℃),用水定容于2mL容量瓶,待测。
3) 色谱条件:检测器为蒸发光散射检测器(ELSD);色谱柱:AgilentZORBAX NH2柱(5μm,4.6×150mm);柱温30℃;流动相:A:乙腈,B:水;梯度洗脱程序见表1,流动相流速1mL/min,进样量10μL,漂移管温度为40℃,载气为氮气,增益为5。
一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,在2)中供试品溶液的制备中人参药材粉末加入水饱和正丁醇超声30min(功率250W,频率35kHz),可以除去人参皂苷。
一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,所述的方法不仅用于林下山参与园参的药材鉴别,也用于其制剂的鉴别。
与现有技术比,本发明的有益效果如下。
1. 林下山参的生长环境与野生山参相似,都是自然生长,而且不占用林地,能保护森林生态平衡,其品质及药用价值接近野山参的水平。林下山参作为几近枯竭的野山参的替代品,在市场和临床上得到大家的认可,成为优质人参的首要来源。但林下山参大多需要10多年甚至更多年份才能采收,导致很多不法商家以次充好,尤其用园参以假乱真。由于人为作假,很难通过传统性状鉴别对林下参和园参进行鉴别。DNA操作技术操作比较复杂,而且成本较高。另外林下山参制品中,林下山参以水煎液或原药材入药,对于林下山参产品鉴别无意增加困难。针对现有技术存在的缺陷,本发明的目的在于提供通过测定林下山参与园参中的低聚糖建立对二者的区分鉴别方法。通过对林下山参、园参中低聚糖成分测定结果表明,园参药材中主要含有蔗糖,林下山参中主要含有麦芽糖,且麦芽糖与蔗糖的比例为4:1至1:1,其指纹图谱也有较大差别,较容易区分。所以通过低聚糖含量大小及低聚糖指纹图谱能够成功实现对林下山参和园参的快速、准确鉴定。
2. 本发明对人参类药材中低聚糖的测定方法进行考察,确定其最佳供试品溶液制备方法,即取人参药材粉末100mg(过60目筛),加10mL水饱和正丁醇超声30min(功率250W,频率35kHz),过滤,滤渣挥干后用10mL 80%乙醇超声提取30min(功率250W,频率35kHz),过滤。所得正丁醇提取液用5 mL水反洗。水反洗液与80%乙醇提取液合并,蒸干(水浴锅温度80~90℃),用水定容于2mL容量瓶,待测。
3. 参考国标及文献方法,本发明中对人参低聚糖的测定采用HPLC-ELSD法,并优选出梯度洗脱条件及漂移管温度等项目的最佳条件。
4. 本发明提供的林下山参与园参新的区分鉴别方法具有适用性广,操作简单,易于掌握,准确性高和快速有效等优点,能够成功实现对林下山参和园参的鉴别。
附图说明
图1-图2为提取方法的考察。
图3为80%乙醇加热回流提取。
图4为70%乙醇加热回流提取。
图5为60%乙醇加热回流提取。
图6为80%乙醇超声提取。
图7为70%乙醇超声提取。
图8为60%乙醇超声提取。
图9为梯度洗脱条件的考察。
图10为漂移管温度的考察。
图11为10批园参指纹图谱。
图12为园参对照指纹图谱。
图13为不同年限林下山参指纹图谱。
图14为不同年限间林下山参对照指纹图谱。
图15为林下山参与园参对照指纹图谱对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。以下所述仅为本发明的优选实施例,并不用于限制本发明,对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。另外本发明所述的方法不仅用于林下山参和园参药材的鉴别,也可用于其制剂的鉴别。
实施例1低聚糖的测定方法条件考察实验。
1仪器及试药。
1.1仪器。
Agilent1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);万分之一分析天平(Acculab型 Sartorius group);旋转蒸发仪(RE-52C型,巩义市予华仪器有限公司)等。
1.2试药试剂。
色谱纯乙腈(Duksan,韩国德山);水为纯净水;乙酸乙酯(天津市东丽区天大化学试剂厂);无水乙醇(天津市科密欧有限公司)等。
2试验方法。
2.1提取方法的考察。
取人参药材粉末100mg (过60目筛),10mL乙酸乙酯超声30min,2mL甲醇定容;过滤,滤渣用10mL 100%乙醇、70%乙醇回流提取1h,滤液蒸干,用甲醇定容于2mL;然后滤渣用70%乙醇回流1h,滤液用2mL甲醇定容。
取人参药材粉末100mg (过60目筛),10mL水饱和正丁醇超声30min,过滤,滤渣用10mL 70%乙醇回流提取1h,过滤,滤液直接蒸干,用2mL水定容;滤渣继续用10mL水回流提取1h,再将滤液蒸干,用2mL水定容。
2.2对照品溶液的制备。
准确称取果糖、葡萄糖、蔗糖及麦芽糖等对照品适量,制成每lmL含1.0mg的溶液,即得。
3色谱条件。
AgilentZORBAX NH2柱(5μm,4.6 × 150mm);柱温30℃;流动相:A:乙腈,B:水;梯度洗脱程序见表1,流动相流速1mL/min,进样量10μL,漂移管温度为40℃,载气为氮气,增益为5。
4结果。
4.1提取方法的考察。
研究结果表明不能采用100%乙醇除去人参皂苷,因为100%乙醇能提取出大部分人参皂苷,但不能全部提取出来,而且会提取出大量人参低聚糖,最终结合2015版《中华人民共和国药典》提取人参皂苷的方法,用水饱和正丁醇超声提取30min,可以除去人参皂苷,再用70%乙醇回流提取1h,即可提取出低聚糖。色谱图详见附图中图1,A:混合对照品(1:鼠李糖;2:阿拉伯糖;3:果糖;4:甘露糖;5:葡萄糖;6:半乳糖;7:蔗果四糖);B:70%醇提(100%乙醇除皂苷后,用70%乙醇加热回流提取,溶液定容于2mL容量瓶);C:70%醇提(用水饱和正丁醇超声除皂苷后,用70%乙醇加热回流提取,溶液定容于2mL容量瓶)。
水饱和正丁醇可以提取出大部分人参皂苷,但是用高效液相检测出正丁醇层溶有少部分的低聚糖,可以用水反洗正丁醇部分,尽可能洗出正丁醇提取液里含有的低聚糖。色谱图详见附图中图2,E:70%醇提(100%乙醇除皂苷后,用70%乙醇加热回流提取,溶液定容于10mL容量瓶);F:正丁醇(用饱和正丁醇超声30min所得到的提取部分)。
4.2醇浓度的考察。
取人参药材粉末100mg (过60目筛),加10mL水饱和正丁醇超声30min,过滤,滤渣挥干后分别用10mL 80%乙醇回流提取1h、80%乙醇超声提取30min、70%乙醇回流提取1h、70%乙醇超声提取30min、60%乙醇回流提取1h、60%乙醇超声提取30min,过滤。所得正丁醇提取液用5 mL水反洗。水反洗液与各醇提取液合并,蒸干,用水定容于2mL容量瓶,待测。由色谱图图3至图8可知(注:G:果糖;H:葡萄糖;I:蔗糖;J:麦芽糖),加热和超声提取效果相差不大,且超声提取更简便,再比较两种提取方法中的醇浓度,80%醇提取出的低聚糖含量最多。
4.3检测器及色谱柱的考察。
采用氨基柱、糖分析柱及C18柱进行分离。氨基柱价格便宜且分离效果较好;糖分析柱较贵且对设备要求较高;C18柱价格适中但需通过衍生化提高糖类的疏水性后进行分离。对于检测手段,比较了示差折光检测器(RID)和蒸发光散射检测器(ELSD)。RID灵敏度低、系统平衡时间长且无法采用梯度洗脱;ELSD作为新一代通用型质量检测器,它对有质量的物质都能进行检测,特别是检测无电子和分子吸收光谱信号的化合物时,显示出一定的优越性,灵敏度可达RID的10倍。同时糖类物质因缺少共轭结构,不适于使用UV、PDA等检测器。因此,本实验采用ELSD检测器,它是一种不依赖于样品的光学特性的质量通用型检测器,可有效用于糖类成分检测。
4.4梯度洗脱条件的考察。
流动相:A:乙腈,B:水;采用梯度程序进行洗脱,比较不同洗脱条件的分离效果。
研究结果表明(图9),实验中用乙腈-水(86:14)、(80:20)、(80:20)、(70:30)及(65:35)作为流动相进行梯度洗脱,发现采用该洗脱条件时待测组分能达到较好分离且不受其他物质干扰。
4.5漂移管温度的考察。
比较漂移管温度为40℃、60℃及80℃时,待测组分的分离情况。结果表明漂移管温度为40℃时,待测组分能达到较好分离且不受其他物质干扰(图10)。
实施例2林下山参与园参中低聚糖的含量测定。
1仪器及试药。
1.1仪器:Agilent1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);万分之一分析天平(Acculab型 Sartorius group);十万分之一分析天平(CP225D型 Sartoriusgroup);CQ-250超声波清洗器(上海超声仪器厂)等。
1.2试药试剂:色谱纯乙腈(Duksan,韩国德山);水为纯净水;正丁醇(天津市科密欧有限公司);无水乙醇(天津市科密欧有限公司)。园参:样品1-10来源于黑龙江海林市海林镇;林下山参:上海雷允上神象药业辽宁桓仁野山参基地,7-19年,每个年份各取3个样品。
2溶液的制备。
2.1对照品溶液的制备:分别准确称取果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖各10mg定容至10mL容量瓶中,并用超纯水定容至刻度,配成各糖浓度均1mg/mL的混标液,4℃冰箱保存,待液相检测。
2.2供试品溶液的制备:取人参药材粉末100mg(过60目筛),加10mL水饱和正丁醇超声30min(功率250W,频率35kHz),过滤,滤渣挥干后,用10mL80%乙醇超声提取30min(功率250W,频率35kHz),正丁醇层用5 mL水反洗,合并滤液,滤液蒸干(水浴锅温度80~90℃)用2mL水定容,待测。
3色谱条件与系统适用性试验。
3.1色谱条件:检测器为蒸发光散射检测器(ELSD);色谱柱:AgilentZORBAX NH2柱(5μm,4.6×150mm);柱温30℃;流动相:A:乙腈,B:水;梯度洗脱程序见表1,流动相流速1mL/min,进样量10μL,漂移管温度为40℃,载气为氮气,增益为5。
3.2系统适用性试验。
3.2.1标准曲线的绘制:分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 µL,注入色谱仪中,测定其峰面积值。以对照品进样量(X)(µg)的对数值为横坐标,峰面积值(Y)的对数值为纵坐标,绘制标准曲线并进行线性回归。
3.2.2精密度:取对照溶液10 μL,重复进样6次,计算各峰面积、相对保留时间的RSD,结果表明各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积其RSD均小于5%,仪器精密度良好。
3.2.3重复性:分别精密称定供试品6份,分别进样10 μL,记录色谱图。计算各峰面积、相对保留时间的RSD,结果表明各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积其RSD均小于5%,结果表明,本方法重复性良好。
3.2.4稳定性:精密吸取同一供试品溶液10 μL,按照上述色谱条件,分别于0、6、12、18、24、30、36、48 h分析,记录色谱图。计算各峰峰面积、相对保留时间的RSD,结果表明各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积其RSD均小于5%,结果表明,供试品溶液在48 h内成分稳定。
4样品含量的测定:分别精密吸取人参样品溶液10 µL,按上述色谱条件测定,注入色谱仪中。根据公式(1)计算样品中各糖的含量。
W%=(V*m)/(V’*M)*100%.....................................(1)
式中,W为糖的百分含量,V为样品定容体积(mL),m为样品中对应糖的质量(μg),V’为进样体积(μL),M为人参样品质量(mg)。
5结果。
5.1各糖的标准曲线,见表5。
结果表明,果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖分别在2.06~10.30μg,2.10~10.50μg,2.04-10.20μg,2.18-10.90μg,2.14-10.70μg内呈良好的对数线性关系。
5.2样品的含量测定:分别精密吸取混合对照品溶液5 µL、10 µL,注入液相仪中,利用3.1项下色谱条件根据外标两点法,计算人参药材中各糖的含量见表6。
园参与林下山参相比,园参中蔗糖含量最高,林下山参中麦芽糖含量最高,园参中还含有少量的木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗果四糖,林下山参中不含有果糖和蔗果四糖。
实施例3林下山参与园参中低聚糖指纹图谱比较研究。
实验方法及操作步骤同实施例1。
分别精密吸取供试液各10 mL,注入液相色谱仪,记录30 min色谱图。借助Agilent软件对林下山参与园参供试品的检测结果进行处理,组成相应样本。用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)对数据进行分析,提取共有峰并生成对照图谱。色谱图详见附图中图11至图15(图12注:1-木糖,2-果糖,3-甘露糖,4-葡萄糖,5-蔗糖,6-麦芽糖,7-蔗果四糖;图13注:S1-S13分别代表7-19年;图15注:S1-林下山参,S2-园参)。
通过上述方法对林下山参、园参中低聚糖分析结果表明,园参药材中主要含有蔗糖;林下山参中主要含有麦芽糖,且麦芽糖与蔗糖的比例为4:1至1:1;同时指纹图谱中蔗糖及麦芽糖的比例有较大差别,较容易区分。所以通过低聚糖含量大小和比例及低聚糖指纹图谱能够成功实现对林下山参和园参的快速、准确鉴定。
Claims (2)
1.一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,其特征在于通过二者低聚糖的比例区分林下山参和园参;园参中低聚糖主要为蔗糖,蔗糖的含量高于麦芽糖;林下山参中低聚糖主要是麦芽糖,且麦芽糖与蔗糖的比例为4:1至1:1;同时指纹图谱中蔗糖及麦芽糖的比例有较大差别,较容易区分,通过低聚糖比例及低聚糖指纹图谱能够实现对林下山参和园参的快速、准确鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种林下山参与园参新的区分鉴别方法,所述的方法不仅用于林下山参与园参的药材鉴别,也用于其制剂的鉴别。
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