CN110501435B - 辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，具体涉及产品质量检测技术领域。本发明采用高效液相指纹图谱技术结合指纹图谱评价软件，通过对测定波长、流动相洗脱程序、流速、柱温、进样量进行筛选和优化，得出了分离度良好、基线平稳、无负吸收色谱峰，且成分种类丰富、含量高的样品制备方法和指纹图谱色谱条件，经过多批次产品指纹图谱相似度比较分析，得出各指纹图谱相似度均在0.96以上，表明本发明方法能够准确、稳定、可靠地将该固体饮料产品中各种成分信息反映在指纹图谱中，能够对产品的质量进行全面、客观、科学地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及有效性。

Description

辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法

【技术领域】

本发明涉及产品质量检测技术领域，具体涉及辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法。

【背景技术】

辣木叶荷叶人参固体饮料为我公司自主开发的辣木系列产品之一，主要原料包括：辣木叶、荷叶，决明子、人参和辅料，具有降糖降脂、增强免疫力、调节血压等功效，并能为人体提供能量、蛋白质、碳水化合物等营养补充；食品生产许可证编号为：SC10644011600111，市场反映良好，是我公司畅销品种之一。目前，对于该产品的质量控制仅限于理化指标、微生物限度等宏观特性的检测，缺少对该产品中化学成分的检测方法。而真正体现产品内在质量的是其中的化学成分，其含量及种类的稳定，能很好地体现产品的质量一致性，由于化学成分检测方法的缺失，缺少一种能更全面体现产品质量标准的检测方法，很难满足目前销售者对高质量产品的日益严苛需求。

为进一步提高辣木叶荷叶人参固体饮料质量标准，提高产品的稳定性及有效性，全面反映产品中的各类成分信息，有必要开发一种能够切实检测辣木叶荷叶人参固体饮料的质量的检测方法。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：针对目前辣木叶荷叶人参固体饮料质量的检测方法较弱的技术问题，本发明提供一种辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，采用高效液相指纹图谱技术结合指纹图谱评价软件，对辣木叶荷叶人参固体饮料进行质量控制，经过多批次产品指纹图谱相似度比较分析，得出各指纹图谱相似度均在0.96以上，表明本发明方法能够准确、稳定、可靠地将该固体饮料产品中各种成分信息反映在指纹图谱中，能够对产品的质量进行全面、客观、科学地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及有效性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，包括以下步骤：

a.供试品溶液的制备：称取辣木叶荷叶人参固体饮料，加入纯化水，振荡摇匀后，用滤膜过滤，得供试品溶液；

b.对照品溶液的制备：称取异槲皮苷对照品置于容量瓶中，加入甲醇使溶解，得对照品溶液；

c.溶液测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得供试品指纹图谱和对照品图谱；所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇为流动相A、以无机酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱。

d.相似度评价：取5～15个批次辣木叶荷叶人参固体饮料按步骤a至c的方法得到对应的供试品指纹图谱，然后将供试品指纹图谱导入相似度评价软件进行相似度评价。

优化的，所述辣木叶荷叶人参固体饮料包括以下原料：辣木叶、荷叶、决明子和人参。

进一步优化的，包括以下步骤：

a.供试品溶液的制备：称取辣木叶荷叶人参固体饮料，加入料液比为1:5～1:15的纯化水，振荡摇匀后，用滤膜过滤，得供试品溶液；

b.对照品溶液的制备：称取异槲皮苷对照品置于容量瓶中，加入料液比为1:500～1:2000的甲醇使溶解，得对照品溶液；

c.溶液测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得指纹图谱和对照品图谱；所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇为流动相A、以0.02％-0.1％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1mL/min，波长为210～230nm，进样量为5～10μL，柱温为30～35℃。

d.相似度评价：取12个批次辣木叶荷叶人参固体饮料按步骤a至c的方法得到对应的供试品指纹图谱，然后将供试品指纹图谱导入相似度评价软件进行相似度评价。

更进一步优化的，所述色谱条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇为流动相A、以0.05％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为1mL/min，波长为215nm，进样量为5μL，柱温为35℃。

再更进一步优化的，所述梯度洗脱按如下程序进行：按体积百分比计，0～20分钟，流动相A由5％上升至10％，流动相B由95％下降至90％；20～40分钟，流动相A由10％上升至28％，流动相B由90％下降至72％；40～65分钟，流动相A由28％上升至50％，流动相B由72％下降至50％；65～75分钟，流动相A由50％上升至98％，流动相B由50％下降至2％。

再更进一步优化的，制得指纹图谱后，进行相似度评价，所述相似度评价方法为：取不同批次的辣木叶荷叶人参固体饮料，制备成对应的供试品溶液，测定得到对应的指纹图谱，将得到的所有指纹图谱导入相似度评价软件进行相似度评价分析，确定相似度≥0.96，确定出18个共有峰，编号依次为1～18，由对照品色谱图中异槲皮苷色谱峰的保留时确定指纹图谱中14号峰为异槲皮苷；以14号峰为参照峰，1号峰的相对保留时间为0.038～0.039，2号峰的相对保留时间为0.045～0.046，3号峰的相对保留时间为0.055～0.056，4号峰的相对保留时间为0.087～0.094，5号峰的相对保留时间为0.237～0.249，6号峰的相对保留时间为0.449～0.468，7号峰的相对保留时间为0.502～0.509，8号峰的相对保留时间为0.600～0.609，9号峰的相对保留时间为0.685～0.696，10号峰的相对保留时间为0.732～0.747，11号峰的相对保留时间为0.805～0.818，12号峰的相对保留时间为0.914～0.928，13号峰的相对保留时间为0.920～0.946，14号峰的相对保留时间为1.000，15号峰的相对保留时间为1.033～1.048，16号峰的相对保留时间为1.076～1.093，17号峰的相对保留时间为1.116～1.134，18号峰的相对保留时间为1.149～1.169。

再更进一步优化的，以14号峰为参照，1号峰的相对峰面积为0.116～0.126，2号峰的相对峰面积为0.190～0.203，3号峰的相对峰面积为0.302～0.319，4号峰的相对峰面积为0.535～0.568，5号峰的相对峰面积为0.169～0.185，6号峰的相对峰面积为0.256～0.276，7号峰的相对峰面积为0.296～0.322，8号峰的相对峰面积为0.220～0.242，9号峰的相对峰面积为0.236～0.251，10号峰的相对峰面积为0.159～0.170，11号峰的相对峰面积为0.384～0.421，12号峰的相对峰面积为0.112～0.120，13号峰的相对峰面积为0.118～0.130，14号峰的相对峰面积为1.000，15号峰的相对峰面积为0.581～0.599，16号峰的相对峰面积为0.241～0.258，17号峰的相对峰面积为0.215～0.232，18号峰的相对峰面积为0.082～0.093。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1.本发明采用高效液相指纹图谱技术结合指纹图谱评价软件，对辣木叶荷叶人参固体饮料进行质量控制，经过多批次产品指纹图谱相似度比较分析，得出各指纹图谱相似度均在0.96以上，表明本发明方法能够准确、稳定、可靠地将该固体饮料产品中各种成分信息反映在指纹图谱中，能够对产品的质量进行全面、客观、科学地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及有效性。

2.本发明经过多次创造性实验研究，通过对测定波长、流动相洗脱程序、流速、柱温、进样量进行筛选和优化，得出了分离度良好、基线平稳、无负吸收色谱峰，且成分种类丰富、含量高的指纹图谱色谱条件。通过进行方法学考察试验，验证本发明方法在指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积上均表现出良好的精密度、稳定性和重复性，同时经过指纹图谱相似度软件比较分析后，得出相似度均在0.97以上，表明本发明方法能够准确、全面反映产品所包含的成分信息，能够有效保证产品质量的稳定性和有效性。

3.本发明以异槲皮苷作为参照峰，其在指纹图谱中保留时间适中，与前后色谱峰之间分离度均大于1.5，用于计算相对保留时间和相对峰面积精确度高、重复性好，能够准确反映指纹图谱所包含的成分信息，能够有效保证产品质量的稳定性和有效性。

4.辣木叶荷叶人参固体饮料由主要四味原料有机配合而制成，化学成分较为复杂，单一成分的含量测定往往带有片面性，不能反映产品的整体成分信息。本发明在产品的质量标准中引入中药指纹图谱技术，能够较为全面、快速、精准的体现其中复杂的成分差异，全面反映产品中的各类成分信息，为产品的质量标准控制提供一种很好的方法，可以有效提高产品的质量控制标准。

【附图说明】

图1不同波长指纹图谱叠加图；

图2不同洗脱程序指纹图谱叠加图；

图3异槲皮苷对照品色谱图与指纹图谱叠加图；

图4精密度试验指纹图谱叠加图；

图5重复性试验指纹图谱叠加图；

图6稳定性试验指纹图谱叠加图；

图7 12个批次产品指纹图谱叠加图。

【具体实施方式】

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.实验材料

1.1仪器与材料：Agilengt1100系列高效液相色谱仪(包括DAD阵列检测器，美国Agilent公司)、Platisil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)、Diamonsi C18(4.6mm×250mm，5μm)、DV215CD型电子天平(美国奥豪斯公司)；

1.2试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)、磷酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)、异槲皮苷对照品(北京仪化通标科技有限公司，批号170526-0373)、超纯水；

1.3样品：辣木叶荷叶人参固体饮料(批号：0501、0502、0503、0504、0505、0506、0507、0508、0509、0510、0511、0512)。

2.样品制备

2.1供试品溶液的制备：精密称取辣木叶荷叶人参固体饮料1.0g，置于烧杯中，精密加入5-15mL纯化水，振荡摇匀，于0.45um水系滤膜中过滤至进样瓶中，即得。

2.2对照品溶液的制备：精密称取异槲皮苷0.005-0.02g于10mL容量瓶中，加甲醇定容，得异槲皮苷对照品溶液。

3.色谱条件的确定

3.1检测波长的选择：将供试品溶液注入色谱仪中，采用全波长(190-900nm)扫描模式，分析210、215、220、230nm波长下指纹图谱，使用的色谱条件为：Diamonsi C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A、以0.05％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8-1mL/min，波长为215nm，进样量为5-15μL，柱温为30-35℃；梯度洗脱程序为：按体积百分比计，0～20分钟，流动相A由5％上升至10％，流动相B由95％下降至90％；20～40分钟，流动相A由10％上升至28％，流动相B由90％下降至72％；40～65分钟，流动相A由28％上升至50％，流动相B由72％下降至50％；65～75分钟，流动相A由50％上升至98％，流动相B由50％下降至2％。

结果显示210、215、220、230nm 4个波长下的指纹图谱中，215nm下谱图分离度良好、基线平稳、无负吸收色谱峰，且成分种类丰富、含量高，故确定215nm作为检测波长，见图1。

3.2色谱柱的选择：分别使用Diamonsi C18(4.6mm×250mm，5μm)、Platisil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱于3.1项确定的色谱相条件下对供试品溶液进样分析，结果显示两者谱图信息都丰富，但PlatisilC18(4.6mm×250mm，5μm)所得指纹图谱色谱峰分离度较好且基线平稳，因此确定采用Platisil C18色谱柱进行进样分析。

3.3流动相系统的选择：分别采用甲醇-0.02％磷酸、甲醇-0.05％磷酸、甲醇-0.1％磷酸、乙腈-0.02％磷酸、乙腈-0.05％磷酸、乙腈-0.1％磷酸为流动相系统，于3.1项确定的色谱相条件下对供试品溶液进样分析，结果显示采用甲醇-0.02％磷酸、乙腈-0.02％磷酸时色谱峰分离度稍差，采用甲醇-0.1％磷酸、乙腈-0.1％磷酸时色谱柱使用一段时间后指纹图谱后段会出现基线漂移，使用甲醇-0.05％磷酸所得指纹图谱信息量丰富，因此确定以甲醇-0.05％磷酸为流动相。

3.4洗脱程序的选择：取供试品溶液，采用PlatisilC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A、以0.05％的磷酸水溶液为流动相B进行以下3个梯度洗脱程序的考察，流速为1mL/min，波长为215nm，进样量为5-15μL，柱温为35℃。

洗脱程序1：按体积百分比计，0～20分钟，流动相A由5％上升至10％，流动相B由95％下降至90％；20～40分钟，流动相A由10％上升至28％，流动相B由90％下降至72％；40～65分钟，流动相A由28％上升至50％，流动相B由72％下降至50％；65～75分钟，流动相A由50％上升至98％，流动相B由50％下降至2％。

洗脱程序2：按体积百分比计，0～20分钟，流动相A由5％上升至10％，流动相B由95％下降至90％；20～21分钟，流动相A由10％上升至20％，流动相B由90％下降至80％；21～30分钟，流动相A由20％上升至28％，流动相B由80％下降至72％；30～65分钟，流动相A由28％上升至50％，流动相B由72％下降至50％；65～75分钟，流动相A由50％上升至98％，流动相B由50％下降至2％。

洗脱程序3：按体积百分比计，0～25分钟，流动相A由5％上升至10％，流动相B由95％下降至90％；25～40分钟，流动相A由10％上升至28％，流动相B由90％下降至72％；40～65分钟，流动相A由28％上升至50％，流动相B由72％下降至50％；65～75分钟，流动相A由50％上升至98％，流动相B由50％下降至2％。

结果显示洗脱程序2和3，在谱图的前段及中段的分离度都没得到明显改善，鉴于洗脱程序1中段及后段高含量成分的分离度较好，且基线平稳，因此确定选用洗脱程序1进行样品分析，见图2。

3.5其他条件确定：由于进样量、流速和柱温的变动对指纹图谱色谱峰信息呈现带来的影响不大，经过考察，从高含量成分分离度、基线平稳性方面考虑，优选采用进样量5μL、流速1.0mL/min、柱温35℃。

综上分析，色谱条件确定为：采用PlatisilC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以甲醇为流动相A、以0.05％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为1mL/min，波长为215nm，进样量为5μL，柱温为35℃；洗脱程序为：按体积百分比计，0～20分钟，流动相A由5％上升至10％，流动相B由95％下降至90％；20～40分钟，流动相A由10％上升至28％，流动相B由90％下降至72％；40～65分钟，流动相A由28％上升至50％，流动相B由72％下降至50％；65～75分钟，流动相A由50％上升至98％，流动相B由50％下降至2％。

4.方法学考察

将指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)”进行相似度评价分析，确定出18个共有峰，编号依次为1～18，由对照品色谱图中异槲皮苷色谱峰的保留时确定指纹图谱中14号峰为异槲皮苷，见图3。

4.1精密度试验：取新制备的同一供试品溶液(0501)，连续进样6次，记录各指纹图谱，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间的RSD≤3.0％、见表1，相对峰面积的RSD≤3.0％、见表2，且各图谱相似度均在0.97以上，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求，见图4。

表1精密度试验相似度评价结果(共有峰相对保留时间)

表2精密度试验相似度评价结果(共有峰相对峰面积)

4.2重复性试验：取辣木叶荷叶人参固体饮料产品6个批次(0501-0506)制备得到6份供试品溶液依次注入高效液相色谱仪，记录各指纹图谱，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间的RSD≤2.5％、见表3，相对峰面积的RSD≤3.0％、见表4，且各图谱相似度均在0.97以上，表明该方法的重复性良好，符合指纹图谱的技术要求，见图5。

表3重复性试验相似度评价结果(共有峰相对保留时间)

表4重复性试验相似度评价结果(共有峰相对峰面积)

4.3稳定性试验：取新制备的同一供试品溶液(0501)，分别于0、2、4、6、8、24h时进样，记录各指纹图谱，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间的RSD≤1.5％、见表5，相对峰面积的RSD≤3.5％、见表6，且各指纹图谱相似度均在0.97以上，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，见图6。

表5稳定性试验相似度评价结果(共有峰相对保留时间)

表6稳定性试验相似度评价结果(共有峰相对峰面积)

5.多批次辣木叶荷叶人参固体饮料产品相似度评价

取12批(0501-0512)辣木叶荷叶人参固体饮料产品制成12份供试品溶液注入高效液相色谱仪得指纹图谱，然后进行指纹图谱相似度评价，结果相对保留时间的RSD≤2.0％，相对峰面积的RSD≤4.0％，且各指纹图谱相似度均在0.96以上，这说明本产品在生产过程中工艺稳定、产品质量控制良好，也说明使用指纹图谱技术可以对本产品的质量控制提供一种快捷、准确的质量标准，结果见表7、表8、图7。

表7 12批产品指纹图谱共有峰相对保留时间

表8 12批产品指纹图谱共有峰相对峰面积

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (4)

1.一种辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.供试品溶液的制备：称取辣木叶荷叶人参固体饮料，加入料液比为1:5～1:15的纯化水，振荡摇匀后，用滤膜过滤，得供试品溶液；

b.对照品溶液的制备：称取异槲皮苷对照品置于容量瓶中，加入料液比为1:500～1:2000的甲醇使溶解，得对照品溶液；

c.溶液测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得指纹图谱和对照品图谱；所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇为流动相A、以0.02%-0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1mL/min，波长为210～230nm，进样量为5～10μL，柱温为30～35℃；所述梯度洗脱按如下程序进行：按体积百分比计，0～20分钟，流动相A由5%上升至10%，流动相B由95%下降至90%；20～40分钟，流动相A由10%上升至28%，流动相B由90%下降至72%；40～65分钟，流动相A由28%上升至50%，流动相B由72%下降至50%；65～75分钟，流动相A由50%上升至98%，流动相B由50%下降至2%；

d.相似度评价：取12个批次辣木叶荷叶人参固体饮料按步骤a至c的方法得到对应的供试品指纹图谱，然后将供试品指纹图谱导入相似度评价软件进行相似度评价。

2.根据权利要求1所述的辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇为流动相A、以0.05%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为1mL/min，波长为215nm，进样量为5μL，柱温为35℃。

3.根据权利要求1所述的辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，其特征在于，制得指纹图谱后，进行相似度评价，所述相似度评价方法为：将指纹图谱导入相似度评价软件进行相似度评价分析，确定相似度≥0.96，确定出18个共有峰，编号依次为1～18，由对照品色谱图中异槲皮苷色谱峰的保留时确定指纹图谱中14号峰为异槲皮苷；以14号峰为参照峰，1号峰的相对保留时间为0.038～0.039，2号峰的相对保留时间为0.045～0.046，3号峰的相对保留时间为0.055～0.056，4号峰的相对保留时间为0.087～0.094，5号峰的相对保留时间为0.237～0.249，6号峰的相对保留时间为0.449～0.468，7号峰的相对保留时间为0.502～0.509，8号峰的相对保留时间为0.600～0.609，9号峰的相对保留时间为0.685～0.696，10号峰的相对保留时间为0.732～0.747，11号峰的相对保留时间为0.805～0.818，12号峰的相对保留时间为0.914～0.928，13号峰的相对保留时间为0.920～0.946，14号峰的相对保留时间为1.000，15号峰的相对保留时间为1.033～1.048，16号峰的相对保留时间为1.076～1.093，17号峰的相对保留时间为1.116～1.134，18号峰的相对保留时间为1.149～1.169。

4.根据权利要求1所述的辣木叶荷叶人参固体饮料的指纹图谱质量检测方法，其特征在于，以14号峰为参照，1号峰的相对峰面积为0.116～0.126，2号峰的相对峰面积为0.190～0.203，3号峰的相对峰面积为0.302～0.319，4号峰的相对峰面积为0.535～0.568，5号峰的相对峰面积为0.169～0.185，6号峰的相对峰面积为0.256～0.276，7号峰的相对峰面积为0.296～0.322，8号峰的相对峰面积为0.220～0.242，9号峰的相对峰面积为0.236～0.251，10号峰的相对峰面积为0.159～0.170，11号峰的相对峰面积为0.384～0.421，12号峰的相对峰面积为0.112～0.120，13号峰的相对峰面积为0.118～0.130，14号峰的相对峰面积为1.000，15号峰的相对峰面积为0.581～0.599，16号峰的相对峰面积为0.241～0.258，17号峰的相对峰面积为0.215～0.232，18号峰的相对峰面积为0.082～0.093。

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