CN113945654B - 一种两色金鸡菊水提物的检测方法 - Google Patents
一种两色金鸡菊水提物的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种两色金鸡菊水提物的检测方法,采用甲酸水溶液‑乙腈为流动相,C18(4.6mmX250mm,5μm)为固定相,纯水溶液为溶解溶剂,构建两色金鸡菊药材水提物指纹图谱以及同时测定6个指标成分的含量,该方法分离度高、稳定性和重现性好,既可用作两色金鸡菊药材指纹图谱的构建方法,又可用于同时测定药材中黄诺马苷等六个成分的含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其是涉及一种两色金鸡菊水提物的检测方法。
背景技术
两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)又名雪菊、金鸡菊,系菊科金鸡菊属植物的干燥头状花序,始载于《新华本草纲要》,味甘,性平,归大肠经,由于两色金鸡菊生长环境少污染,富含多种对人体有益成分,可作为一种茶饮,还拥有非常显著的药用及保健价值,是与天山雪莲齐名的名贵药材,作为新疆地区临床应用广泛的维吾尔族民族药,具有清热解毒、活血化瘀等作用,民间多选用其当花茶饮用。现代药理学研究表明两色金鸡菊具有改善血脂、调节血糖、降低血压、抗菌及抗氧化等活性。
近年来,两色金鸡菊的头状花序作为保健茶饮在国内受到热捧,因此对两色金鸡菊的研究日趋频繁,但对两色金鸡菊水提物的研究鲜有报道。目前文献报道虽有对两色金鸡菊粗提物进行指纹图谱的建立、含量测定的研究,但多是针对其醇提物,分离度差,且对茶饮中相对含量较高的黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁上缺乏含量测定研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种两色金鸡菊水提物的检测方法。
本发明采用的技术方案是:
一种两色金鸡菊水提物的检测方法,具体步骤如下:
(1)供试品溶液的制备
精密称量两色金鸡菊样品1~5g于100mL烧杯中,倒入40~60mL沸水,盖上锡箔纸,冲泡25~35min,将茶汤滤出,继续加40~60mL沸水冲泡25~35min,滤出茶汤,合并两次茶汤,摇匀,待茶汤的温度降低后,定容至35~45mL,过0.22μm微孔滤膜,获得续滤液,即得;
(2)对照品溶液的制备
精密吸取对照品黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁,加入甲醇溶解,制备混合对照品溶液;
(3)HPLC检测
精密吸取步骤(1)中所述供试品溶液,进行高效液相色谱测定,色谱条件为:色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,柱温为20~45℃;流动相A为乙腈,流动相B为水,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下;流速为0.4~1.2mL/min;检测波长为254~365nm;进样量为5~15μL;
(4)构建特征指纹图谱
将步骤(3)中获得的供试品溶液色谱图导出,并导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”,获得两色金鸡菊药材的HPLC特征指纹图谱。
(5)多成分含量的测定
精密吸取步骤(2)中混合对照品溶液,进行高效液相色谱测定,绘制标准曲线,确定线性回归方程,测定步骤(1)两色金鸡菊供试品溶液,即得成分含量。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,所述步骤(1)中供试品溶液的制备:精密称量两色金鸡菊样品2g于100mL烧杯中,倒入50mL沸水,盖上锡箔纸,冲泡30min,将茶汤滤出,继续加50mL沸水冲泡30min,滤出茶汤,合并两次茶汤,摇匀,待茶汤的温度降至室温后,定容至40mL,过0.22μm微孔滤膜,获得续滤液,即得。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(2)所述对照品溶液的制备:精密称量黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁对照品适量,加甲醇溶解,摇匀,配制得到每1mL含黄诺马苷400~600μg、异奥卡宁50~150μg、马里苷150~200μg、花旗松素20~80μg、金鸡菊苷20~40μg、奥卡宁5~15μg的对照品溶液。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(3)所述色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(3)所述柱温为35~40℃。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(3)所述流动相A为乙腈,流动相B为0.1%甲酸水,进行梯度洗脱,梯度洗脱优选如下;
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(3)所述流速为0.6~1.0mL/min。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(3)所述检测波长为280~300nm。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(3)所述进样量为8~12μL。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(4)所述导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”后,选择各批次两色金鸡菊药材的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰,用平均数法生成两色金鸡菊药材的对照指纹图谱,计算各批两色金鸡菊样品间的相似度。
优选的,上述两色金鸡菊水提物的检测方法,步骤(5)所述多成分含量测定:精密吸取步骤(2)中混合对照品溶液10μL,倍比稀释,进行高效液相色谱测定,以浓度对峰面积进行处理,绘制标准曲线,确定线性回归方程,使用外标法分别计算两色金鸡菊中黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁六个成分的含量。
本发明的有益效果是:
上述两色金鸡菊水提物的检测方法,对HPLC特征指纹图谱及多成分含量进行检测,该方法分离度高、稳定性和重现性好,既可用作两色金鸡菊药材指纹图谱的构建方法,又可用于同时测定药材中黄诺马苷等六个成分的含量测定。
所述检测方法采用甲酸水溶液-乙腈为流动相,C18(4.6mmX250mm,5μm)为固定相,纯水溶液为溶解溶剂,构建两色金鸡菊药材水提物指纹图谱以及同时测定6个指标成分的含量。该检测方法填补了目前未有的空缺,有效克服了现有技术中分离度差的问题,具有操作简便、分离度高、稳定性和重现性好,既可用作两色金鸡菊药材水提物指纹图谱的检测,又可用于同时测定药材中黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁等六个成分的含量检测。
附图说明
图1为为10批两色金鸡菊药材水提物HPLC指纹图谱和对照图谱。
图2为为两色金鸡菊药材色谱峰对照品指认图,其中A为供试品溶液,B为对照品溶液,1黄诺马苷、2异奥卡宁、3马里苷、4花旗松素、5金鸡菊苷、6奥卡宁。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案,下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1两色金鸡菊水提物HPLC特征指纹图谱的构建
1仪器与试药
高效液相色谱仪(美国沃特世科技有限公司,型号:Waters e2695,Waters 2998PDA Detector);Empower工作站;电子天平(德国赛多利斯集团,型号:MSA125P);多功能粉碎机(永康市金穗机械制造厂,型号:800A);调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司,型号:DZTW);涡旋振荡器(赛默飞世尔科技有限公司,型号:G3KT18273);高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司,型号:5424R);超声波清洗机(天津知著科技有限公司,型号:ZZ-3200DTS);Milli-Q超纯水制备仪(上海默克化工技术有限公司,型号:IQ7005)。
HPLC级色谱纯甲酸(批号:UN1779)购自美国ACS恩科化学;HPLC级色谱纯乙腈(批号:UNI648)和甲醇(批号:UNI230)均购自天津康科德科技有限公司;其他试剂均为分析纯。
两色金鸡菊样品共10批,取自全国各省和地区,收集信息见表1。
表1 10批两色金鸡菊样品信息
2试验方法
(1)两色金鸡菊药材供试品溶液的配制
精密称量两色金鸡菊样品2g于100mL烧杯中,倒入50mL沸水,盖上锡箔纸,冲泡30min,将茶汤滤出,继续加50mL沸水冲泡30min,滤出茶汤,合并两次茶汤,摇匀,待茶汤的温度降至室温后,定容至40mL,过0.22μm微孔滤膜,获得续滤液,即得。
(2)色谱条件
色谱柱为AgilentEclipsePlusC18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,柱温为30℃;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%甲酸水,进行梯度洗脱;流速为0.8mL/min;检测波长为291nm;进样量为10μL。梯度洗脱程序见表2。
表2梯度洗脱流动相配比
3指纹图谱的方法验证
对指纹图谱检测方法的精密度、稳定性、重复性进行考察,结果证明,精密度、稳定性、重复性良好,满足指纹图谱的要求。
(1)精密度试验
日内精密度:取同一供试品溶液,连续进样6次,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.15%,相对峰面积RSD<2.51%,表明仪器精密度良好,满足指纹图谱要求。
日间精密度:取同一供试品溶液,连续进样3天分析,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.67%,相对峰面积RSD<4.32%,表明仪器精密度良好,满足指纹图谱要求。
(2)稳定性试验
取同一供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24h时进样测定,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.19%,相对峰面积RSD<2.97%,表明供试品溶液在24h内稳定,满足指纹图谱要求。
(3)重复性试验
取同一样品6份,分别制备供试品溶液,进样测定,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.07%,相对峰面积RSD<2.20%,表明该方法具有良好的重现性,满足指纹图谱要求。
4HPLC特征指纹图谱的建立
记录各批次两色金鸡菊药材的HPLC指纹图谱。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件自动匹配10批次两色金鸡菊药材HPLC色谱图色谱峰的保留时间和峰面积等参数,以平均数法生成对照指纹图谱,并将时间窗宽度设为0.1min,建立两色金鸡菊药材指纹图谱的叠加图,如图1所示,比较分析10批样品测定结果,各色谱峰的分离较好,符合指纹图谱检测要求。同时采用该系统作相似度评价,结果显示此10批两色金鸡菊样品间的相似度均大于0.962,见表3,表明各批两色金鸡菊药材具有良好的一致性。
表3 10批两色金鸡菊药材的相似度
实施例2两色金鸡菊药材多成分含量的测定方法
1仪器与试药
高效液相色谱仪(美国沃特世科技有限公司,型号:Waters e2695,Waters 2998PDA Detector);Empower工作站;电子天平(德国赛多利斯集团,型号:MSA125P);涡旋振荡器(赛默飞世尔科技有限公司,型号:G3KT18273)。
对照品黄诺马苷(批号:DST191102-240)、异奥卡宁(批号:DST200509-453)、马里苷(批号:DST200311-132)、奥卡宁(批号:DST191210-105)购自成都德思特生物科技有限公司;花旗松素(批号:wkq18030202)和金鸡菊苷(批号:wkq20061703)购自四川省维克奇生物科技有限公司;液相色谱法测定质量分数>98%。HPLC级色谱纯甲酸(批号:UN1779)购自美国ACS恩科化学;HPLC级色谱纯乙腈(批号:UNI648)和甲醇(批号:UNI230)均购自天津康科德科技有限公司;其他试剂均为分析纯。
2试验方法
(1)两色金鸡菊药材供试品溶液的配制
精密称量两色金鸡菊样品2g于100mL烧杯中,倒入50mL沸水,盖上锡箔纸,冲泡30min,将茶汤滤出,继续加50mL沸水冲泡30min,滤出茶汤,合并两次茶汤,摇匀,待茶汤的温度降至室温后,定容至40mL,过0.22μm微孔滤膜,获得续滤液,即得。
(2)混合对照品溶液的配制
精密称量黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁对照品适量,加甲醇溶解,摇匀,配制得到每1mL含黄诺马苷500μg、异奥卡宁100μg、马里苷180μg、花旗松素50μg、金鸡菊苷30μg、奥卡宁10μg的对照品溶液。
(3)色谱条件
色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,柱温为30℃;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%甲酸水,进行梯度洗脱;流速为0.8mL/min;检测波长为291nm;进样量为10μL。梯度洗脱程序见表2。
表4梯度洗脱流动相配比
3多成分含量测定的方法学验证
对该含量测定检测方法进行方法学验证,结果证明,方法的精密度、稳定性、重复性、专属性、准确度、线性良好,满足含量测定的要求。
(1)精密度试验
日内精密度:取同一供试品溶液,连续进样6次,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.15%,相对峰面积RSD<2.51%,表明仪器精密度良好。
日间精密度:取同一供试品溶液,连续进样3天分析,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.67%,相对峰面积RSD<4.32%,表明仪器精密度良好。
(2)稳定性试验
取同一供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24h时进样测定,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.19%,相对峰面积RSD<2.97%,表明供试品溶液在24h内稳定。
(3)重复性试验
取同一样品6份,分别制备供试品溶液,进样测定,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果各峰的相对保留时间RSD<0.07%,相对峰面积RSD<2.20%,表明该方法具有良好的重现性。
(4)专属性试验
取同一批供试品溶液、混合对照品溶液和空白溶液,进行高效液相色谱测定,采集色谱图,在此条件下,各成分色谱峰均能达到基线分离,如图2所示。
(5)准确度试验
取已知含量的两色金鸡菊样品9份,制备成供试品溶液,分成3组,根据指标成分含量按约1:0.8、1:1、1:1.2的量每组分别精密加入含有一定浓度的黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁的混合对照品溶液2.0,2.5,3.0mL,进行高效液相色谱分析,记录色谱图,计算得出黄诺马苷(1)、异奥卡宁(2)、马里苷(3)、花旗松素(4)、金鸡菊苷(5)、奥卡宁(6)的平均加样回收率分别为99.67%、101.47%、98.16%、97.84%、98.87%、98.53%及其RSD分别为1.97%、2.45%、1.01%、1.94%、3.17%、3.04%,均符合相关规定。见表5。
表5两色金鸡菊六种成分的加样回收率试验(n=9)
(6)线性关系及范围
精密吸取混合对照品溶液10μL,倍比稀释,进行高效液相色谱测定,以浓度对峰面积进行处理,得到标准曲线见表,各对照品浓度范围内线性关系良好。结果见表6。
表6含量测定的线性与范围试验结果
4多批次含量测定结果
取10批两色金鸡菊药材,按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液,按检测方法进行测定,用外标法计算样品中多种成分的含量,10批两色金鸡菊含量如表7所示。
表7 10批两色金鸡菊中6种成分含量测定结果(mg/g)
以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:具体步骤如下:
(1)供试品溶液的制备
将两色金鸡菊样品倒入沸水中,盖上锡箔纸,冲泡25~35min,将茶汤滤出,继续加沸水冲泡25~35min,滤出茶汤,合并两次茶汤,摇匀,待茶汤的温度降低后过0.22μm微孔滤膜,获得续滤液,即得;
(2)对照品溶液的制备
精密吸取对照品黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁,加入甲醇溶解,制备混合对照品溶液;
(3)HPLC检测
精密吸取步骤(1)中所述供试品溶液,进行高效液相色谱测定,色谱条件为:色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,柱温为20~45℃;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%甲酸水,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下;流速为0.8mL/min;检测波长为291nm;进样量为10μL;
(4)构建特征指纹图谱
将步骤(3)中获得的供试品溶液色谱图导出,并导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”,获得两色金鸡菊药材的HPLC特征指纹图谱;
(5)多成分含量的测定
精密吸取步骤(2)中混合对照品溶液,进行高效液相色谱测定,绘制标准曲线,确定线性回归方程,测定步骤(1)两色金鸡菊供试品溶液,即得成分含量。
2.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:所述步骤(1)中供试品溶液的制备:精密称量两色金鸡菊样品2g于100mL烧杯中,倒入50mL沸水,盖上锡箔纸,冲泡30min,将茶汤滤出,继续加50mL沸水冲泡30min,滤出茶汤,合并两次茶汤,摇匀,待茶汤的温度降低后,定容至40mL,过0.22μm微孔滤膜,获得续滤液,即得。
3.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:步骤(2)所述对照品溶液的制备:精密称量黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁对照品,加甲醇溶解,摇匀,配制得到每1mL含黄诺马苷400~600μg、异奥卡宁50~150μg、马里苷150~200μg、花旗松素20~80μg、金鸡菊苷20~40μg、奥卡宁5~15μg的对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:步骤(3)所述色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Agilent Eclipse Plus C18色谱柱。
5.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:步骤(3)所述柱温为35~40℃。
6.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:步骤(3)所述流速为0.6~1.0mL/min,检测波长为280~300nm,进样量为8~12μL。
7.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:步骤(4)所述导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”后,选择各批次两色金鸡菊药材的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰,用平均数法生成两色金鸡菊药材的对照指纹图谱,计算各批两色金鸡菊样品间的相似度。
8.根据权利要求1所述的两色金鸡菊水提物的检测方法,其特征在于:步骤(5)所述多成分的含量测定:精密吸取步骤(2)中混合对照品溶液10μL,倍比稀释,进行高效液相色谱测定,以浓度对峰面积进行处理,绘制标准曲线,确定线性回归方程,使用外标法分别计算两色金鸡菊中黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、花旗松素、金鸡菊苷、奥卡宁六个成分的含量。
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