CN110927302B - 一种通络化痰胶囊指纹图谱的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通络化痰胶囊指纹图谱的测定方法，所述方法，步骤如下：(1)供试品溶液的制备：取通络化痰胶囊内容物，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；(4)根据色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，符合一致为合格品。

Description

一种通络化痰胶囊指纹图谱的测定方法
技术领域
本发明涉及一种药用制剂的检测方法，具体涉及一种中药制剂通络化痰胶囊指纹图谱的测定方法。
背景技术
脑血管病是当今世界危害人类健康的三大疾病之一，是中老年人的多发病，死亡率很高，在我国脑血管病占死因的第二位。国内报道脑出血死亡率为38-43％，幸存者约有50％-70％患者留有严重的后遗症，生活不能自理，不仅病人遭受极大痛苦，也给家庭和社会造成负担。
中药治疗脑血管病有其优势，如已经上市的中药通络化痰胶囊，其配方和工艺描述在中国专利02153515.9，“治疗缺血性中风的药物组合物”中，该专利描述了一种由中药熊胆粉、天麻、三七、丹参、天竺黄、大黄等制成中药制剂，经过实验发现，该制剂具有化浊毒，通血脉，祛痰湿，熄肝风的作用，主要用于缺血性中风急性期和恢复期治疗。自通络化痰胶囊上市以来，因其治疗效果好，见效快，受到了广大患者的好评。
通络化痰胶囊作为一种中药复方制剂，处方药材较多(由6味药材组成)，成分非常复杂多样。现有的通络化痰胶囊质量控制方法如专利“通络化痰胶囊的质量检测方法”(CN201510790216.7)中采用薄层法建立了天麻、大黄、丹参、三七的鉴别，以及对牛磺熊去氧胆酸的含量测定。但通络化痰胶囊作为复方制剂，单纯通过检测一种指标成分定量来控制其药品质量显然是不全面的，也不能体现中药复方制剂的整体性特征。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映复方制剂所含多成分的指纹图谱检测方法对于通络化痰胶囊的质量控制和评价非常必要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种通络化痰胶囊指纹图谱构建方法。本发明通过对通络化痰胶囊指纹图谱的研究，提供了一种操作简便、稳定、精密度高和重现性好，可用于通络化痰胶囊的质量检测和评价的方法，弥补了现有质量控制方法的不足，使通络化痰胶囊的质量控制技术更为完善、科学。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
(1)供试品溶液的制备：取通络化痰胶囊内容物，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；
(4)根据色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，符合一致为合格品。
优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)取待检测通络化痰胶囊内容物0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，超声(700W，50kHz)处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
2)对照品溶液的制备:分别取牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为245.5、582.3、492.5、302.7、517.4、447.1、383.6、298.5、469.1、517.4、483.5μg/mL的混合对照品溶液。
3)将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据供试品溶液色谱图采用计算机模拟技术，根据同一性原则和标准对照指纹图谱进行比对，如果90％以上拟合，则为合格品。
其中，高效液相色谱的色谱条件如下:
采用PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液(体积分数)；梯度洗脱：
0-20min，流动相A 0-5％，流动相B100％-95％；
20-25min，流动相A5％-25％,流动相B 95％-75％；
25-30min，流动相A25％-50％,流动相B 75％-50％；
30-45min，流动相A50％-55％,流动相B 50％-45％；
45-50min，流动相A55％-70％,流动相B 45％-30％；
50-60min，流动相A70％-90％,流动相B 30％-10％。
流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为:0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm。进样量:1μL。
其中所述标准对照指纹图谱建立方法如下：
1)取多批次检测合格的通络化痰胶囊内容物约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，超声(700W，50kHz)处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
2)对照品溶液的制备:
分别取牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为245.5、582.3、492.5、302.7、517.4、447.1、383.6、298.5、469.1、517.4、483.5μg/mL的混合对照品溶液。
3)将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据多批次供试品溶液色谱图采用计算机模拟技术，根据同一性原则绘制标准对照指纹图谱，得到标准对照指纹图谱。
其中，高效液相色谱的色谱条件如下:
采用PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液(体积分数)；梯度洗脱：
0-20min，流动相A 0-5％，流动相B100％-95％；
20-25min，流动相A5％-25％,流动相B 95％-75％；
25-30min，流动相A25％-50％,流动相B 75％-50％；
30-45min，流动相A50％-55％,流动相B 50％-45％；
45-50min，流动相A55％-70％,流动相B45％-30％；
50-60min，流动相A70％-90％,流动相B 30％-10％。
流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为:0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm。进样量:1μL。
本发明所述通络化痰胶囊为一种已经上市的药物，成份：熊胆粉、天麻、三七、丹参、天竺黄、大黄(酒制)，批准文号：国药准字04010Z052，功能主治：化痰熄风，活血通络。用于中风病中经络(脑梗塞)恢复期痰瘀阻络证。症见半身不遂，口舌歪斜，语言蹇涩或不语，偏身麻木，痰多而粘，唇甲色暗，舌苔厚腻，舌质暗，或有瘀点、瘀斑，舌底脉络瘀暗，脉涩或弦滑。生产企业：山东沃华医药科技股份有限公司本发明检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；XS205DU电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；SCQ-2211A数控超声波清洗机型数控超声波清洗机(上海声彦超声波仪器有限公司)。
1.2材料
牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯(德国Merck)；水为超纯水；甲醇为分析纯(广州化学试剂厂)；10批通络化痰胶囊由山东沃华医药科技股份有限公司提供。
2方法与结果
2.1通络化痰胶囊指纹图谱建立
2.1.1色谱条件:
采用PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液(体积分数)；梯度洗脱：
0-20min，流动相A 0-5％，流动相B100％-95％；
20-25min，流动相A5％-25％,流动相B 95％-75％；
25-30min，流动相A25％-50％,流动相B 75％-50％；
30-45min，流动相A50％-55％,流动相B 50％-45％；
45-50min，流动相A55％-70％,流动相B45％-30％；
50-60min，流动相A70％-90％,流动相B 30％-10％。
流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为:0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm。进样量:1μL。
2.1.2供试品溶液的制备:
取通络化痰胶囊内容物约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，超声(700W，50kHz)处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
2.1.3对照品溶液的制备:
分别取牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为245.5、582.3、492.5、302.7、517.4、447.1、383.6、298.5、469.1、517.4、483.5μg/mL的混合对照品溶液。
2.1.4精密度试验:
取同一批通络化痰胶囊供试品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，以6号色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于2.0％，表明仪器精密度良好。
2.1.5重复性试验:取同一批通络化痰胶囊供试品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件依次进样测定，以6号色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于2.5％，表明该方法重复性良好。
2.1.6稳定性试验:
取同一通络化痰胶囊供试品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12h进样测定，以6号色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0％，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
2.1.7指纹图谱的建立:
取10批通络化痰胶囊样品，按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件依次进样测定。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”进行指纹图谱分析，用中位数法生成指纹图谱，结果见图1。
各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.5％，相对峰面积RSD存在差异，结果见表1。
表1 10批通络化痰胶囊共有峰相对峰面积
Figure BDA0002307755530000051
Figure BDA0002307755530000061
10批样品色谱图与对照图谱相似度分别为0.995、0.997、0.997、0.992、0.992、0.993、0.993、0.997、0.992、0.997。结果见表2。
表2 10批通络化痰胶囊样品相似度评价结果
Figure BDA0002307755530000062
2.1.8指纹图谱共有峰的指认与归属:取“2.1.3”项下制备的混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果见图3。通过保留时间对照分析，确定指纹图谱的15个共有峰中第3号峰为天麻素，第4号峰为丹参素钠，第5号峰为原儿茶醛，第6号峰为丹酚酸B，第7号峰为大黄素，第8号峰为大黄酸，第9号峰为三七皂苷R1，第10号峰为人参皂苷Rg1，第13号峰为牛磺熊去氧胆酸，第14号峰为人参皂甙Rb1，第15号峰为丹参酮ⅡA，其他未归属的色谱峰可能为诸药合煎所生成的物质。可见，通络化痰胶囊口服液组成药材的主要成分均在本专利技术得到的指纹图谱中得到了整体表征。
需要说明的是，本发明的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本发明主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。
其中：1)供试品溶液配制方法的考察：试验比较了不同提取溶剂如丙酮、乙醇、甲醇的水浴回流和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以甲醇超声提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间(5,10，20min)的提取效果。结果表明，超声提取10min，提取较完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。采用甲醇超声提取样品，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。
2)色谱条件的选择及优化：在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇--0.02％磷酸水、甲醇--0.05％磷酸水、甲醇--0.1％磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.02％磷酸水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.3％磷酸水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。结果表明，用乙腈-0.05％磷酸水进行梯度洗脱为佳，色谱峰检测比较全面，基线平稳，峰形对称，分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。
3)检测波长的选择：采用光电二极管阵列检测器(PDAD)在190～400nm波长范围内对11种待检成分进行光谱扫描，结果牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸的最大吸收波长分别为208、220、287、270、280、284、203、205、202、249、254nm。再结合液相色谱图，最终将波长设定为0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm。
4)分析时间的选择：在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了1.5h的色谱图。结果表明55min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择60min作为分析时间。
5)柱温的选择：试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对指纹图谱检测结果的影响。结果显示柱温为30℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为30℃。
6)流速的选择：试验了四个流速(0.8ml/min,0.9ml/min,1.0ml/min,1.2ml/min)对指纹图谱检测结果的影响。结果表明：流速为1.0ml/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为1.0ml/min。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用磷酸水溶液-乙腈系统，采用梯度洗脱的方法建立了通络化痰胶囊的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大。
(2)由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择可变波长法进行测定，指标成分出峰较多，反映的信息更为完全，各个峰吸收值良好，基线平稳。
(3)本发明采用通络化痰胶囊的指纹图谱作为通络化痰胶囊口服液的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价通络化痰胶囊的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
为对通络化痰胶囊进行检测，我们采用了不同的方法进行测试，发现，其他方法均无法和本发明方法相比，最终得出结论，本发明方法优于其他测定方法，以下通过实验数据进一步说明本发明相对于现有技术的有益效果：
Figure BDA0002307755530000081
Figure BDA0002307755530000091
其中，现有技术方法1为通络化痰胶囊的质量检测方法”(CN201510790216.7)文献方法，由此可以看出，本发明优于现有技术。
附图说明
图1为通络化痰胶囊标准指纹图谱；
图2为10批次通络化痰胶囊HPLC指纹图谱；
图3为混合对照品指纹图谱。1、天麻素 2、丹参素钠 3、原儿茶醛 4、丹酚酸B 5、大黄素 6、大黄酸 7、三七皂苷R1 8、人参皂苷Rg1 9、牛磺熊去氧胆酸 10、人参皂甙Rb1
11、丹参酮ⅡA
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1)分别取10批次检测合格的通络化痰胶囊(批号20191001-20191010)内容物约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，超声(700W，50kHz)处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
2)对照品溶液的制备:
分别取牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为245.5、582.3、492.5、302.7、517.4、447.1、383.6、298.5、469.1、517.4、483.5μg/mL的混合对照品溶液。
3)将步骤1)制备的供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据多批次供试品溶液色谱图采用计算机模拟技术，根据同一性原则绘制标准对照指纹图谱，得到标准对照指纹图谱。
其中，高效液相色谱的色谱条件如下:
采用PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液(体积分数)；梯度洗脱：
0-20min，流动相A 0-5％，流动相B100％-95％；
20-25min，流动相A5％-25％,流动相B 95％-75％；
25-30min，流动相A25％-50％,流动相B 75％-50％；
30-45min，流动相A50％-55％,流动相B 50％-45％；
45-50min，流动相A55％-70％,流动相B45％-30％；
50-60min，流动相A70％-90％,流动相B 30％-10％。
流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为:0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm。进样量:1μL。
4)取待检测通络化痰胶囊(批号20191011)内容物0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，超声(700W，50kHz)处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
5)将步骤4)制备的供试品溶液和步骤2)制备的对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到供试品溶液色谱图，与步骤3)得到的标准对照指纹图谱进行比对，如果90％以上拟合，则判定为合格品。

Claims (3)

1.一种通络化痰胶囊指纹图谱的测定方法，所述方法，步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：取通络化痰胶囊内容物，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；
(4)根据色谱图和标准对照指纹图谱进行对照，符合一致为合格品；
其中，高效液相色谱的色谱条件如下:
采用PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.05％的磷酸水溶液；梯度洗脱：
0-20min，流动相A 0-5％，流动相B 100％-95％；
20-25min，流动相A5％-25％,流动相B 95％-75％；
25-30min，流动相A25％-50％,流动相B 75％-50％；
30-45min，流动相A50％-55％,流动相B 50％-45％；
45-50min，流动相A55％-70％,流动相B45％-30％；
50-60min，流动相A70％-90％,流动相B 30％-10％；
流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为:0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm；进样量:1μL。
2.根据权利要求1所述的测定方法，步骤如下：
1)供试品溶液的制备：取待检测通络化痰胶囊内容物0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，700W，50kHz超声处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:分别取牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为245.5、582.3、492.5、302.7、517.4、447.1、383.6、298.5、469.1、517.4、483.5μg/mL的混合对照品溶液；
3)将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据供试品溶液色谱图采用计算机模拟技术，根据同一性原则和标准对照指纹图谱进行比对，如果90％以上拟合，则为合格品。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述标准对照指纹图谱建立方法如下：
1)取多批次检测合格的通络化痰胶囊内容物约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，称重，700W，50kHz超声处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:
分别取牛磺熊去氧胆酸、天麻素、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、原儿茶醛、人参皂甙Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、大黄素、大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为245.5、582.3、492.5、302.7、517.4、447.1、383.6、298.5、469.1、517.4、483.5μg/mL的混合对照品溶液；
3)将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据多批次供试品溶液色谱图采用计算机模拟技术，根据同一性原则绘制标准对照指纹图谱，得到标准对照指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件如下:
采用PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.05％的磷酸水溶液；梯度洗脱：
0-20min，流动相A 0-5％，流动相B 100％-95％；
20-25min，流动相A5％-25％,流动相B 95％-75％；
25-30min，流动相A25％-50％,流动相B 75％-50％；
30-45min，流动相A50％-55％,流动相B 50％-45％；
45-50min，流动相A55％-70％,流动相B45％-30％；
50-60min，流动相A70％-90％,流动相B 30％-10％；
流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为:0～20min,220nm；20～30min,280nm；30～39min,254nm；39～52min,203nm；52～60min,270nm；进样量:1μL。
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