CN109060981A - 一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱 - Google Patents
一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱，包括以下步骤：S1.供试品溶液的制备；S2.对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇、羟基红花黄色素、杯苋甾酮作为对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；S3.测定：使用高效液相色谱仪测定，记录色谱图；色谱柱为PHENOMENEX LUNA C‑18色谱柱，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.6～1.0ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为256nm；S4.图谱处理。该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大。
Description
技术领域
本发明涉及一种药用制剂的检测方法，具体涉及一种中药制剂豨红通络指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱。
背景技术
脑血管病是当今世界危害人类健康的三大疾病之一，是中老年人的多发病，死亡率很高，在我国脑血管病占死因的第二位。国内报道脑出血死亡率为38-43％，幸存者约有50％-70％患者留有严重的后遗症，生活不能自理，不仅病人遭受极大痛苦，也给家庭和社会造成负担。
中药治疗脑血管病有其优势，如已经上市的中药豨红通络口服液，其配方和工艺描述在中国专利CN200610083029.6，“用于治疗中风病的药物组合物和其制备方法”中，该专利描述了一种由中药豨莶草、红花、川牛膝等制成中药制剂，经过实验发现，该制剂具有益气活血、化瘀通脉的功效,可以增加脑血流量,降低脑血管阻力和延长凝血时间,改善脑细胞缺血缺氧状态,从而促进脑功能的恢复。自豨红通络制剂上市以来，因其治疗效果好，见效快，受到了广大患者的好评。
豨红通络口服液作为一种中药复方制剂，成分非常复杂多样。在“豨红通络口服液标准”(中国药典2015版)中采用高效液相法仅建立了豨莶草中奇壬醇单个成分的含量测定方法。但豨红通络口服液为复方制剂，单纯通过检测一种指标成分定量来控制其药品质量显然是不全面的，也不能体现中药复方制剂的整体性特征。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映复方制剂所含多成分的指纹图谱检测方法对于豨红通络口服液的质量控制和评价非常必要。
发明内容
本发明的发明目的之一是，针对上述问题，提供一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法，操作简便、稳定、精密度高和重现性好，可用于豨红通络口服液的质量检测和评价的方法，弥补了现有质量控制方法的不足，使豨红通络口服液的质量控制技术更为完善、科学。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：
取豨红通络口服液，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
S2.对照品溶液的制备：
取减压干燥至恒重的奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇、羟基红花黄色素、杯苋甾酮作为对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液。
S3.测定：
分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.6～1.0ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为256nm。
S4.图谱处理
用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得豨红通络口服液指纹图谱。
优选的，步骤S1中，所述供试品溶液的制备方法为：精密量取1.0ml豨红通络口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取5～20min，恢复至室温，然后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
优选的，步骤S2中，所述对照品溶液的制备方法为：精密称取奇壬醇标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的奇壬醇对照品溶液；
精密称取豨莶苷标准品0.0125g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.25mg/mL的豨莶苷对照品溶液；
精密称取豨莶精醇标准品3.85mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.385mg/mL的对照品溶液；
精密称取羟基红花黄色素标准品3.50mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.35mg/mL的羟基红花黄色素对照品溶液；
精密称取杯苋甾酮标准品0.0165g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.65mg/mL的杯苋甾酮对照品溶液。
优选的，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
优选的，步骤S3中，所述流动相流速为0.8ml/min。
优选的，所述柱温为30℃
优选的，步骤S3中，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-15min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；
15-20min，流动相A90％-75％,流动相B 10％-25％；
20-30min，流动相A75％-55％,流动相B 25％-45％；
30-35min，流动相A55％-45％,流动相B 45％-55％；
35-50min，流动相A45％-35％,流动相B 55％-65％；
50-60min，流动相A35％-70％,流动相B 65％-30％。
优选的，步骤S4中，供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
还提供了一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法得到的标准指纹图谱,所述标准指纹图谱共有色谱峰10个，其平均保留时间分别为1号峰4.1962min、2号峰6.5146min、3号峰15.5061min、4号峰16.3018min、5号峰23.8869min、6号峰26.2066min、7号峰47.6723min、8号峰52.2765min、9号峰55.3775min、10号峰65.1492min。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的测定方法，采用磷酸水溶液-乙腈系统，采用梯度洗脱的方法建立了豨红通络口服液的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大。
2.由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择在256nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息更为完全，各个峰吸收值良好，基线平稳。
3.本发明采用豨红通络口服液的指纹图谱作为豨红通络口服液的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价豨红通络口服液的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
说明书附图
图1为豨红通络口服液标准指纹图谱；
图2为杯苋甾酮对照品指纹图谱
图3为奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇对照品指纹图谱；
图4为羟基红花黄色素对照品指纹图谱；
图5为10批次豨红通络口服液HPLC指纹图谱及对照指纹图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、最优条件选择验证实验：
对比实验1：
试验比较了不同提取溶剂如丙酮、乙醇、甲醇的水浴回流和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以甲醇超声提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间(5,10，20min)的提取效果。结果表明，超声提取10min，提取较完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。采用甲醇超声提取样品，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。此外还比较了提取溶剂稀释倍数对样品溶液检测效果的影响，如稀释20倍，10倍和5倍，结果以甲醇作为提取溶剂稀释10倍的检测效果为佳。
对比实验2：
试验了四个流速(0.6ml/min,0.7ml/min,0.9ml/min和1.0ml/min)对指纹图谱检测结果的影响。结果表明：流速为0.8ml/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.8ml/min。
对比实验3：
试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对指纹图谱检测结果的影响。结果显示柱温为30℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为30℃。
对比实验4：
在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇--0.05％磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.5％磷酸水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。结果表明，用乙腈-0.1％磷酸水进行梯度洗脱为佳，色谱峰检测比较全面，基线平稳，峰形对称，分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。
对比实验5：
采用光电二极管阵列检测器(PDAD)在190～400nm扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，结果表明：256nm处检测的色谱图不仅基线平稳，色谱峰较多，信息量大，各色谱峰的分离效果较好，峰面积也较大。因此，选256nm作为检测波长。同时考察了其他波长下的色谱图，其结果显示豨红通络口服液在不同波长下的色谱指纹图谱具有较好的相似度。
实施例1
一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：
取豨红通络口服液，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
具体制备过程为：精密量取1.0ml豨红通络口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取10min，恢复至室温，然后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
S2.对照品溶液的制备：
取减压干燥至恒重的奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇、羟基红花黄色素、杯苋甾酮作为对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液。
具体制备过程为：精密称取奇壬醇标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的奇壬醇对照品溶液。
精密称取豨莶苷标准品0.0125g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.25mg/mL的豨莶苷对照品溶液。
精密称取豨莶精醇标准品3.85mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.385mg/mL的豨莶精醇对照品溶液。
精密称取羟基红花黄色素标准品3.50mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.35mg/mL的羟基红花黄色素对照品溶液。
精密称取杯苋甾酮标准品0.0165g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.65mg/mL的杯苋甾酮对照品溶液。
S3.测定：
分别精密量取10μL供试品溶液和10μL对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.8ml/min，柱温为30℃，检测波长为256nm。
所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-15min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；
15-20min，流动相A90％-75％,流动相B 10％-25％；
20-30min，流动相A75％-55％,流动相B 25％-45％；
30-35min，流动相A55％-45％,流动相B 45％-55％；
35-50min，流动相A45％-35％,流动相B 55％-65％；
50-60min，流动相A35％-70％,流动相B 65％-30％。
S4.图谱处理
供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
二、豨红通络口服液标准指纹图谱绘制：
S1.供试品溶液的制备：
取豨红通络口服液，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
具体制备过程为：精密量取1.0ml豨红通络口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取10min，恢复至室温，然后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
S2.对照品溶液的制备：
取减压干燥至恒重的奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇、羟基红花黄色素、杯苋甾酮作为对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液。
具体制备过程为：精密称取奇壬醇标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的奇壬醇对照品溶液。
精密称取豨莶苷标准品0.0125g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.25mg/mL的豨莶苷对照品溶液。
精密称取豨莶精醇标准品3.85mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.385mg/mL的对照品溶液。
精密称取羟基红花黄色素标准品3.50mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.35mg/mL的羟基红花黄色素对照品溶液。
精密称取杯苋甾酮标准品0.0165g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.65mg/mL的杯苋甾酮对照品溶液。
S3.测定：
分别精密量取10μL供试品溶液和10μL对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.8ml/min，柱温为30℃，检测波长为256nm。
所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-15min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；
15-20min，流动相A90％-75％,流动相B 10％-25％；
20-30min，流动相A75％-55％,流动相B 25％-45％；
30-35min，流动相A55％-45％,流动相B 45％-55％；
35-50min，流动相A45％-35％,流动相B 55％-65％；
50-60min，流动相A35％-70％,流动相B 65％-30％。
S4.图谱处理
用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，通过对10批豨红通络口服液的指纹图谱(见图5)和对照品的指纹图谱(见图2、图3、图4)进行共有峰分析，确定了10个为共有特征峰，其平均保留时间分别为1号峰4.1962min、2号峰6.5146min、3号峰15.5061min、4号峰16.3018min、5号峰23.8869min、6号峰26.2066min、7号峰47.6723min、8号峰52.2765min、9号峰55.3775min、10号峰65.1492min，得到如图1所示的豨红通络口服液的标准指纹图谱。
实施例2
一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：
取豨红通络口服液，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
具体制备过程为：精密量取1.0ml豨红通络口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取10min，恢复至室温，然后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
S2.测定：
分别精密量取10μL供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.8ml/min，柱温为30℃，检测波长为256nm。
所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-15min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；
15-20min，流动相A90％-75％,流动相B 10％-25％；
20-30min，流动相A75％-55％,流动相B 25％-45％；
30-35min，流动相A55％-45％,流动相B 45％-55％；
35-50min，流动相A45％-35％,流动相B 55％-65％；
50-60min，流动相A35％-70％,流动相B 65％-30％。
S3.图谱处理
供试品溶液的指纹图谱和所述豨红通络口服液标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
三、稳定性实验：
取同一批次供试品(通化卫京药业有限公司提供)，根据实施例2步骤S1配置供试品溶液，在室温下放置，分别于0，2，4，8，12，16，24h根据实施例2中步骤S2检测指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果表明，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.9997，0.9998，0.9995，0.9997，0.9996，满足相似度不小于0.950的要求，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.000％～0.679％和0.000％～2.357％，RSD＜3.00％，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1min内，符合指纹图谱要求。说明供试品溶液的成分在24h内是稳定的。主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积见表1和表2所示。
表1主要色谱峰相对保留时间
表2主要色谱峰相对峰面积
四、精密度实验
取同一批次供试品(山东沃华医药科技股份有限公司提供)，根据实施例2步骤S1配置供试品溶液，根据实施例2中步骤S2连续进样5次，记录指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果表明，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.9992，0.9998，0.9996，0.9997，0.9998，满足相似度不小于0.950的要求，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.000％～0.112％和0.000％～1.487％，RSD＜3.00％，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1min内，符合指纹图谱要求。说明仪器的精密度良好。主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积见表3和表4所示。
表3主要色谱峰相对保留时间
表4主要色谱峰相对峰面积
五、重复性实验
取同一批次样品(山东沃华医药科技股份有限公司提供)，根据实施例2中步骤S1平行制备5份供试品溶液，根据实施例2中步骤S2测定并记录指纹图谱。用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果表明，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.9999，0.9992，0.9996，0.9998，0.9993，满足相似度不小于0.950的要求，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为0.000％～0.486％和0.000％～2.036％，RSD＜3.00％，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1min内，符合指纹图谱要求。说明该实验方法的重复性较好。主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积见表5和表6所示。
表5主要色谱峰相对保留时间
表6主要色谱峰相对峰面积
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (10)
1.一种豨红通络制剂指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.供试品溶液的制备：
取豨红通络口服液，加入甲醇，超声提取，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
S2.对照品溶液的制备：
取减压干燥至恒重的奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇、羟基红花黄色素、杯苋甾酮作为对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
S3.测定：
分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.6～1.0ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为256nm；
S4.图谱处理
用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得豨红通络口服液指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S1中，所述供试品溶液的制备方法为：精密量取1.0ml豨红通络口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取5～20min，恢复至室温，然后过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,所述超声波提取时间为10min。
4.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S2中，所述对照品溶液的制备方法为：精密称取奇壬醇标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的奇壬醇对照品溶液；
精密称取豨莶苷标准品0.0125g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.25mg/mL的豨莶苷对照品溶液；
精密称取豨莶精醇标准品3.85mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.385mg/mL的豨莶精醇对照品溶液；
精密称取羟基红花黄色素标准品3.50mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.35mg/mL的羟基红花黄色素对照品溶液；
精密称取杯苋甾酮标准品0.0165g，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.65mg/mL的杯苋甾酮对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S3中，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
6.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S3中，所述流动相流速为0.8ml/min。
7.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S3中，所述柱温为30℃。
8.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S3中，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-15min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；
15-20min，流动相A90％-75％,流动相B 10％-25％；
20-30min，流动相A75％-55％,流动相B 25％-45％；
30-35min，流动相A55％-45％,流动相B 45％-55％；
35-50min，流动相A45％-35％,流动相B 55％-65％；
50-60min，流动相A35％-70％,流动相B 65％-30％。
9.根据权利要求1所述的豨红通络制剂指纹图谱的测定方法,其特征在于,步骤S4中，供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
10.一种权利要求1-9中任一所述的测定方法得到的标准指纹图谱,其特征在于,标准指纹图谱共有色谱峰10个，其平均保留时间分别为1号峰4.1962min、2号峰6.5146min、3号峰15.5061min、4号峰16.3018min、5号峰23.8869min、6号峰26.2066min、7号峰47.6723min、8号峰52.2765min、9号峰55.3775min、10号峰65.1492min。
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