CN109709251A

CN109709251A - 苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN109709251A
Application number: CN201811635810.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡宝昌; 陈海超; 李伟东; 金俊杰; 秦昆明; 李国维; 张金龙; 孙戡平
Original assignee: JIANGSU HAISHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Nanjing Haiyuan Prepared Chinese Crude Drugs Co Ltd; NANJING HAICHANG CHINESE MEDICINE GROUP CO Ltd
Current assignee: JIANGSU HAISHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Nanjing Haiyuan Prepared Chinese Crude Drugs Co Ltd; NANJING HAICHANG CHINESE MEDICINE GROUP CO Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109709251B

Abstract

本发明公开了苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1，苓桂术甘汤供试品溶液的制备；步骤2，对照品溶液的制备；步骤3，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的苓桂术甘汤指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次的苓桂术甘汤的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，用平均值计算法生成苓桂术甘汤的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法具有稳定性好、精密度高、重现性好等优点，可对苓桂术甘汤中有效成分进行准确分析，对全面客观评价苓桂术甘汤的质量具有重要的意义。

Description

苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药方剂的检测方法，具体涉及苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段。它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

苓桂术甘汤方出自张仲景《伤寒杂病论》。《伤寒杂病论》第67条云：“伤寒，若吐、若下后，心下逆满，气上冲胸，起则头眩，脉沉紧，发汗则动经，身为振振摇者，茯苓桂枝白术甘草汤主之。”《金匮要略·痰饮咳嗽病篇第十二》云：““心下有痰饮，胸胁支满，目眩者，苓桂术甘汤主之。”又曰：“夫短气有微饮，当从小便去之，苓桂术甘汤主之。肾气丸亦主之”。本方由茯苓、桂枝、白术、甘草四味药组成，主治心下有停饮、胸胁支满、眩晕及心下逆满、气上冲胸、起则头眩、脉沉紧之阳虚饮停证，乃“病痰饮者，当以温药和之”的代表方剂。“稠者为痰，清者为饮”，痰饮为患，流动不拘，涉及范围广泛，从内到外，从上到下，均可因痰饮停聚而成病。

目前关于苓桂术甘汤指纹图谱检测方法研究较少。本发明采用高效液相色谱法建立苓桂术甘汤的指纹图谱检测方法，可对苓桂术甘汤中的有效成分进行准确的分析，对全面客观评价苓桂术甘汤的质量具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的补足，提供一种苓桂术甘汤的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价苓桂术甘汤的质量，对控制苓桂术甘汤的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、苓桂术甘汤供试品溶液的制备

精密称取茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g，加水超声，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，然后加入95％乙醇加热回流提取，过滤，取上清液，水浴蒸干后加入甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2、混合对照品溶液的制备：

精密称定甘草苷、肉桂酸和反式肉桂醛对照品，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取按步骤1方法制备得到的供试品溶液和步骤2制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4、将步骤3中获得的苓桂术甘汤供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择苓桂术甘汤的色谱图中均存在的的色谱峰作为共有峰；利用平均值计算法生成苓桂术甘汤的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，步骤1苓桂术甘汤供试品溶液制备方法为：精密称取苓桂术甘汤的药材茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g，加入1L水超声提取，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，加入4倍量95％乙醇加热回流提取3h，过滤取上清液，水浴蒸干后加入20mL甲醇溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备方法为：精密称定甘草苷、甘草酸铵和肉桂醛对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成甘草苷0.265mg/mL、肉桂酸0.28mg/mL、反式肉桂醛0.315mg/mL的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：GS-120-5-C18-AP，流动相：A相为乙腈-B相为水，二极管阵列检测器，检测波长254nm，柱温：30℃，流速0.6mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱。

作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，梯度洗脱程序如下表：

程序	时间(min)	A相体积/％	B相体积/％
				1	0	5	95
2	30	35	65
				3	35	35	65
4	65	45	55
				5	90	45	55
6	95	100	0
				7	95	100	0

作为优选方案，以上所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，指纹图谱中选择6个共有峰作为苓桂术甘汤指纹图谱的特征峰，以这6个特征峰的峰面积作为质量评价的指标，6个共有峰中对照品甘草苷为2号峰，保留时间为31.132分钟，对照品肉桂酸为5号峰，相对保留时间为46.605分钟，对照品反式肉桂醛为6号峰，相对保留时间为61.179分钟，1号峰保留时间为30.288分钟，3号峰保留时间为33.157分钟，4号峰的保留时间为38.039分钟。

指纹图谱检测条件的优化

1.在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法(超声、回流、连续回流、煎煮)及不同提取溶剂(甲醇、水、乙醇)进行实验比较，结果发现超声处理与加热回流结合的提取方式所得的样品有效成分较多且杂质较少，故采用超声处理与加热回流相结合的提取方法：对提取溶剂的考察中发现95％乙醇提取物色谱图信息量最多，成分含量高，所以选用95％乙醇进行提取。

2.在色谱条件进行优化方面

本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取210nm、254nm、280nm、345nm处的色谱图，发现检测波长为254nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选取254nm为检测波长；

3、流动相的优化：

本发明比较了甲醇-乙腈、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-0.1％冰醋酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水7个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果，结果发现以乙腈-含0.1％体积磷酸的水为流动相时，苓桂术甘汤中各成分能达到较好的分离效果，故最终选定以乙腈-含0.1％体积磷酸的水为流动相。

4、梯度洗脱筛选

由于苓桂术甘汤活性成分复杂，且含有大量成分不明的杂质，普通洗脱方式在色谱柱难以达到好的分离度。本发明通过大量实验筛选其梯度洗脱方式，得到最佳的梯度洗脱程序，可使各化合物进行有效分离。

有益效果：

1、本发明根据苓桂术甘汤中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价苓桂术甘汤的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的苓桂术甘汤指纹图谱，能有效地表征苓桂术甘汤的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定苓桂术甘汤质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现好等优点。

附图说明

图1为本发明的对照品的色谱图。

图2为本发明的苓桂术甘汤样品的10批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高效液相色谱系统，，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。

1.2药品与试剂

10批苓桂术甘汤样品的药材见表2；甘草苷(批号180808南京森贝伽生物科技有限公司)；肉桂酸(批号180607南京森贝伽生物科技有限公司)；反式肉桂醛(批号180910南京森贝伽生物科技有限公司)；甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(分析纯)。

实施例1

1、一种苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、苓桂术甘汤供试品溶液的制备：

精密称取10批次的茯苓、桂枝、白术与甘草药材，其中茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g。加入1L水超声提取，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，加入4倍量95％乙醇加热回流提取3h，过滤取上清液，水浴蒸干后加入20mL甲醇溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，得10批供试品溶液；

步骤2、对照品溶液的制备：

，步骤2中对照品溶液的制备方法为：取精密称定的甘草苷、肉桂酸与反式肉桂醛对照品，置于容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，制成甘草苷0.265mg/mL、肉桂酸0.28mg/mL、反式肉桂醛0.315mg/mL的混合对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取步骤1的10批供试品溶液和步骤2的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图(对照品色谱图如图1)；

步骤4、将步骤3中获得的10批次的苓桂术甘汤的HPLC数据导出为AIA格式，导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统2004版”，生成标准指纹图谱，进行指纹图谱相似度评价。10个样品的指纹图谱共有模式见图2，指纹图谱中选择6个共有峰作为苓桂术甘汤指纹图谱的特征峰，6个共有峰中对照品甘草苷为2号峰，保留时间为31.132分钟，对照品肉桂酸为5号峰，相对保留时间为46.605分钟，对照品反式肉桂醛为6号峰，相对保留时间为61.179分钟，1号峰保留时间为30.288分钟，3号峰保留时间为33.157分钟，4号峰的保留时间为38.039分钟。

步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱为YMC-Pack-ODS-A的C18色谱柱；流动相：乙腈为A相和含0.1％体积磷酸的水为B相，二极管阵列检测器，检测波长254nm，流速0.6mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表1：

表1梯度洗脱程序

10批苓桂术甘汤共有峰相对保留时间如表3，苓桂术甘汤共有峰相对峰面积如表4，相似度评价结果见表5。根据指纹图谱相似度评价结果显示，不同批次的苓桂术甘汤具有一定的差异，研究结果显示，指纹图谱相似度分析可以用于区分不同批次的苓桂术甘汤，可以用于苓桂术甘汤的质量控制。

表2十批次苓桂术甘汤药材来源

表3苓桂术甘汤共有峰相对保留时间

编号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							S1	30.403	31.089	33.109	38.110	46.542	61.166
S2	30.176	31.026	33.045	38.074	46.515	61.086
							S3	30.196	31.152	33.153	36.327	46.901	60.971
S4	30.149	31.104	33.163	38.122	46.667	41.017
							S5	30.263	31.317	33.151	38.352	46.621	61.226
S6	30.298	31.169	33.136	38.147	46.583	60.970
							S7	30.112	31.105	33.183	38.214	46.623	61.187
S8	30.318	31.152	33.288	38.503	46.620	61.755
							S9	30.576	31.078	33.179	38.281	46.403	60.987
S10	30.389	31.133	33.163	38.277	46.581	61.427
							平均值	30.288	31.132	33.157	38.039	46.606	61.179
RSD	0.46	0.24	0.18	0.16	0.27	0.40

表4苓桂术甘汤共有峰相对峰面积

编号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							S1	11917947	14555313	6644824	7047652	19454529	21472056
S2	11856252	14984621	6855472	7640698	19480147	22754759
							S3	12095916	14215997	6372541	7073472	19822986	22695921
S4	11842875	1414084	6403275	7335001	19551792	21911082
							S5	12115475	14495661	6591055	7387786	20664022	22773991
S6	11799854	14467159	6357421	7562574	20138565	21773316
							S7	11981927	14812755	6294019	7332018	19728530	21972451
S8	11836258	14571266	6687961	7492767	19974245	20978411
							S9	12071452	14234209	6386374	7585526	19888461	22458205
S10	11851956	14703105	6624774	7602239	20347726	21212586
							平均值	11936991	14575506	6521771	7405973	19905100	22000277
RSD	1.0	1.65	2.81	2.87	1.96	2.91

。

表5不同批次苓桂术甘汤指纹图谱相似度

实施例2方法学考察

1.精密度实验

精密吸取实施例1下的对照品溶液，按实施例1下色谱条件连续进样6次，其主要共有峰保留时间的RSD均小于0.95％，相对峰面积RSD均小于2.44％，表明仪器的精密度良好。具体实验结果见表6和表7。

表6相对保留时间

序号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							1	30.228	31.127	33.156	38.209	46.377	61.193
2	30.507	31.096	33.253	38.185	46.182	61.137
							3	30.103	31.224	33.087	38.311	46.134	61.353
4	30.862	31.034	33.076	38.409	46.138	61.527
							5	30.130	31.525	33.174	38.244	46.271	61.556
6	30.246	31.431	33.109	38.139	46.193	61.468
							平均值	30.346	31.239	33.142	38.249	46.215	61.372
RSD	0.95	0.63	0.20	0.25	0.20	0.28

。

表7相对峰面积

序号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							1	11842156	14228746	6533728	7588055	19714845	21215913
2	11785246	14262298	6589901	7192076	19921375	21589254
							3	11985574	14397421	6607543	7436120	19961385	20993681
4	11953664	14694886	6579577	7592378	20015744	21874116
							5	12002981	14693208	6455122	7701706	19863732	21973309
6	11885521	14227717	6544366	7384745	19776263	21964736
							平均值	11909190	14417379	6551706	7482513	19875557	21601834
RSD	0.72	1.54	0.83	2.44	0.57	1.92

。

2、稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样进行测定，其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于0.61％、相对峰面积RSD均小于2.93％，结果表明：供试品溶液在24h内稳定。具体实验结果见表8和表9。

表8相对保留时间

序号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							1	30.554	31.086	33.212	38.154	46.236	61.112
2	30.279	31.114	33.277	38.110	46.30	61.875
							3	30.448	31.158	33.371	38.204	46.385	61.391
4	30.271	31.148	33.047	38.288	46.374	61.557
							5	30.068	31.350	33.436	38.156	46.421	61.318
6	30.537	31.337	32.988	38.500	46.223	61.260
							平均值	30.359	31.198	33.221	38.218	46.323	61.418
RSD	0.61	0.36	0.53	0.41	0.18	0.43

。

表9相对峰面积

3、重复性试验结果

精密吸取同一批样品，按照实施例1下方法制备供试品溶液，以实施例1下的色谱条件进样，其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于1.02％，相对峰面积RSD均小于2.74％，表明方法的重复性良好。具体实施例结果见表10和表11。

表10相对保留时间

序号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							1	30.101	31.142	33.267	38.107	46.183	61.228
2	30.086	31.277	33.219	38.324	46.077	61.031
							3	30.582	31.234	33.175	38.352	46.264	61.169
4	30.817	31.342	33.324	38.179	46.369	61.137
							5	30.696	31.170	33.311	38.191	46.621	61.308
6	30.616	31.184	33.185	38.247	46.255	61.370
							平均值	30.483	31.224	33.246	38.233	46.294	61.207
RSD	1.02	0.23	0.19	0.24	0.40	0.19

。

表11相对峰面积

序号	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6
							1	12111335	14578824	6338180	7638741	20019370	21555814
22	11940158	14739663	6532591	7668217	21025438	20929873
							3	11957425	14342756	6347929	7355824	20087639	21152220
4	12005775	14940172	6585527	7700225	20526933	20857247
							5	11835742	14661501	6641002	7698741	19977946	21479528
6	11962247	15526335	6445742	7583089	20147752	21647930
							平均值	11968780	14798208	6481828	7607472	20297513	21270435
RSD	0.75	2.74	1.93	1.71	2.00	1.58

。

以上实验结果表明，本发明提供的苓桂术甘汤指纹图谱检测方法，稳定性好、精密度高、重复性好，能全面客观评价苓桂术甘汤的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本发明技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、苓桂术甘汤供试品溶液的制备

步骤2、混合对照品溶液的制备：

2.根据权利要求1所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1苓桂术甘汤供试品溶液制备方法为：精密称取苓桂术甘汤的药材茯苓40g、桂枝30g、白术20g与甘草20g，加入1L水超声提取，过滤收集药液，旋转蒸发药液至干，加入4倍量95％乙醇加热回流提取3h，过滤取上清液，水浴蒸干后加入20mL甲醇溶液溶解，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备方法为：精密称定甘草苷、甘草酸铵和肉桂醛对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成甘草苷0.265mg/mL、肉桂酸0.28mg/mL、反式肉桂醛0.315mg/mL的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1至3任一项所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：GS-120-5-C18-AP，流动相：A相为乙腈-B相为水，二极管阵列检测器，检测波长254nm，柱温：30℃，流速0.6mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱。

5.根据权利要求4所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，梯度洗脱程序如下表：

6.根据权利要求5所述苓桂术甘汤指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹图谱中选择6个共有峰作为苓桂术甘汤指纹图谱的特征峰，以这6个特征峰的峰面积作为质量评价的指标，6个共有峰中对照品甘草苷为2号峰，保留时间为31.132分钟，对照品肉桂酸为5号峰，相对保留时间为46.605分钟，对照品反式肉桂醛为6号峰，相对保留时间为61.179分钟，1号峰保留时间为30.288分钟，3号峰保留时间为33.157分钟，4号峰的保留时间为38.039分钟。