CN108982720A - 复方感冒灵颗粒hplc标准指纹图谱的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方感冒灵颗粒HPLC标准指纹图谱的构建方法及应用，包括如下步骤：(1)制备混合对照品溶液；(2)精密称取复方感冒灵颗粒粉末9.0g，精密加入50ml的甲醇溶液，称重，超声处理30min，冷却，重新称重，并以甲醇溶液补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液；(3)将样品溶液在高效液相色谱中进行梯度洗脱，得到HPLC标准指纹图谱；高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.05‑0.2％的甲酸水溶液。本发明的构建方法操作成本较低，简单方便，所涉及的实验仪器价格也比较普通，测定过程中所涉及的试剂易得。

Description

复方感冒灵颗粒HPLC标准指纹图谱的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种复方感冒灵颗粒HPLC标准指纹图谱的构建方法及应用，本发明属于药物质量分析技术领域。

背景技术

复方感冒灵颗粒是一种常用的感冒药，功能为辛凉解表，清热解毒。用于风热感冒及温病之发热，微恶风寒，头身痛，口干而渴，鼻塞涕浊，咽喉红肿疼痛，咳嗽，痰黄粘稠等病症。本品是一种中西药结合的复方制剂，具有标本兼治、协同增效，相互制约、降低毒性的优势。本品临床疗效确切，市场需求量大。

复方感冒灵颗粒由山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅6味中药和对乙酰氨基酚、咖啡因以及马来酸氯苯那敏三种化药制得。本制剂是上世纪70年末上市，属于《药品管理法》实施之前开发的产品，限于当时的技术水平，基础研究较为薄弱，现有药品标准(国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS₃-B-2384-97-2017)质量控制采用滴定法检测对乙酰氨基酚的含量，定性采用简单的试管法及薄层色谱法检测对乙酰氨基酚以及马来酸氯苯那敏，中药仅仅检测了原料组成，没有对各个原料中所含的中药有效成分进行有效的测定，不能体现中药多组分与西药整体功效的特点，无法保障复方感冒灵颗粒质量一致性、可控性和朔源性，影响临床用药的准确性和疗效的一致性，因此如何建立一套完善健全的复方感冒灵颗粒的质量体系是现有技术中亟待解决的技术问题。

前期我们建立了复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱(专利发明号：201510888682.9)，该技术对复方感冒灵中药提取物(流膏)质量进行有效的监控，比之前的技术有很大的进步，但是相对于复方感冒灵颗粒质量整个控制体系的技术有些不足，第一，该技术对化学成分指纹图谱共有峰用对照品对照，仅认定了绿原酸、蒙花苷和木犀草苷，其他化学成分指纹图谱共有峰是何种成分不清楚，第二，当复方感冒灵流膏、3种化药与蔗糖粉等辅料制成颗粒时，用复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱条件去质量监控，各化学成分不能得到有效的分离，即用复方感冒灵流膏化学成分标准指纹图谱技术不能有效的监控复方感冒粒灵颗粒。复方感冒粒灵颗粒尚未有报道其HPLC指纹图谱技术的依据，通用的HPLC质量控制技术可有效弥补此空白。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种复方感冒颗粒的HPLC标准指纹图谱的构建方法，该方法切实解决了现有技术中存在的诸多技术问题，具有方法简单、操作方便，实现了全方位多方面的检测复方感冒灵颗粒，提高了复方感冒灵颗粒整体的品质，完善了质量检测体系，利于药品本身的扩大应用范围等优点。

本发明的第二目的在于提供由上述构建方法得到的复方感冒灵颗粒的HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱能够比较全面地获得中药化学成分群的特征信息，可以更加客观地对本品进行质量评价和质量控制；HPLC/Q-TOF-MS技术则可以对中药的化学成分结构进行定性表征，更有效地控制药品质量；综合运用HPLC指纹图谱及HPLC/Q-TOF-MS技术及化学对照品对照，清晰的反应出复方感冒灵颗粒各有效成分的特征峰的出峰位置，准确度以及清晰度很高，可以有效地评价本品质量，而且能够完善复方感冒灵颗粒的质量控制体系，确保药品疗效，同时为复方感冒颗粒作用机理研究提供物质基础。

本发明的技术方案是，提供一种复方感冒灵颗粒HPLC标准指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)精密称取对乙酰氨基酚对照品、原儿茶酸对照品、新绿原酸对照品、绿原酸对照品、咖啡因对照品、隐绿原酸对照品、咖啡酸对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品、蒙花苷对照品，用甲醇溶液溶解，制成混合对照品溶液；

其中每1ml混合对照品溶液中含对乙酰氨基酚2.6mg、原儿茶酸10μg、新绿原酸80μg、绿原酸100μg、咖啡因0.18mg、隐绿原酸80μg、咖啡酸5μg、异绿原酸B 40μg、异绿原酸A 20μg、异绿原酸C 45μg、蒙花苷100μg；

(2)精密称取复方感冒灵颗粒粉末9.0g，精密加入50ml的甲醇溶液，称重，超声处理30min，冷却，重新称重，并以甲醇溶液补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液；

其中复方感冒灵颗粒包括山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅共六味中药成分和对乙酰氨基酚、咖啡因以及马来酸氯苯那敏共三种化药；

(3)将样品溶液在高效液相色谱中进行梯度洗脱，得到HPLC标准指纹图谱；高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.05-0.2％的甲酸水溶液。

优选地，复方感冒灵颗粒的制备方法为：将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后加水煎煮2次，第一次2h，第二次1.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量，加乙醇使含醇量达60％～65％，搅匀，静置，滤过，滤液浓缩至稠膏，加对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因水溶液，并加入辅料，混匀，干燥，制成颗粒。

优选地，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液。

优选地，高效液相色谱的操作条件是：Kromasil C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量10μL，洗脱程序是：

0-20min流动相A：B由5％：95％→18％：82％；

20-45min流动相A：B由18％：82％→26％：74％；

45-55min流动相A：B由26％：74％→35％：65％；

55-60min流动相A：B由35％：65％→5％：95％；

60-65min流动相A：B由5％：95％；流动相A与B的比例为体积比。

优选地，步骤(1)和步骤(2)中的甲醇溶液的体积分数相同，且均为40-60％。

优选地，步骤(1)和步骤(2)中的甲醇溶液的体积分数均为50％(甲醇溶液中，甲醇的体积＝水的体积)。

本发明提供所述的构建方法得到的标准指纹图谱在复方感冒灵颗粒质量检测方面的应用。

优选地，将复方感冒灵颗粒制成待测品溶液，在与上述的构建方法中所使用的相同的高效液相色谱操作条件下进行梯度洗脱得到待测品HPLC指纹图谱，并与HPLC标准指纹图谱进行对比。

现有技术中，都是采用高效液相色谱或者化学滴定法将原料成分比如对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏的含量进行研究测定，但是这种方法仅仅检测了原料组成，对各个原料中所含量化学成分没有进行有效的测定，其实真正产生药效的是每一种原料中所含的有效成分，即有效成分群，化学有效成分含量的多与少也是复方感冒灵颗粒质量监控的关键，但是现有技术的质量检测体系往往忽略了这一点，导致其质量检测不够严格，从而不能充分保证药品的药效。另外，201510888682.9专利只对中药流膏(药物中间体)进行了质量控制，无法反映出最终产品的质量。本发明方案恰恰解决了这一问题，通过将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅这些原料中所含的主要有效成分原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷及化药对乙酰氨基酚与咖啡因进行定性检测，从而完善质量体系，对中药中9种有效成分的检测正好弥补了现有技术的技术空白。

另外，本发明通过具体实验得出较优的液相色谱梯度洗脱的条件，这些条件均是发明人通过大量的创造性实验得出，并不是随便选择的，通过液相色谱最终知晓对乙酰氨基酚、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡因、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷11种对照品溶液的具体出峰位置，这11种对照品溶液可以混合进样也可以单独进样，根据实际条件自行选择。然后将复方感冒灵颗粒制成标准样品溶液也在该梯度洗脱的操作条件下注入液相色谱，得到完整的复方感冒灵颗粒的化学成分指纹图谱，这个指纹图谱上除了常规的复方感冒灵颗粒的原料的出峰位置，还创造性的增加了原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷这9个峰，从而在后续检测样品时，更能准确的把关药品的质量，保证复方感冒灵颗粒的质量稳定性。为了得到的化学成分指纹图谱更加准确，本发明进一步优化了色谱条件，更优液相色谱操作条件为：流速控制在1.0ml/min，柱温30℃，检测波长290nm。

复方感冒灵颗料的化学成分标准指纹图谱在复方感冒灵颗粒的质量检测方面具有很好的应用，具体应用时将复方感冒灵颗粒制成待测品(样品)溶液在上述优化的液相色谱操作条件下进行梯度洗脱得到待测品化学成分指纹图谱，并与化学成分标准指纹图谱进行对比，以确定其产品是否合格。

与现有技术相比，本发明的创新性为：

本发明创造性的将对乙酰氨基酚、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡因、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷这11种有效成分的检测纳入质量体系，通过增加这11个指标检测，得到的复方感冒灵颗粒的化学成分指纹图谱更加清晰完整，从而在后续检测样品时，更能准确的把关药品的质量，保证复方感冒灵颗粒的质量稳定性，临床用药的有效性与安全性。

本发明通过具体实验得知了较优的液相色谱梯度洗脱的条件，这些条件均是发明人通过大量的创造性实验得出来的，并不是随便选择的，在最佳的条件下操作更能提高结果的准确性，完善整个药品的质量检测体系。

本发明的构建方法经10批大生产产品验证重复性好，操作成本较低，简单方便，人力成本以及操作成本都比较低，整个测定过程中所涉及的仪器及试剂均易得。

附图说明

图1为本发明实施例1的不同流动相的条件下样品溶液的HPLC图谱；

图2为本发明实施例1的不同检测波长的条件下样品溶液对应的HPLC图谱；

图3为本发明实施例1的对照品溶液与样品溶液的HPLC图谱对比；

图4为本发明实施例1的复方感冒灵颗粒的化学成分指纹图谱(注：1-对乙酰氨基酚 2-原儿茶酸 3-新绿原酸 4-绿原酸 5-咖啡因 6-隐绿原酸 7-咖啡酸 8-异绿原酸B 9-异绿原酸A 10-异绿原酸C 11-蒙花苷)；

图5为本发明实验例7的10批复方感冒灵颗粒样品的HPLC色谱图；

图6为本发明实验例7的10批复方感冒灵颗粒样品的对照HPLC指纹图谱(注：7-奎尼酸 8-丁香酸 9-对乙酰氨基酚 10-原儿茶酸 11-新绿原酸 13-绿原酸 14-咖啡因 15-隐绿原酸 16-松柏醛 17-咖啡酸 18-二咖啡酰奎宁酸 21-断氧化马钱子苷 22-毛冬青酸24-异绿原酸B 25-异绿原酸A 26-异绿原酸C 27-蒙花苷)；

图7为本发明实验例8的复方感冒灵颗粒HPLC-Q-TOF-MS/MS负离子流图；

图8为本发明实验例8的复方感冒灵颗粒样品与各药材的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1)分别精密称取适量对乙酰氨基酚对照品、原儿茶酸对照品、新绿原酸对照品、绿原酸对照品、咖啡因对照品、隐绿原酸对照品、咖啡酸对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品、蒙花苷对照品，用50％甲醇溶解并超声处理直至完全溶解，分别制成每1ml含对乙酰氨基酚2.6mg、原儿茶酸10μg、新绿原酸80μg、绿原酸100μg、咖啡因0.18mg、隐绿原酸80μg、咖啡酸5μg、异绿原酸B 40μg、异绿原酸A 20μg、异绿原酸C 45μg、蒙花苷100μg的对照品溶液；

2)分别精密称取复方感冒灵颗粒粉末9.0g至锥形瓶中，精密加入50ml的质量百分比浓度为50％的甲醇溶液，称重，超声处理30min，冷却，重新称重，并以50％甲醇溶液补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液，其中复方感冒灵颗粒的制备方法包括：将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后加水煎煮2次，第一次2h，第二次1.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量，加乙醇使含醇量达60％～65％，搅匀，静置，滤过，滤液浓缩至稠膏，加对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因水溶液与蔗糖粉等辅料，混匀，干燥，制成颗粒；

3)液相色谱条件的确定

a.流动相的选择：由于复方感冒流膏中的野菊花、山银花等药材所含有效成分略偏酸性，流动相应略偏酸，参考山银花中主要成分的HPLC分离流动相的选择，故采用有机相为乙腈，水相为0.1％甲酸溶液组合。由于色谱峰较多，为更好确保分离度和峰形，设置了五组不同流动相比例进行梯度条件的优化，具体流动相比例参考下表1；

表1 梯度洗脱程序

通过采用不同的流动相比例将样品溶液进行洗脱，得到的谱图见附图1，从图中可以看出，使用梯度3进行洗脱，得到的图谱效果较好，基线平稳，谱峰分离较好，峰数较多，色谱峰高适中，故选择梯度3做为流动相洗脱梯度。

b.波长的选择：Kromasil C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈(A)-0.1％的甲酸水溶液(B)梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量10μL，梯度程序如下表2：

表2 梯度洗脱程序

时间(min)	乙腈(％)	0.1％甲酸溶液(％)
			0-20	5→18	95→82
20-45	18→26	82→74
			45-55	26→35	74→65
55-60	35→5	65→95
			60-65	5	95

将样品溶液采用HPLC法检测，且检测波长在240-340nm之间，参考各个文献对于复方感冒灵中多种化学成分的检测波长，最终综合选取多个较优波长，以波长245nm、256nm、260nm、273nm、290nm、325nm、330nm、334nm对同一样品进样，以响应值、色谱峰数、分离度等评价，所得结果见附图2，从图中可以看出检测波长为290nm时，色谱峰数较多，主要色谱峰面积较高，杂质峰面积相对较低，指纹特征明显，故选定为最优波长，结合本发明的主要原料药材的主要有效成分的吸收波长范围，故可以选择波长为285-295nm；

c.参照物的选择

将本发明的11种对照品按照条件配制成混合对照品溶液后与样品溶液分别注入液相色谱10μl，将混合对照品溶液与样品溶液的色谱图进行比较，具体图谱见附图3，从图3中可以看出，11种混合对照品的色谱峰在色谱图中位置适中，且吸收强度较好，分离良好，符合参照物选择的标准。

方法学考察

精密度试验取复方感冒灵颗粒按实施例1的制备方法制备，色谱条件测定，连续进样6次，每次10μL，测得各主要共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果以9号峰(对乙酰氨基酚)的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值均在3％以内，说明仪器精密度良好。

重复性试验取复方感冒灵颗粒按实施例1的制备方法平行制备6份供试品溶液，色谱条件测定，每次进样10μL，测得各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD值均在3％以内，说明方法重复性良好。

稳定性试验取复方感冒灵颗粒按实施例1的制备方法制备，色谱条件测定，分别于0h、3h、6h、9h、12h、15h、24h时间点进样，进样量10μL，记录指纹图谱，测得各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD值均在3％以内，说明供试品溶液在24h内进样稳定性良好。

各个操作条件以及参照物均确定的条件下，将样品溶液注入液相色谱仪，得到的色谱图附图4即为复方感冒灵颗粒的化学指纹图谱，可以看出其指纹图谱分别呈现出与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰。

实施例2

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.1％的甲酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:25℃，流速:0.9mL/min。

实施例3

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.1％的甲酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:35℃，流速:0.8mL/min。

实施例4

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是色谱的流动相为乙腈(A)-0.1％的甲酸水溶液(B)梯度洗脱，柱温:20℃，流速:1.1mL/min。

实施例5

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是制备对照品溶液时，分别制成每1ml含对乙酰氨基酚2.8mg、原儿茶酸15μg、新绿原酸100μg、绿原酸120μg、咖啡因0.20mg、隐绿原酸100μg、咖啡酸10μg、异绿原酸B 50μg、异绿原酸A 30μg、异绿原酸C 50μg、蒙花苷120μg对照品溶液。

实施例6

本实施例的其他操作步骤与实施例1基本相同，只是复方感冒灵颗粒的取样量分别为：8.0g和10.0g，分别制备成样品溶液。

实施例2-6通过实验发现最佳洗脱条件与实施例1基本相同，说明本发明的洗脱条件通过反复实践已经达到在最优条件下操作，这种条件的选择也是发明人通过反复实验付出大量的创造性劳动获得，通过现有技术的简单选择是绝对得不到的，最终得到的化学成分指纹图谱与实施例1得到的图谱也基本类似。

实验例7

取复方感冒灵颗粒样品，共计10批，按照实施例1的制备方法制备，色谱条件测定，记录色谱图(见图5)，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件处理各色谱数据，选择实施例1的化学指纹图谱作参照图谱，时间窗宽度设定0.1min，用平均数法生成对照指纹图谱，共27个共有峰(见图6)。

将各指纹图谱与对照图谱进行相似度评价分析，结果10批复方感冒灵颗粒与各自对照图谱相似度均在0.99以上，表明大生产的产品与本发明的化学指纹图谱的相似度几乎接近100％，说明本发明的化学指纹图谱应用效果好，精密度以及稳定性均较好，可以很好的达到控制产品质量的目的。结果见表3。

表3 10批复方感冒灵流膏HPLC指纹图谱相似度

实验例8

采用电喷雾电离源离子化(ESI)，在负离子模式下采集。使用高纯N₂作为辅助喷雾电离与脱溶剂气体，干燥气体积流量为6.8L·min^-1，鞘气温度350℃，毛细管电压4.0kV，碎片电压130V，质量数范围为m/z50～1 000。通过比对精确相对分子质量、特征碎片峰，并结合Mass Fragment TM确定化合物的相对分子质量和可能分子式，比对已建立的目标数据库和文献，推测共有峰可能的化合物结构，其中化合物比对确认附图6中峰9，10，11，13，14，15，17，24，25，26，27分别为对乙酰氨基酚、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、咖啡因、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、蒙花苷。通过与文献比较色谱峰轮廓，附图6中确认7，8，16，18，21，22，分别为奎尼酸、丁香酸、松柏醛、二咖啡酰奎宁酸、断氧化马钱子苷、毛冬青酸，结果见图7、表4。

表4 主要共有峰HPLC-Q-TOF-MS/MS分析

附图6中共有27个峰，通过与对照品以及化学指纹图谱比对，峰7为奎尼酸，为五指柑特征峰；峰8为丁香酸，为山银花特征峰；峰10为原儿茶酸，为山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰11为新绿原酸，为岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰13为绿原酸，为岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰15为隐绿原酸，为岗梅、三叉苦、山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰16为松柏醛，为岗梅、南板蓝根、三叉苦、山银花、五指柑共有特征峰；峰17为咖啡酸，为岗梅、五指柑、野菊花共有特征峰；峰18为二咖啡酰奎宁酸，为南板蓝根、三叉苦、山银花、野菊花共有特征峰；峰21为断氧化马钱子苷，为山银花特征峰；峰22为毛冬青酸，为岗梅、南板蓝根、三叉苦、山银花、五指柑共有特征峰；峰24为异绿原酸B，为岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰25为异绿原酸A，为岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰26为异绿原酸C，为岗梅、山银花、五指柑、野菊花共有特征峰；峰27为蒙花苷，为野菊花特征峰，结果见图8。后续进行质量检测时样品需要与该指纹图谱的近似度达到0.9以上才算合格产品。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种复方感冒灵颗粒HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)精密称取对乙酰氨基酚对照品、原儿茶酸对照品、新绿原酸对照品、绿原酸对照品、咖啡因对照品、隐绿原酸对照品、咖啡酸对照品、异绿原酸B对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸C对照品、蒙花苷对照品，用甲醇溶液溶解，制成混合对照品溶液；

其中每1ml混合对照品溶液中含对乙酰氨基酚2.6mg、原儿茶酸10μg、新绿原酸80μg、绿原酸100μg、咖啡因0.18mg、隐绿原酸80μg、咖啡酸5μg、异绿原酸B 40μg、异绿原酸A 20μg、异绿原酸C 45μg、蒙花苷100μg；

(2)精密称取复方感冒灵颗粒粉末9.0g，精密加入50ml的甲醇溶液，称重，超声处理30min，冷却，重新称重，并以甲醇溶液补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液；

其中复方感冒灵颗粒包括山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅共六味中药成分和对乙酰氨基酚、咖啡因以及马来酸氯苯那敏共三种化药；

(3)将样品溶液在高效液相色谱中进行梯度洗脱，得到HPLC标准指纹图谱；高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.05-0.2％的甲酸水溶液。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，复方感冒灵颗粒的制备方法为：将山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅混合后加水煎煮2次，第一次2h，第二次1.5h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量，加乙醇使含醇量达60％～65％，搅匀，静置，滤过，滤液浓缩至稠膏，加对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因水溶液，并加入辅料，混匀，干燥，制成颗粒。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，高效液相色谱的操作条件是：KromasilC18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量10μL，洗脱程序是：

0-20min流动相A：B由5％：95％→18％：82％；

20-45min流动相A：B由18％：82％→26％：74％；

45-55min流动相A：B由26％：74％→35％：65％；

55-60min流动相A：B由35％：65％→5％：95％；

60-65min流动相A：B由5％：95％。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中的甲醇溶液的体积分数相同，且均为40-60％。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中的甲醇溶液的体积分数均为50％。

7.权利要求1-6任一项所述的构建方法得到的标准指纹图谱在复方感冒灵颗粒质量检测方面的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将复方感冒灵颗粒制成待测品溶液，在与权利要求1-6任一项所述的构建方法中所使用的相同的高效液相色谱操作条件下进行梯度洗脱得到待测品HPLC指纹图谱，并与HPLC标准指纹图谱进行对比。