CN110579549B - 一种野菊花配方颗粒的质量检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种野菊花配方颗粒的质量检测方法及应用，首先构建野菊花配方颗粒的指纹图谱，建立对照指纹图谱，分析不同批次野菊花配方颗粒的相似度，再借助主成分分析和聚类分析模式识别法评价不同厂家、同一厂家不同批次野菊花配方颗粒质量一致性，结合一测多评法对野菊花配方颗粒的指纹图谱中的10个色谱峰进行含量测定，在定性基础上进一步明确配方颗粒中大部分化学成分含量，准确可行、操作简便、检测快速、节约成本，是一种简便可行的野菊花配方颗粒多指标含量测定方法，以解决野菊花配方颗粒生产各环节质量评价和控制的难题，同时该方法实现了野菊花配方颗粒中咖啡酰奎宁酸类化合物及有机酸含量测定。

Description

一种野菊花配方颗粒的质量检测方法及应用
技术领域
本发明属于药材质量检测技术领域，具体涉及一种野菊花配方颗粒的质量检测方法及应用。
背景技术
野菊花为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的干燥头状花序，具疏散风热、消肿解毒的功效。野菊花药材成分复杂，质量控制逐步完善，配方颗粒近年来由于其携带便利、服用方便、疗效可靠被普遍选择；野菊花配方颗粒厂家众多，标准不统一，尙未有统一规范或标准评价控制野菊花配方颗粒产品一致性，强化生产各环节质量评价和控制是一大难题。
指纹图谱能全面反映野菊花配方颗粒的化学成分信息，有完整性和模糊性两大属性，其模糊性致使其缺乏准确的定性定量数据支撑，具有一定的局限性；含量测定尤其是多指标含量测定在一定程度上弥补指纹图谱法对于野菊花配方颗粒的质量评价的不足及单一成分含量测定对质量评价的局限性，传统色谱峰指认需要大量对照品做参照，指认色谱峰越多对照品需求量越大，研究成本高，外标法含量测定离不开对照品，且要求对照品纯度高，结构相似的对照品如咖啡酰奎宁酸类化合物分离提纯难，价格昂贵，严重阻碍色谱峰指认及多指标含量测定。
因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。
发明内容
本发明的目的是构建野菊花配方颗粒的指纹图谱，建立对照指纹图谱，分析不同批次野菊花配方颗粒的相似度，再借助主成分分析和聚类分析模式识别法评价不同厂家、同一厂家不同批次野菊花配方颗粒质量一致性，结合一测多评法对野菊花配方颗粒的指纹图谱中10个色谱峰进行含量测定，在定性基础上进一步明确配方颗粒中大部分化学成分含量，是一种简便可行的野菊花配方颗粒多指标含量测定方法，以解决野菊花配方颗粒生产各环节质量评价和控制的难题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种野菊花配方颗粒的质量检测方法包括：
构建野菊花配方颗粒的指纹图谱，指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)、混合对照品溶液制备：称取十种对照品5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷适量，加溶剂配制成混合对照品溶液，分别取1、2、4、6、8、10mL混合对照品溶液于10mL容量瓶中，加溶剂定容至刻度，得到系列混合对照品溶液，4℃避光保存，备用；
步骤(2)、供试品溶液制备：称取不同批次的野菊花配方颗粒0.1g于100mL具塞锥形瓶中，用移液管移取50mL的溶剂称定重量，超声，放冷，称定重量，再用同一种溶剂补足减失重量，摇匀，过0.45μm滤膜；
步骤(3)、检测：采用高效液相色谱对步骤(1)中混合对照品溶液和步骤(2)中供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
步骤(4)、建立对照指纹图谱：对步骤(2)中不同批次的野菊花配方颗粒供试品溶液进行高效液相色谱检测，色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，以第1批野菊花配方颗粒供试品溶液的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数法生成对照图谱，经过多点校正、峰匹配得到不同批次的野菊花配方颗粒的对照指纹图谱；
野菊花配方颗粒的指纹图谱模式识别法，模式识别法包括相似度评价、主成分分析和聚类分析：
所述相似度评价为根据步骤(4)中不同批次的野菊花配方颗粒对照指纹图谱计算相似度；
所述主成分分析为将不同批次野菊花配方颗粒的共有峰峰面积导入SPSS软件，选取特征值大于1的三个主成分，以三个主成分的方差贡献值进行投影，得主成分分析图，主成分分析图中有10个共有色谱峰能体现野菊花配方颗粒整体分类信息，作为野菊花配方颗粒的10个特征峰；
所述聚类分析为以野菊花配方颗粒指纹图谱中共有色谱峰峰面积为变量，借助SPSS数据统计软件对原始数据标准化，采用欧氏距离进行系统聚类分析；
一测多评法测所述10个共有色谱峰的含量，选择步骤(1)中的十种对照物中的一种为内参物，分别取步骤(1)中储备混合对照品溶液2、5、10、15、20、25μL注入液相色谱仪，计算相对校正因子平均值作为各组分相对校正因子fk/m，通过相对校正因子计算10个共有色谱峰的含量；
所述各成分相对校正因子按公式fk/m＝fk/fm＝(Cm×Ak)/(Ck×Am)计算，式中Ak为内参物峰面积，Ck为内参物质量浓度，Am为组分峰面积，Cm为组分质量浓度。
如上所述的野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，步骤(1)和步骤(2)中所述溶剂均为甲醇，步骤(2)中所述超声的时间为10～30min；
更优选地，所述甲醇为体积浓度为50％的甲醇水溶液。
如上所述的野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，步骤(1)中所述储备混合对照品溶液中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷的浓度分别为72.0μg/mL、207.2μg/mL、38.5μg/mL、3.45μg/mL、4.24μg/mL、8.6μg/mL、11.5μg/mL、15.1μg/mL、45.9μg/mL、28.2μg/mL。
如上所述的野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，步骤(3)和步骤(4)中所述高效液相色谱的色谱条件为采用Agilent EclipseXDB C18色谱柱，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm，流动相为有机相(A)～水相(B)，进行梯度洗脱，检测波长为325～335nm，柱温30～35℃，进样量10μL；
所述梯度洗脱的时间程序为0～5min，5～20min，20～35min，35～40min，40～45min，有机相的体积百分比分别为10～15％A，15～20％A，20～40％A，40～70％A，保持70％A；
优选地，所述流动相为乙腈(A)～0.1％磷酸水溶液(B)，所述流动相的流速为1.0mL.min-1。
如上所述的野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，步骤(3)中所述供试品溶液的指纹图谱，有22个共有色谱峰，对比单一对照品溶液、混和对照品溶液与不同批次配方颗粒供试品溶液的指纹图谱相同保留时间下紫外光谱吸收，结合UPLC-DAD-ESI-MS质谱数据，指认13种色谱峰，3、4、5、6、7、10、12、13、16、19、20、21、22号色谱峰分别为5-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素；
更优选的，所述野菊花配方颗粒的10个特征峰分别为：3号，5-咖啡酰奎宁酸；4号，绿原酸；5号，4-咖啡酰奎宁酸；6号，咖啡酸；7号，1,3-二咖啡酰奎宁酸；10号，木犀草苷；12号，3,5-二咖啡酰奎宁酸；13号，3,4-二咖啡酰奎宁酸；16号，4,5-二咖啡酰奎宁酸；19号，蒙花苷。
如上所述的野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，所述供试品溶液的指纹图谱中的22个共有峰，以19号蒙花苷的色谱峰为内参比峰，其他21个共有峰的相对保留时间依次为1号(0.0953±0.005)、2号(0.1232±0.005)、3号(0.1898±0.005)、4号(0.2787±0.005)、5号(0.2973±0.005)、6号(0.3504±0.005)、7号(0.4062±0.005)、8号(0.5800±0.005)、9号(0.6101±0.005)、10号(0.6420±0.005)、11号(0.6666±0.005)、12号(0.7398±0.005)、13号(0.7921±0.005)、14号(0.8199±0.005)、15号(0.8516±0.005)、16号(0.8662±0.005)、17号(0.8925±0.005)、18号(0.9849±0.005)、20号(1.0575±0.005)、21号(1.2009±0.005)、22号(1.3309±0.005)。
如上所述的，野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，所述相似度评价中不同批次的野菊花配方颗粒指纹图谱的相似度不小于95％。
如上所述的，野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，所述一测多评法中所述液相色谱仪采用不同仪器和不同色谱柱，所述仪器为SHIMADZU LC-20AT、SHIMADZU LC-20AD和Agilent 1260InfinityII中的一种；所述色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18、AgilentZorbax SB C18和Agilent Extend C18中的一种。
如上所述的，野菊花配方颗粒的质量检测方法，优选的，所述一测多评法中所述内参物为蒙花苷，所述采用不同仪器和不同色谱柱测得的10个共有色谱峰的相对校正因子的平均值分别为5.600、10.196、7.078、0.568、1.187、1.161、0.648、1.155和2.021。
如上所述的野菊花配方颗粒的质量检测方法应用于评价野菊花配方颗粒质量综合指标、评价不同厂家野菊花配方颗粒质量差异和评价同一厂家不同批次野菊花配方颗粒质量一致性。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下效果：
1、本发明以野菊花配方颗粒为研究对象，建立高效液相色谱指纹图谱分析方法及对照指纹图谱，将22共有色谱峰中13色谱峰指认为5-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素，22个共有色谱峰占总峰面积88.7～94.8％，13个指认色谱峰峰面积占共有峰总面积83.8～89.9％，对野菊花配方颗粒中80％以上色谱峰进行指认。
2、本发明建立野菊花配方颗粒对照指纹图谱，借助相似度分析、主成分分析和聚类分析模式识别方法处理指纹图谱大宗数据，直观显现不同厂家野菊花配方颗粒质量差异，评价同一厂家不同批次野菊花配方颗粒质量一致性；以蒙花苷为内参物，计算3、4、5、6、7、10、12、13、16号色谱峰相对校正因子，对比外标法和一测多评法测定的野菊花配方颗粒中待测成分及咖啡酰奎宁酸类化合物总含量结果，计算值与外标实测值无显著差异，在定性基础上进一步明确野菊花配方颗粒中大部分化学成分含量，准确可行、操作简便、检测快速、节约成本。
3、本发明以模式识别、指纹图谱结合一测多评的多元整体野菊花配方颗粒质量检测方法综合评价野菊花配方颗粒中整体、全面的指纹图谱信息、准确简便的定性定量质量信息及直观易懂的数据分类信息，该方法实现了野菊花配方颗粒中咖啡酰奎宁酸类化合物及有机酸含量测定。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
其中，
图1：为本发明实施例中混合对照品的色谱图；
图2：为本发明实施例中野菊花配方颗粒供试品溶液的色谱图；
图3：为本发明实施例中12批野菊花配方颗粒指纹图谱及对照指纹图谱；
图4：为本发明实施例中22个共有色谱峰主成分分析图；
图5：为本发明实施例中10个共有色谱峰主成分分析图；
图6：为本发明实施例中22个共有色谱峰聚类分析树状图；
图7：为本发明实施例中10个共有色谱峰聚类分析树状图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明提供一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，采用指纹图谱、模式识别结合一侧多评的多元整体质量评价体系对野菊花配方颗粒进行质量评价，建立野菊花配方颗粒指纹图谱和对照指纹图谱，通过相似度评价评判不同批次、不同厂家配方颗粒产品质量一致性，提出同厂家不同批次、不同厂家野菊花配方颗粒指纹图谱相似度需大于0.95。指认22个共有峰中13个共有峰，明确野菊花配方颗粒指纹图谱主要的化学成分，很大程度明确了野菊花配方颗粒化学组成，将3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰作为野菊花配方颗粒的10个特征峰。以蒙花苷含量不小于0.8％，指纹图谱相似度不小于0.95，5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷10个色谱峰为特征峰作为野菊花配方颗粒质量评价综合指标；主成分分析、聚类分析模式识别方法对不同厂家、同一厂家不同批次配方颗粒的鉴别分类结果与样品来源、样品外观信息一致；以蒙花苷为内参物，采用一测多评法对指纹图谱中10个色谱峰进行含量测定，与外标法测定结果无明显差异，在定性基础上进一步明确配方颗粒中大部分化学成分含量，是一种简便可行的野菊花配方颗粒多指标含量测定方法，显著促进野菊花配方颗粒整体、全面的质量评价工作。
本发明提供的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，包括：
构建野菊花配方颗粒的指纹图谱，野菊花配方颗粒的指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)、混合对照品溶液制备：称取5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷适量，加体积百分数为50％的甲醇水溶液配制成混合对照品溶液，分别取1、2、4、6、8、10mL混合对照品溶液于10mL容量瓶中，加溶剂定容至刻度，得到系列混合对照品溶液，4℃避光保存，备用；
在本发明具体实施例中，混合对照品溶液中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷的浓度分别为72.0μg/mL、207.2μg/mL、38.5μg/mL、3.45μg/mL、4.24μg/mL、8.6μg/mL、11.5μg/mL、15.1μg/mL、45.9μg/mL、28.2μg/mL。
步骤(2)、供试品溶液制备：称取不同批次的野菊花配方颗粒0.1g于100mL具塞锥形瓶中，用移液管移取50mL体积百分数为50％的甲醇水溶液，称定重量，超声10～30min，放冷，称定重量，再用体积百分数为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，过0.45μm滤膜；
步骤(3)、检测：采用高效液相色谱对步骤(1)中混合对照品溶液和步骤(2)中供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
在本发明具体实施例中，野菊花配方颗粒的指纹图谱的构建方法中高效液相色谱的色谱条件为采用Agilent EclipseXDB C18色谱柱，尺寸为4.6mm×250mm，填料颗粒度为5μm，流动相为有机相(A)～水相(B)，进行梯度洗脱，检测波长为325～335nm，柱温30～35℃，进样量10μL；
梯度洗脱的时间程序为0～5min，5～20min，20～35min，35～40min，40～45min，有机相的体积百分比分别为10～15％A，15～20％A，20～40％A，40～70％A，保持70％A；
优选地，流动相为乙腈(A)～0.1％磷酸水溶液(B)，流动相的流速为1.0mL.min-1。
在本发明具体实施例中，供试品溶液的指纹图谱，有22个共有色谱峰，对比单一对照品溶液、混和对照品溶液与不同批次配方颗粒供试品溶液的指纹图谱相同保留时间下紫外光谱吸收，结合UPLC-DAD-ESI-MS质谱数据，指认13种色谱峰，3、4、5、6、7、10、12、13、16、19、20、21、22号色谱峰分别为5-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素、金合欢素；优选的，所述野菊花配方颗粒的10个特征峰分别为：3号，5-咖啡酰奎宁酸；4号，绿原酸；5号，4-咖啡酰奎宁酸；6号，咖啡酸；7号，1,3-二咖啡酰奎宁酸；10号，木犀草苷；12号，3,5-二咖啡酰奎宁酸；13号，3,4-二咖啡酰奎宁酸；16号，4,5-二咖啡酰奎宁酸；19号，蒙花苷。
在本发明具体实施例中，所述供试品溶液的指纹图谱中的22个共有峰，以19号蒙花苷的色谱峰为内参比峰，其他21个共有峰的相对保留时间依次为1号(0.0953±0.005)、2号(0.1232±0.005)、3号(0.1898±0.005)、4号(0.2787±0.005)、5号(0.2973±0.005)、6号(0.3504±0.005)、7号(0.4062±0.005)、8号(0.5800±0.005)、9号(0.6101±0.005)、10号(0.6420±0.005)、11号(0.6666±0.005)、12号(0.7398±0.005)、13号(0.7921±0.005)、14号(0.8199±0.005)、15号(0.8516±0.005)、16号(0.8662±0.005)、17号(0.8925±0.005)、18号(0.9849±0.005)、20号(1.0575±0.005)、21号(1.2009±0.005)、22号(1.3309±0.005)。
步骤(4)、建立对照指纹图谱：对步骤(2)中不同批次的野菊花配方颗粒供试品溶液进行高效液相色谱检测，色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，以第1批野菊花配方颗粒供试品溶液的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数法生成对照图谱，经过多点校正、峰匹配得到不同批次的野菊花配方颗粒的对照指纹图谱。
野菊花配方颗粒的指纹图谱模式识别，所述模式识别包括相似度评价、主成分分析和聚类分析。
所述相似度评价，根据所述不同批次的野菊花配方颗粒对照指纹图谱计算相似度；本发明具体实施例中，不同批次的野菊花配方颗粒指纹图谱的相似度不小于95％。
所述主成分分析为将不同批次野菊花配方颗粒的共有峰峰面积导入SPSS软件，选取特征值大于1的三个主成分，以三个主成分的方差贡献值进行投影，得主成分分析图，主成分分析图中有10个共有色谱峰能体现野菊花配方颗粒整体分类信息，作为野菊花配方颗粒的10个特征峰；
所述聚类分析为以野菊花配方颗粒指纹图谱中共有色谱峰峰面积为变量，借助SPSS数据统计软件对原始数据标准化，采用欧氏距离进行系统聚类分析；野菊花配方颗粒的10个特征峰分别为：3号，5-咖啡酰奎宁酸；4号，绿原酸；5号，4-咖啡酰奎宁酸；6号，咖啡酸；7号，1,3-二咖啡酰奎宁酸；10号，木犀草苷；12号，3,5-二咖啡酰奎宁酸；13号，3,4-二咖啡酰奎宁酸；16号，4,5-二咖啡酰奎宁酸；19号，蒙花苷。
一测多评法测10个共有色谱峰的含量，选择蒙花苷内参物，分别取步骤(1)中的储备混合对照品溶液2、5、10、15、20、25μL注入液相色谱仪，计算相对校正因子平均值作为各组分相对校正因子fk/m，通过相对校正因子计算10个共有色谱峰的含量；其中，储备混合对照品溶液中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷浓度依次为72.0μg/mL、207.2μg/mL、38.5μg/mL、3.45μg/mL、4.24μg/mL、8.6μg/mL、11.5μg/mL、15.1μg/mL、45.9μg/mL、28.2μg/mL
各成分相对校正因子按公式fk/m＝fk/fm＝(Cm×Ak)/(Ck×Am)计算，式中Ak为内参物峰面积，Ck为内参物质量浓度，Am为组分峰面积，Cm为组分质量浓度；
在本发明具体实施例中，一测多评法中的液相色谱仪采用不同仪器和不同色谱柱，优选的，仪器为SHIMADZU LC-20AT、SHIMADZU LC-20AD和Agilent 1260InfinityII中的一种；优选的，色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18、Agilent Zorbax SB C18和AgilentExtend C18中的一种。
在本发明具体实施例中，一测多评法中内参物为蒙花苷，采用不同仪器和不同色谱柱测得的10个共有色谱峰的相对校正因子的平均值分别为5.600、10.196、7.078、0.568、1.187、1.161、0.648、1.155和2.021。
野菊花配方颗粒的质量检测方法应用于评价野菊花配方颗粒质量综合指标、评价不同厂家野菊花配方颗粒质量差异和评价同一厂家不同批次野菊花配方颗粒质量一致性。
实施例1
1、仪器与试药
SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪；Agilent UPLC-ESI-MS液相色谱质谱联用仪，KQ-500V型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME204万分之一电子天平(梅特勒·托利多仪器上海有限公司)；AUW 220D十万分之一天平(日本岛津公司)。
绿原酸(批号110753-201415)、咖啡酸(批号110885-200102)、木犀草苷(批号111720-201609)、蒙花苷(批号111528-201710)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(批号111782-201706)、木犀草素(批号111520-201605)、芹菜素(批号111901-201603)购自中国食品药品检定研究院；4,5-二咖啡酰奎宁酸(批号wkq16081905)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(批号wkq16040902)、4-咖啡酰奎宁酸(批号wkq16081903)、金合欢素(批号wkq17091109)购自四川省维克奇生物科技有限公司；1,3-二咖啡酰奎宁酸(批号1704116)购自成都普菲德生物技术有限公司；5-咖啡酰奎宁酸(批号12061129)购自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯(天津四友)，磷酸为分析纯，水为哇哈哈纯净水。野菊花配方颗粒购自各医院药房。样品信息见表1。
表1、样品信息
Figure BDA0002236910470000091
2、野菊花配方颗粒的指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)、混合对照品溶液制备：分别精密称取5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷适量，加体积百分数为50％的甲醇水溶液配制成浓度依次为72.0μg/mL、207.2μg/mL、38.5μg/mL、3.45μg/mL、4.24μg/mL、8.6μg/mL、11.5μg/mL、15.1μg/mL、45.9μg/mL、28.2μg/mL的储备混合对照品溶液，分别取1、2、4、6、8、10mL混合对照品溶液于10mL容量瓶中，加50％的甲醇水溶液定容至刻度，得到系列混合对照品溶液，4℃避光保存，备用；
(2)、供试品溶液制备：精密称取12批次的野菊花配方颗粒0.1g于100mL具塞锥形瓶中，用移液管移取50mL体积百分数为50％的甲醇水溶液，称定重量，超声10～30min，放冷，称定重量，再用体积百分数为50％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，过0.45μm滤膜；
(3)、检测：采用高效液相色谱对步骤(1)中混合对照品溶液和步骤(2)中供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
(4)、建立对照指纹图谱：对步骤(2)中12批次的野菊花配方颗粒供试品溶液进行高效液相色谱检测，色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，以第1批野菊花配方颗粒供试品溶液的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数法生成对照图谱，经过多点校正、峰匹配得到12批次的野菊花配方颗粒的对照指纹图谱。
其中，高效液相色谱条件为：Agilent EclipseXDB C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈(A)～0.1％磷酸水溶液(B)为流动相，以1.0mL.min-1的流速执行梯度洗脱时间程序0～5min，10～15％A，5～20min，15～20％A，20～35min，20～40％A，35～40min，40～70％A；40～45min，保持70％A；检测波长330nm；柱温30℃；进样量10μL。
取混合对照品溶液、供试品溶液进样分析，待测色谱峰与相邻色谱峰分离度＞1.50，分离效果良好；拖尾因子值在0.95～1.25之间，理论塔板数以蒙花苷峰计在3000以上。
将混合对照品溶液、野菊花配方颗粒供试品溶液批处理自动进样分析，采集190-400nm波长范围响应值，330nm条件下混和对照品溶液及配方颗粒供试品溶液的色谱图见图1和图2。
将330nm波长下AIA格式的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，以1号样品指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数法生成对照图谱，经过多点校正、峰匹配得到野菊花配方颗粒指纹图谱的对照图谱，见图3。
实施例2
线性范围，精密吸取系列混合对照品溶液10μL，以实施例1中的高效液相色谱条件自动进样，记录各色谱峰峰面积，以峰面积(Y)对进样量(x，ng)线性回归，10成分线性方程、线性范围、检出限、定量限见表2。
表2、10成分线性方程及线性范围
Figure BDA0002236910470000101
Figure BDA0002236910470000111
实施例3
精密度试验，取5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷适量，加体积百分数为50％的甲醇水溶液配制成浓度依次为72.0μg/mL、207.2μg/mL、38.5μg/mL、3.45μg/mL、4.24μg/mL、8.6μg/mL、11.5μg/mL、15.1μg/mL、45.9μg/mL、28.2μg/mL的混合对照品溶液于同一天连续进样6次，计算10个共有色谱峰面积RSD，3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰峰面积RSD依次为0.78％、0.86％、1.15％、1.13％、1.06％、0.98％、1.21％、1.05％、1.24％、0.69％；同一浓度的混合对照品溶液连续6天进样，3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰峰面积RSD依次为1.24％、1.67％、2.36％、1.87％、1.36％、1.44％、1.65％、1.82％、1.66％、1.27％，以19号色谱峰为参照峰，色谱峰相对峰面积和相对保留时间RSD小于3.0％，仪器日内精密度和日间精密度良好。
实施例4
重复性试验，同一份野菊花配方颗粒平行制备6份供试品溶液，外标法测定6份供试品溶液中3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰含量，10成分含量RSD分别为1.08％、1.42％、1.67％、1.22％、1.85％、0.78％、1.38％、0.69％、0.87％、0.95％，以19号色谱峰为参照峰，相对保留时间RSD小于3.0％，方法重复性良好。
实施例5
稳定性试验，同一份供试品溶液于配制完成后0、4、8、12、24h进样分析，3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰峰面积RSD分别为0.98％、1.32％、1.94％、1.68％、1.89％、0.82％、0.97％、1.25％、1.64％、0.85％，以19号色谱峰为参照峰，相对峰面积和相对保留时间RSD小于3.0％，供试品溶液24h内稳定性良好。
实施例6
加样回收率，称取已知含量的野菊花配方颗粒6份，准确加入一定体积相应含量的10种对照品溶液，加50％甲醇定容于50mL容量瓶，按供试品溶液制备方法处理即得。3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰平均回收率分别为98.22％、99.41％、100.65％、101.52％、97.31％、98.57％、97.26％、102.65％、101.16％、99.27％，RSD分别为1.24％、0.69％、1.58％、2.23％、2.57％、1.48％、1.69％、2.07％、1.86％、0.99％。
实施例7
相似度评价，根据实施例1中12批次的野菊花配方颗粒对照指纹图谱计算相似度，评判不同批次、不同厂家野菊花配方颗粒产品质量一致性，同厂家不同批次、不同厂家野菊花配方颗粒指纹图谱相似度需大于0.95。相似度计算结果见表3。
表3、相似度计算
编号 1(JY) 2(JY) 3(JY) 4(JY) 5(KR) 6(KR) 7(YF) 8(YF) 9(YF) 10(SJ) 11(YF) 12(YF) R
1(JY) 1.000 0.998 0.996 1.000 0.946 0.946 0.971 0.954 0.975 0.960 0.989 0.991 0.994
2(JY) 0.998 1.000 0.992 0.999 0.938 0.937 0.969 0.960 0.972 0.965 0.990 0.989 0.992
3(JY) 0.996 0.992 1.000 0.995 0.945 0.945 0.969 0.953 0.973 0.959 0.992 0.988 0.992
4(JY) 1.000 0.999 0.995 1.000 0.944 0.944 0.970 0.955 0.974 0.961 0.989 0.991 0.993
5(KR) 0.946 0.938 0.945 0.944 1.000 0.999 0.953 0.858 0.958 0.867 0.948 0.949 0.962
6(KR) 0.946 0.937 0.945 0.944 0.999 1.000 0.952 0.857 0.957 0.867 0.952 0.956 0.962
7(SJ) 0.971 0.969 0.969 0.970 0.953 0.952 1.000 0.947 0.998 0.949 0.969 0.972 0.988
8(SJ) 0.954 0.960 0.953 0.955 0.858 0.857 0.947 1.000 0.945 0.998 0.972 0.968 0.961
9(SJ) 0.975 0.972 0.973 0.974 0.958 0.957 0.998 0.945 1.000 0.948 0.971 0.972 0.990
10(SJ) 0.960 0.965 0.959 0.961 0.867 0.867 0.949 0.998 0.948 1.000 0.965 0.971 0.966
11(YF) 0.989 0.990 0.992 0.989 0.948 0.952 0.969 0.972 0.971 0.965 1.000 0.998 0.993
12(YF) 0.991 0.989 0.988 0.991 0.949 0.956 0.972 0.968 0.972 0.971 0.996 1.000 0.989
R 0.994 0.992 0.992 0.993 0.962 0.962 0.988 0.961 0.990 0.966 0.993 0.989 1.000
实施例8
色谱峰指认，12批次野菊花配方颗粒有22个共有色谱峰，22个共有色谱峰蜂面积占总峰面积百分比88.7～94.8％；对比单一对照品、混和对照品与配方颗粒指纹图谱相同保留时间下紫外光谱吸收，结合UPLC-DAD-ESI-MS质谱数据，指认3、4、5、6、7、10、12、13、16、19、20、21、22号色谱峰，结果见图1和图2。指认13色谱峰峰面积占总峰面积75.3～83.6％，占共有色谱峰峰面积82.8～87.9％，其中3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰峰面积占总峰面积百分比大于1.33％，总面积占总色谱峰面积的74.5～83.2％，占共有色谱峰峰面积的82.3～87.1％，20、21、22号色谱峰响应值较小，低于木犀草素、芹菜素、金合欢素定量限。以蒙花苷峰作为参照峰(19号)，计算各共有色谱峰保留时间、相对保留时间、峰面积及峰面积百分比，见表4。
表4、指纹图谱中22个共有色谱峰相关参数
Figure BDA0002236910470000131
Figure BDA0002236910470000141
实施例9
主成分分析，分别将12批配方颗粒22个共有峰峰面积导入SPSS软件进行主成分分析，选取特征值大于1的3个主成分，其中PC1、PC2、PC3方差贡献值分别为43.63％、26.39％、20.99％，累积贡献值高达91.01％，代表野菊花配方颗粒指纹图谱中的绝大部分信息，分别绘制PC1、PC2及PC1、PC2、PC3的散点图，得到主成分分析二维得分图，见图4，不同厂家配方颗粒分类效果良好，个别厂家不同批次之间差异性显著。将10个峰面积大于1.31％的10个指认色谱峰峰面积导入SPSS软件进行主成分分析，前3个主成分特征值大于1，PC1、PC2、PC3方差贡献值分别为56.50％、22.86％、12.94％，累积贡献率为92.36％，主成分分析二维得分图见图5，从图4、图5可看出10个指认色谱峰主成分分析结果与22个共有峰主成分分析结果总体一致，且不同厂家分类趋势更显著，可见该10个共有色谱峰能体现野菊花配方颗粒整体分类信息，可将该10个共有色谱峰作为野菊花配方颗粒特征峰。
实施例10
聚类分析，分别以野菊花配方颗粒指纹图谱中22个共有峰及10个指认共有色谱峰峰面积为变量，借助SPSS数据统计软件对原始数据标准化，采用欧氏距离进行系统聚类分析，22个共有峰及10个指认共有色谱峰聚类分析结果分别见图6、7，当欧式距离为5时，7号因与8、9、10显著不同单独聚为一类，其他厂家颗粒聚类结果与实际样品信息一致，与主成分分析结果一致，观察颗粒外观，7号样品色泽比同厂家8、9、10号暗沉，可见聚类分析结果反映出与外观一致结果。
实施例11
一测多评法测10个共有色谱峰的含量，以蒙花苷为内参物，取实施例1中的混合对照品溶液2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL分别注入液相色谱仪，计算10个共有色谱峰的相对校正因子平均值作为各组分相对校正因子fk/m，通过相对校正因子计算10个共有色谱峰的含量，见表5。其中，A，5-咖啡酰奎宁酸；B，绿原酸；C，4-咖啡酰奎宁酸；D，咖啡酸；E，1,3-二咖啡酰奎宁酸；F，木犀草苷；G，3,5-二咖啡酰奎宁酸；H，3,4-二咖啡酰奎宁酸；I，4,5-二咖啡酰奎宁酸；K，蒙花苷。
所述各成分相对校正因子按公式fk/m＝fk/fm＝(Cm×Ak)/(Ck×Am)计算，式中Ak为内参物峰面积，Ck为内参物质量浓度，Am为组分峰面积，Cm为组分质量浓度。
表5、10个共有色谱峰与蒙花苷的相对校正因子f
Figure BDA0002236910470000151
实施例12
高效液相色谱仪器及色谱柱耐用性考察
考察SHIMADZU LC-20AT、SHIMADZU LC-20AD、Agilent 1260InfinityII液相色谱仪，Agilent Eclipse XDB C18、Agilent Zorbax SB C18、Agilent Extend C18色谱柱，计算10个共有色谱峰与蒙花苷相对校正因子f值，见表6。
表6、不同仪器、不同色谱柱下10个共有色谱峰相对校正因子f值
Figure BDA0002236910470000152
Figure BDA0002236910470000161
实施例13
待测成分色谱峰定位，以蒙花苷为内参物，分别按式子Rk/m＝tk/tm、Rk-m＝tk-tm计算不同色谱仪器和不同色谱柱中各待测成分色谱峰的相对保留值和保留时间差值，式中Rk/m为待测组分相对保留值，Rk-m为待测组分保留时间差值，tk为内参物保留时间，tm为待测组分保留时间，结果部分色谱峰相对保留值和保留时间差值RSD均大于5.0％，不能够准确的定位全部待测物。以保留时间居中的4,5-二咖啡酰奎宁酸色谱峰为色谱峰定位内参物，不同仪器、不同色谱柱的保留时间差值RSD有大于5.0％的情况，相对保留值RSD均小于5.0％。故采用以4,5-二咖啡酰奎宁酸(12号色谱峰)为内参物，相对保留值法对待测成分定位，10个成分相对保留值见表7。
表7、不同仪器、不同色谱柱下10个成分相对保留值
Figure BDA0002236910470000162
Figure BDA0002236910470000171
实施例14
样品测定，分别采用外标法和一测多评法计算待测成分含量，两种方法计算所得结果经相关系数分析，相关系数大于0.9999，经t检验，P值大于0.05，表明两方法计算结果无显著性差异，QAMS准确、可行，12批次野菊花配方颗粒中10个特征色谱峰一测多评(QAMS)法与外标(ESTD)法含量计算结果见表8。
表8 QAMS法与ESTD法对10个共有色谱峰含量测定结果
Figure BDA0002236910470000172
Figure BDA0002236910470000181
本试验所建立的方法也能够对野菊花配方颗粒中7种咖啡酰奎宁酸类、8种有机酸类化合物进行含量测定，测定结果见表9。
表9、野菊花配方颗粒中咖啡酰奎宁酸类化合物、有机酸含量测定
Figure BDA0002236910470000182
综上所述，本试验采用指纹图谱、模式识别结合一测多评的多元整体质量检测方法对野菊花配方颗粒进行质量评价，建立野菊花配方颗粒指纹图谱和对照指纹图谱，通过相似度评价评判不同批次、不同厂家配方颗粒产品质量一致性，提出同厂家不同批次、不同厂家野菊花配方颗粒指纹图谱相似度需大于0.95；指认22个共有峰中13个共有峰，明确野菊花配方颗粒指纹图谱中大于75.3％的化学成分，很大程度明确了野菊花配方颗粒化学组成，将3、4、5、6、7、10、12、13、16、19号色谱峰作为野菊花配方颗粒特征色谱峰。以蒙花苷含量不小于0.8％，指纹图谱相似度不小于0.95，5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷10色谱峰为特征峰作为野菊花配方颗粒质量评价综合指标；主成分分析、聚类分析模式识别方法对不同厂家、同一厂家不同批次配方颗粒的鉴别分类结果与样品来源、样品外观信息一致。以蒙花苷为内参物，采用一测多评法对指纹图谱中10个色谱峰进行含量测定，与外标法测定结果无明显差异，在定性基础上进一步明确配方颗粒中大部分化学成分含量，是一种简便可行的野菊花配方颗粒多指标含量测定方法，显著促进野菊花配方颗粒整体、全面的质量评价工作。
此外，咖啡酰奎宁酸类化合物为野菊花配方颗粒中除蒙花苷外含量较高的一类化合物，本试验所建方法实现了野菊花配方颗粒中咖啡酰奎宁酸类化合物及有机酸含量测定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均在本发明待批权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括：
构建野菊花配方颗粒的指纹图谱，所述指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤（1）、混合对照品溶液制备：称取十种对照品5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷适量，加溶剂配制成混合对照品溶液，分别取1、2、4、6、8、10 mL混合对照品溶液于10 mL容量瓶中，加溶剂定容至刻度，得到系列混合对照品溶液，4℃避光保存，备用；
步骤（2）、供试品溶液制备：称取不同批次的野菊花配方颗粒0.1 g于100 mL具塞锥形瓶中，用移液管移取50 mL的溶剂称定重量，超声，放冷，称定重量，再用同一种溶剂补足减失重量，摇匀，过0.45 μm滤膜；
步骤（3）、检测：采用高效液相色谱对步骤（1）中混合对照品溶液和步骤（2）中供试品溶液分别进行检测，并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱；
步骤（4）、建立对照指纹图谱：对步骤（2）中不同批次的野菊花配方颗粒供试品溶液进行高效液相色谱检测，色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，2012.130723版本，以第1批野菊花配方颗粒供试品溶液的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数法生成对照图谱，经过多点校正、峰匹配得到不同批次的野菊花配方颗粒的对照指纹图谱；
野菊花配方颗粒的指纹图谱模式识别法，所述模式识别法包括相似度评价、主成分分析和聚类分析：
所述相似度评价为根据步骤（4）所述不同批次的野菊花配方颗粒对照指纹图谱计算相似度；
所述主成分分析为将不同批次野菊花配方颗粒的共有峰峰面积导入SPSS软件，选取特征值大于1的三个主成分，以三个主成分的方差贡献值进行投影，得主成分分析图，所述主成分分析图中有10个共有色谱峰能体现野菊花配方颗粒整体分类信息，作为野菊花配方颗粒的10个特征峰；
所述聚类分析为以野菊花配方颗粒指纹图谱中共有色谱峰峰面积为变量，借助SPSS数据统计软件对原始数据标准化，采用欧氏距离进行系统聚类分析；
一测多评法，所述一测多评法测所述10个共有色谱峰的含量，选择步骤（1）中的十种对照物中的一种为内参物，分别取步骤（1）中混合对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL注入液相色谱仪，计算相对校正因子平均值作为各组分相对校正因子fk/m，通过相对校正因子计算10个共有色谱峰的含量；
所述各成分相对校正因子按公式fk/m＝fk/fm＝(Cm×Ak)/(Ck×Am)计算，式中Ak为内参物峰面积，Ck为内参物质量浓度，Am为组分峰面积，Cm为组分质量浓度；
步骤（3）和步骤（4）中所述高效液相色谱的色谱条件为采用Agilent Eclipse XDB C18色谱柱，尺寸为4.6 mm×250 mm，填料颗粒度为5 µm，流动相为乙腈A~ 0.1%磷酸水溶液B，进行梯度洗脱，检测波长为325~335 nm，柱温30~35℃，进样量10 µL；
所述梯度洗脱的时间程序为0～5 min，5～20 min，20～35 min，35～40 min，40～45min，有机相的体积百分比分别为10～15% A，15～20% A，20～40% A，40～70% A，保持70%A。
2.如权利要求1所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）中所述溶剂均为甲醇水溶液，步骤（2）中所述超声的时间为10~30 min；所述甲醇水溶液为体积浓度为50%的甲醇水溶液。
3.如权利要求1所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述混合对照品溶液中5-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、蒙花苷的浓度分别为72.0μg/mL、207.2μg/mL、38.5μg/mL、3.45μg/mL、4.24μg/mL、8.6μg/mL、11.5μg/mL、15.1μg/mL、45.9μg/mL、28.2μg/mL。
4.如权利要求1所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述供试品溶液的指纹图谱，有22个共有色谱峰，对比单一对照品溶液、混合对照品溶液与不同批次配方颗粒供试品溶液的指纹图谱相同保留时间下紫外光谱吸收，结合UPLC-DAD-ESI-MS质谱数据，指认野菊花配方颗粒的10个特征峰分别为：3号，5-咖啡酰奎宁酸；4号，绿原酸；5号，4-咖啡酰奎宁酸；6号，咖啡酸；7号，1,3-二咖啡酰奎宁酸；10号，木犀草苷；12号，3,5-二咖啡酰奎宁酸；13号，3,4-二咖啡酰奎宁酸；16号，4,5-二咖啡酰奎宁酸；19号，蒙花苷。
5.如权利要求4所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：所述供试品溶液的指纹图谱中的22个共有峰，以19号蒙花苷的色谱峰为内参比峰，其他21个共有峰的相对保留时间依次为1号：0.0953±0.005、2号：0.1232±0.005、3号：0.1898±0.005、4号：0.2787±0.005、5号：0.2973±0.005、6号：0.3504±0.005、7号：0.4062±0.005、8号：0.5800±0.005、9号：0.6101±0.005、10号：0.6420±0.005、11号：0.6666±0.005、12号：0.7398±0.005、13号：0.7921±0.005、14号：0.8199±0.005、15号：0.8516±0.005、16号：0.8662±0.005、17号：0.8925±0.005、18号：0.9849±0.005、20号：1.0575±0.005、21号：1.2009±0.005、22号：1.3309±0.005。
6.如权利要求1所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：所述相似度评价中不同批次的野菊花配方颗粒指纹图谱的相似度不小于95%。
7.如权利要求1所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：所述一测多评法中所述液相色谱仪采用不同仪器，所述仪器为SHIMADZU LC-20AT、SHIMADZU LC-20AD和Agilent 1260 InfinityII中的一种。
8.如权利要求7所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法，其特征在于：所述一测多评法中所述内参物为蒙花苷，所述采用不同仪器和不同色谱柱测得的10个共有色谱峰的相对校正因子的平均值分别为5.600、10.196、7.078、0.568、1.187、1.161、0.648、1.155和2.021。
9.一种如权利要求1~8任一所述的一种野菊花配方颗粒的质量检测方法的应用，其特征在于：所述野菊花配方颗粒的质量检测方法应用于评价野菊花配方颗粒质量综合指标、评价不同厂家野菊花配方颗粒质量差异和评价同一厂家不同批次野菊花配方颗粒质量一致性。
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