CN115047099A - 一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法 - Google Patents
一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法及其快速测定模型。本发明还提供一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法，包括：将银杏叶提取物样品过层析柱洗脱，获得的洗脱液采用近红外光谱法进行测定，获得的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据代入快速测定模型中，获得洗脱液中总萜内酯的含量。本发明更提供一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法的设备、介质及其产品。本发明提供的一种银杏叶提取物洗脱过程中总内酯含量的快速测定方法，具有较高的性能和准确性，能够满足定量分析，实现中间品的快速放行和提升产品的均一性。
Description
技术领域
本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法。
背景技术
目前药品质量控制仅仅依赖于对成品的检验，往往忽视了生产过程中有效成分的变化情况，然而传统的检测技术一般需要复杂的样品处理，并且耗时较长难以满足洗脱过程的动态检测；同时，在工厂中判断洗脱的结束往往来自于工人的经验，没有科学的数据支持，也就造成了产品均一性较差、资源浪费等问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法，实现整体洗脱工段总萜类内酯快速定量分析，为洗脱终点的判定提供数据支持，实现生产过程质量控制。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法，包括以下步骤：
1)将银杏叶提取物样品过层析柱洗脱，获得洗脱液；
2)将步骤1)获得的洗脱液采用近红外光谱法(NIRs)进行测定，获得洗脱液中总萜内酯的吸光度数据，将吸光度数据分别采用不同光谱预处理方法进行光谱预处理，获得各种光谱预处理后吸光度数据；
3)将步骤1)获得的洗脱液采用液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)进行测定，获得洗脱液中总萜内酯的含量数据；
4)将步骤3)获得的洗脱液中总萜内酯的含量数据作为实测样本按Kennard-Stone算法原理分别归类为校正集和验证集；
5)将步骤4)获得的校正集中实测样本数据，与对应的各种光谱预处理后吸光度数据拟合出各种光谱预处理后样本-吸光度工作曲线，作为预测模型，再将校正集和验证集中实测样本对应的各种光谱预处理后吸光度数据代入预测模型中，获得校正集和验证集中预测样本数据；
6)将校正集中实测样本数据和预测样本数据分别计算相关系数(R)、校正集误差均方根(RMSEC)、性能偏差比(RPD)，将验证集中实测样本数据和预测样本数据分别计算验证集误差均方根(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，以相关系数(R)、校正集误差均方根(RMSEC)为指标选择波段，以性能偏差比(RPD)、验证集误差均方根(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)为指标选择光谱预处理方法；
7)采用步骤6)选择的光谱预处理方法对步骤6)选择的波段范围内的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据进行光谱预处理后，根据光谱预处理后总萜内酯的吸光度数据与相应总萜内酯的含量数据拟合出总萜内酯的含量-吸光度工作曲线，建立快速测定模型。
优选地，步骤1)中，所述银杏叶提取物样品为上海上药杏灵科技药业股份有限公司生产的银杏叶提取物。
优选地，步骤1)中，所述洗脱液为银杏叶提取物样品的洗脱液。所述洗脱液均采自于上海上药杏灵科技药业股份有限公司的提取车间中的液态样本，其溶剂为95％乙醇。
优选地，步骤1)中，所述洗脱液的洗脱取样程序为：从洗脱开始前15min±10s至洗脱开始时，每隔3min±5s取样一次；从洗脱开始至洗脱进行60min±10s时，每隔5min±5s取样一次；从洗脱进行60min±10s至洗脱结束时，每隔10min±5s取样一次。
优选地，步骤1)中，所述层析柱中的填充物为聚酰胺。
优选地，步骤2)中，所述近红外光谱法(NIRs)的测定条件为：空白背景为空气；分辨率为5-10cm-1，优选为8cm-1；图谱扫描次数为30-35次，优选为32次；样品扫描次数为2-4次，优选为3次；扫描时间25-35s，优选为30s；扫描光谱范围为4000～12000cm-1。
优选地，步骤2)中，所述近红外光谱法(NIRs)的测定样品池为2mm石英比色皿。
优选地，步骤2)中，所述光谱预处理方法选自导数法、减去一条直线法、矢量归一化法(SNV)、多元散射校正法(MSC)中的一种或多种组合。
更优选地，所述导数法选自一阶导数法或二阶导数法中的一种。
上述导数法(一阶导数、二阶导数)是基于光谱数据求(一阶、二阶)导数，导数光谱可以有效消除基线和其他背景干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度。上述减去一条直线法是平衡光谱数据的基线，消除基线干扰。上述矢量归一化法(SNV)是通过单个样本光谱的标准偏差来修正光谱变化。上述多元散射校正法(MSC)是通过一组样本的光谱，基于统计的方法来修正因为光谱散射所发生的变化。
上述光谱预处理方法基于光谱数据中掺杂较多的噪声信息，可以过滤噪声信息，保留有效信息。
优选地，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)进行测定，还包括以下步骤：
a)对照品溶液的制备：将总萜内酯的对照品加入二甲基亚砜溶解并定容，配成对照品溶液，所述总萜内酯包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯；
b)测定：采用液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)分别测定供试品溶液和步骤a)中的对照品溶液，通过保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过外标法定量，确定供试品溶液中待测成分的含量。
更优选地，步骤a)中，所述银杏内酯A的CAS号为15291-75-5；所述银杏内酯B的CAS号为11291-77-7；所述银杏内酯C的CAS号为15291-76-6；所述白果内酯的CAS号为33570-04-6。
更优选地，步骤a)中，所述对照品溶液中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯的浓度为1mg/mL。
更优选地，步骤b)中，所述供试品溶液和对照品溶液在采用液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)进行测定前，要加入45-55％的乙醇水溶液进行稀释，优选为50％的乙醇水溶液.
上述45-55％的乙醇水溶液为体积百分数为45-55％的乙醇水溶液。上述50％的乙醇水溶液为体积百分数为50％的乙醇水溶液。
更优选地，步骤b)中，所述液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：C18色谱柱；检测器：质谱；检测波长：无；柱温：40-50℃；流速：0.1-0.3ml/min；进样量：0.5-2μl；流动相：0.05-0.2％甲酸水溶液-甲醇，其中，A相为：0.05-0.2％甲酸水溶液，B相为：甲醇；分析时间为60min；梯度洗脱。
进一步优选地，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)；检测器：质谱；检测波长：无；柱温：45℃；流速：0.2ml/min；进样量：1μl；流动相：0.1％甲酸水溶液-甲醇，其中，A相为：0.1％甲酸水溶液，B相为：甲醇；分析时间为60min；梯度洗脱。
上述0.05-0.2％甲酸水溶液为体积百分数为0.05-0.2％的甲酸水溶液。上述0.1％甲酸水溶液为体积百分数为0.1％的甲酸水溶液。
进一步更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0～5min，A相：B相体积比为90：10-75：25；
5～17min，A相：B相体积比为75：25-75：25；
17～22min，A相：B相体积比为75：25-65：35；
22～35min，A相：B相体积比为65：35-60：40；
35～40min，A相：B相体积比为60：40-35：65；
40～50min，A相：B相体积比为35：65-15：85；
50～60min，A相：B相体积比为15：85-2：98。
更优选地，步骤b)中，所述液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：负离子检测模式，Sensitivity模式(分辨率为25000-35000)；毛细管电压-3.0～-2.0kV；样品锥孔电压35-45V；源偏移电压75-85V；离子源温度为115-125℃；脱溶剂温度440-460℃；脱溶剂气流速750-850L/h；锥孔气45-55L/h；雾化气压力5.5-6.5bar；质量数校正范围m/z 50-1000；校正溶液为0.45-0.55mM甲酸钠溶液，流速15-25μL/min；实时校正lock spray为0.95-1.05ng/μL的亮氨酸脑啡肽溶液，m/z 554.2615；数据采集方法为fullscan；无能量范围；扫描时间为0.1-0.3s。
进一步优选地，所述质谱的测定条件为：
电离方式：负离子检测模式，Sensitivity模式(分辨率为30000)；毛细管电压-2.5kV；样品锥孔电压40V；源偏移电压80V；离子源温度为120℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流速800L/h；锥孔气50L/h；雾化气压力6.0bar；质量数校正范围m/z 50-1000；校正溶液为0.5mM甲酸钠溶液，流速20μL/min；实时校正lock spray为1ng/μL的亮氨酸脑啡肽溶液，m/z554.2615；数据采集方法为fullscan；无能量范围；扫描时间为0.2s。
更优选地，步骤b)中，所述外标法是指：移取步骤a)所述对照品溶液，分别稀释配成一系列不同浓度的溶液，采用液相色谱质谱联用仪进样分析，获得对照品溶液中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯含量与峰面积的线性关系，以银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到相应标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液稀释后采用液相色谱质谱联用仪进样分析，将获得的供试品溶液中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应成分的含量。
本发明中的用水均为纯净水。
优选地，步骤4)中，所述Kennard-Stone算法原理是指，把所有的样本都看作校正集候选样本，依次从中挑选样本进校正集，首先选择欧氏距离最远的两个样本进入校正集，其后通过计算剩下的每一个样品到校正集内每一个已知样品的欧式距离，找到拥有最大最小距离的待选样本放入校正集，以此类推，直到达到所要求的样本数目，剩余的样本就进入验证集。该方法的优点是能保证校正集集中的样本按照空间距离分布均匀。缺点是需要进行数据转换和计算样本两两空间距离，计算量大。所述验证集包含在校正集的浓度范围内，验证集作为独立的样本，仅用于模型验证。
优选地，步骤4)中，所述校正集与验证集的样本数量之比为7：3。所述校正集是作为建立模型的样本集，所述验证集用于模型的验证。
优选地，步骤6)中，所述相关系数(R)按公式(1)进行计算，
所述公式(1)为：
式中，
R为相关系数；i为校正集中第i个样本；n为校正集中样本总数；yi,实测值为校正集中第i个实测样本的测定值；yi,预测值为校正集中第i个预测样本的测定值；
为所有实测样本(第1到第i个实测样本)测定值的平均值。
优选地，步骤6)中，所述校正集误差均方根(RMSEC)按公式(2)进行计算，
所述公式(2)为：
式中，
RMSEC为校正集误差均方根；i为校正集中第i个样本；n为校正集中样本总数；yi,实测值为校正集中第i个实测样本的测定值；yi,预测值为校正集中第i个预测样本的测定值。
优选地，步骤6)中，所述性能偏差比(RPD)按公式(3)进行计算，
所述公式(3)为：
式中，
RPD为性能偏差比；RMSECV为交互验证误差均方根；i为校正集中第i个样本；n为校正集中样本总数；yi,实测值为校正集中第i个实测样本的测定值；yi,预测值为校正集中第i个预测样本的测定值。
优选地，步骤6)中，所述验证集误差均方根(RMSEP)按公式(4)进行计算，
所述公式(4)为：
式中，
RMSEP为验证集误差均方根；i为验证集中第i个样本；n为验证集中样本总数；yi,实测值为验证集中第i个实测样本的测定值；yi,预测值为验证集中第i个预测样本的测定值。
优选地，步骤6)中，所述预测相对偏差(RSEP)按公式(5)进行计算，
所述公式(5)为：
式中，
RSEP为预测相对偏差；i为验证集中第i个样本；n为验证集中样本总数；yi,实测值为验证集中第i个实测样本的测定值；yi,预测值为验证集中第i个预测样本的测定值。
优选地，步骤6)中，所述波段的选择原则为相关系数(R)数值最大且校正集误差均方根(RMSEC)数值最小的样本所在区间对应的波段。
优选地，步骤6)中，所述波段采用偏最小二乘法(PLS)进行选择，包括：将整个光谱等分成若干等宽的子区间，在每个子区间上进行PLS回归，找出R数值最大且RMSEC数值最小对应的区间作为所要选择的波段。
所述偏最小二乘法(PLS)为间隔偏最小二乘(iPLS)法。
优选地，步骤6)中，所述光谱预处理方法的选择原则为性能偏差比(RPD)数值最大且验证集误差均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)数值最小的样本对应的吸光度数据所采用的光谱预处理方法。
优选地，步骤6)中，所述相关系数(R)＞0.9且＜1，优选>0.95且＜1。
优选地，步骤6)中，所述验证集误差均方根(RMSEP)≤校正集误差均方根(RMSEC)的2倍。
优选地，步骤6)中，所述性能偏差比(RPD)＞2，优选＞3。
优选地，步骤6)中，所述预测相对偏差(RSEP)≤15％。
满足上述条件的制备，表明快速测定模型性能优异，且具有较高的准确性，可以满足实际应用。
其中，当R越接近1，表示模型的预测值与标准对照方法分析值之间的相关性越好；当RPD值越大，表明模型的性能越好，当模型RPD值＞3时，具有更高的预测精度；RMSEP的大小与样品化学值相关，当RMSEP值越小，表示模型预测结果越准确；RSEP表示验证集的预测值与真实值之间整体误差大小，当RSEP值越小，表明该模型的预测的准确度越高。上述各项参数不能单独作为参考，须综合各项参数来考察模型性能。
本发明第二方面提供一种快速测定模型，由上述方法建立。
本发明第三方面提供一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法，包括：将银杏叶提取物样品过层析柱洗脱，获得的洗脱液采用近红外光谱法(NIRs)进行测定，获得的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据代入上述快速测定模型中，获得洗脱液中总萜内酯的含量。
本发明第四方面提供一种电子设备，包括存储器和处理器；其中，所述存储器用于存储一条或多条计算机指令，其中，所述一条或多条计算机指令被所述处理器执行以实现上述银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法步骤。
本发明第五方面提供一种可读存储介质，其上存储有计算机指令，该计算机指令被处理器执行时实现上述银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法步骤。
本发明第六方面提供一种计算机程序产品，包括计算机指令，该计算机指令被处理器执行时实现上述银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法步骤。
如上所述，本发明提供的一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法，利用近红外光谱技术构建银杏酮酯生产工艺洗脱工段聚酰胺树脂柱层析洗脱过程中总萜类内酯含量的快速测定模型，其无需样本预处理、节省实验试剂、绿色环保、并且能够在1分钟内得到洗脱液样本的总萜内酯含量数据，实现整体洗脱工段总萜类内酯快速定量分析，为银杏酮酯洗脱过程提供快速、无损的检测方法，同时为洗脱终点的判定提供数据支持，实现生产过程质量控制，保证产品质量。
本发明提供的一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法，研究通过收集银杏酮酯工业生产的洗脱过程样品，利用LC-MS检测洗脱液中的总萜类内酯含量，结合NIRs技术建立聚酰胺树脂柱层析过程的快速测定模型，所建立的模型参数具有较高的性能和准确性，能够满足定量分析，可用于对银杏酮酯工业生产的洗脱过程的快速检测。本研究证明了通用模型在银杏内酯类成分洗脱过程定量分析的可行性，在后续的研究中可以通过模型传递将模型应用到近红外的在线设备上，同时在考察工厂产能的基础上确定洗脱终点的最佳范围，实现对洗脱过程的在线监控和自动化，最终实现中间品的快速放行和提升产品的均一性。
附图说明
图1显示为本发明中聚酰胺树脂柱层析洗脱样品的近红外光谱图。
图2显示为本发明中样本真实值与模型预测值的相关性的比较图。
图3显示为本发明中电子设备的结构框图。
图4显示为本发明中计算机系统的结构示意图。
附图标记
600 电子设备
601 存储器
602 处理器
700 计算机程序产品
701 处理单元
702 ROM
703 RAM
704 总线
705 I/O接口
706 输入部分
707 输出部分
708 存储部分
709 通信部分
710 驱动器
711 可拆卸介质
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指相对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
银杏叶提取物，来源于上海上药杏灵科技药业股份有限公司；洗脱液收集自上海上药杏灵提取车间的聚酰胺柱，批次批号分别为：201012、201022、201104、201105、201118、201119、201128；共124个样品。
银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯(纯度≥98％，诗丹德公司)；乙醇、二甲基亚砜、甲酸、甲醇(纯度98％，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。
2、仪器
MPA-II近红外光谱仪(德国布鲁克光谱仪器公司)；Waters Acquity UPLC/XevoG2-XS Q-TOF超高效液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司)；化学计量学软件OPUS7.8(德国布鲁克光谱仪器公司)、Unscrambler X 10.4(美国CAMO公司)、Oringin2018(美国OriginLab公司)。
实施例1
将银杏叶提取物样品过填充有聚酰胺的层析柱进行洗脱，获得洗脱液。洗脱液的取样程序为：从洗脱开始前十五分钟至洗脱开始时，每隔3min取样一次；从洗脱开始至洗脱进行60分钟时，每隔5min取样一次；从洗脱进行60分钟至洗脱结束时，每隔10min取样一次。
实施例2
将实施例1中获得的洗脱液作为供试品溶液，采用近红外光谱法(NIRs)进行测定，获得洗脱液中总萜内酯的吸光度数据。近红外光谱法(NIRs)的测定条件为：空白背景为空气；分辨率为8cm-1；图谱扫描次数为32次；样品扫描次数为2次；扫描光谱范围为4000～12000cm-1。近红外光谱法(NIRs)的测定样品池为2mm石英比色皿。近红外光谱数据为平均值。通过软件处理获得，具体见图1。
实施例3
将实施例1中获得的洗脱液洗脱液作为供试品溶液，采用液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)进行测定，获得洗脱液中总萜内酯的含量数据。同时，精密称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯对照品加入二甲基亚砜溶解并定容，配成浓度为1mg/mL的对照品溶液。然后，在采用液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)进行测定前，要加入50％的乙醇水溶液进行稀释。其中，供试品溶液分别用50％的乙醇各稀释500、250、50倍。
最后，采用液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)分别测定供试品溶液和步骤a)中的对照品溶液，通过保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过外标法定量，确定供试品溶液中待测成分的含量。
液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)中，液相色谱的测定条件为：色谱柱：WatersAcquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)；检测器：质谱；检测波长：无；柱温：45℃；流速：0.2ml/min；进样量：1μl；流动相：0.1％甲酸水溶液-甲醇，其中，A相为：0.1％甲酸水溶液，B相为：甲醇；分析时间为60min；梯度洗脱。
其中，梯度洗脱的具体程序为：
0～5min，A相：B相体积比为90：10-75：25；
5～17min，A相：B相体积比为75：25-75：25；
17～22min，A相：B相体积比为75：25-65：35；
22～35min，A相：B相体积比为65：35-60：40；
35～40min，A相：B相体积比为60：40-35：65；
40～50min，A相：B相体积比为35：65-15：85；
50～60min，A相：B相体积比为15：85-2：98。
液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)中，所述质谱的测定条件为：电离方式：负离子检测模式，Sensitivity模式(分辨率为30000)；毛细管电压-2.5kV；样品锥孔电压40V；源偏移电压80V；离子源温度为120℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流速800L/h；锥孔气50L/h；雾化气压力6.0bar；质量数校正范围m/z 50-1000；校正溶液为0.5mM甲酸钠溶液，流速20μL/min；实时校正lock spray为1ng/μL的亮氨酸脑啡肽溶液，m/z 554.2615；数据采集方法为fullscan；无能量范围；扫描时间为0.2s。
实施例4
对实施例3中的液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)进行方法学验证，其性能指标结果如下。
1、线性关系
根据实施例3中的液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)，精密吸取对照品溶液适量，并用50％乙醇稀释成系列质量浓度，各进样1μl测定，以溶液浓度为横坐标(Y),峰面积为纵坐标(X)进行回归，结果见表1。由表1可知，各成分在各自范围内线性关系良好。
表1.各成分的线性关系
2、精密度
根据实施例3中的液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)，精密吸取对照品溶液适量，重复进样六次，测得各成分的峰面积RSD值均小于3％，表明仪器精密度良好。
3、重复性
根据实施例3中的液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)，取洗脱液适量，平行制备供试品六份，分别进样，测得各成分的峰面积RSD值均小于3％，表明该方法重复性良好。
4、稳定性
根据实施例3中的液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)，取洗脱液适量，平行制备供试品六份，分别在0、3、6、9、12、24h进样，测得各成分的峰面积RSD值均小于3％，表明溶液在24h内稳定性良好。
5、加样回收率
根据实施例3中的液相色谱质谱联用法(UPLC-MS)，精密吸取已测定含量的洗脱液1ml，加入对照品溶液适量，平行制备供试品六份，分别进样，测定并计算各成分的回收率，测得银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯的回收率分别为99.90％、100.43％、101.47％、100.87％；RSD值均小于3％,表明方法准确性良好。
实施例5
将实施例2获得的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据，分别采用不同光谱预处理方法进行光谱预处理，获得各种光谱预处理后吸光度数据。不同光谱预处理方法分别为一阶导数法、二阶导数法、减去一条直线法、矢量归一化法(SNV)、多元散射校正法(MSC)。
将实施例3洗脱液中总萜内酯的含量数据作为实测样本按Kennard-Stone算法原理分别归类为校正集和验证集，校正集与验证集的样本数量之比为7：3，具体结果见表2。验证集包含在校正集的浓度范围内，验证集作为独立的样本，仅用于模型验证。
表2.样品划分结果
然后，将校正集中实测样本数据，与对应的各种光谱预处理后吸光度数据拟合出各种光谱预处理后样本-吸光度工作曲线，作为预测模型，再将校正集和验证集中实测样本对应的各种光谱预处理后吸光度数据代入预测模型中，获得校正集和验证集中预测样本数据。
将校正集中实测样本数据和预测样本数据分别计算相关系数(R)、校正集误差均方根(RMSEC)、性能偏差比(RPD)，将验证集中实测样本数据和预测样本数据分别计算验证集误差均方根(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)。相关系数(R)、校正集误差均方根(RMSEC)、性能偏差比(RPD)、验证集误差均方根(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)的计算公式分别参见公式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)。
接着，以相关系数(R)、校正集误差均方根(RMSEC)为指标选择波段，波段的选择原则为相关系数(R)数值最大且校正集误差均方根(RMSEC)数值最小的样本所在区间对应的波段。具体来说，波段采用偏最小二乘法(PLS)进行选择，包括：将整个光谱等分成若干等宽的子区间，在每个子区间上进行PLS回归，找出R数值最大且RMSEC数值最小对应的区间作为所要选择的波段。
例如，基于间隔偏最小二乘(iPLS)法，将整个光谱等分成10个等宽的子区间，在每个子区间上进行PLS回归，找出最小的RMSEC对应的区间，然后再以该区间为中心单向或双向进行消减或扩充波段变量，得到最佳子区间。为了避免有效信息变量流失，在最佳子区间的基础上再增加子区间，将不同波段的子区间任意组合，通过增加或去掉子区间来寻找到R最大且RMSEC最小的子区间组合作为最佳波段变量。波段筛选结果数据如表3所示。
表3.波段筛选结果
根据R、RMSEC参数选择的最佳波段，当模型的波段范围在：5772-6100、7500-8252cm-1时，所建立的模型有最大R值和最小的RMSEC值；筛选后的波段避开了5180、6900cm-1附近的“水峰”干扰，相比于全光谱波段提升了模型性能，说明波段筛选能够避免不同峰之间相互干扰的影响，可以有效排除近红外光谱中的冗余信息，提取关键相关变量。
之后，以性能偏差比(RPD)、验证集误差均方根(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)为指标选择光谱预处理方法。光谱预处理方法的选择原则为性能偏差比(RPD)数值最大且验证集误差均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)数值最小的样本对应的吸光度数据所采用的光谱预处理方法。考察结果见表4。
表4.光谱预处理方法考察结果
根据RPD、RMSEP、RSEP参数，模型2采用二阶导数进行预处理建模效果最好，其RPD、RMSEP、RSEP值分别为6.72、0.172、8.68％。经过光谱预处理的波段所建立模型的性能和准确度都得到一定的提升，表明适宜的光谱预处理可以有效的过滤近红外光谱中的噪声信息，提高模型的稳健性。
由上波段筛选和预处理方法考察，采用选择的光谱预处理方法对选择的波段范围内的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据进行光谱预处理后，根据光谱预处理后总萜内酯的吸光度数据与相应总萜内酯的含量数据拟合出总萜内酯的含量-吸光度工作曲线，建立快速测定模型。即通过PLS结合留一交互验证得到性能最佳、预测准确度最高的定量预测模型，如图2所示，模型2参数如表5所示，模型的R值均大于0.95，RPD值均大于3，RMSEC、RMSEP、RSEP均较小，表明建立的模型的性能优异，预测准确性高。
表5.各模型参数
将获得的模型2的验证集实测值和预测值进行T检验，其测定P值为0.943，表明各模型的验证集实测值和预测值之间无显著差异。模型2的R大于0.95，表明模型的相关性良好；模型的RPD值均大于3，RSEP值均小于15％，表明模型性能优异，且具有较高的准确性，可以满足实际应用。
在上述实施例中，如图3所示，本发明还公开了一种电子设备，所述电子设备600包括存储器601和处理器602，其中，存储器601用于存储一条或多条计算机指令，其中，所述一条或多条计算机指令被所述处理器602执行以实现根据本发明的实施例的方法。
在上述实施例中，如图4所示，本发明还公开了一种计算机系统，计算机系统包含的计算机程序产品700包括处理单元701，其可以根据存储在只读存储器(ROM)702中的程序或者从存储部分708加载到随机访问存储器(RAM)703中的程序而执行上述实施例中的各种处理。在RAM 703中，还存储有系统700操作所需的各种程序和数据。处理单元701、ROM 702以及RAM 703通过总线704彼此相连。输入/输出(I/O)接口705也连接至总线704。
以下部件连接至I/O接口705：包括键盘、鼠标等的输入部分706；包括诸如阴极射线管(CRT)、液晶显示器(LCD)等以及扬声器等的输出部分707；包括硬盘等的存储部分708；以及包括诸如LAN卡、调制解调器等的网络接口卡的通信部分709。通信部分709经由诸如因特网的网络执行通信处理。驱动器710也根据需要连接至I/O接口705。可拆卸介质711，诸如磁盘、光盘、磁光盘、半导体存储器等等，根据需要安装在驱动器710上，以便于从其上读出的计算机程序根据需要被安装入存储部分708。其中，所述处理单元701可实现为CPU、GPU、TPU、FPGA、NPU等处理单元。
特别地，根据本公开的实施例，上文描述的方法可以被实现为计算机软件程序。例如，本公开的实施例包括一种计算机程序产品，其包括计算机指令，该计算机指令被处理器执行时实现上文所述的方法步骤。在这样的实施例中，该计算机程序产品可以通过通信部分709从网络上被下载和安装，和/或从可拆卸介质711被安装。
附图中的流程图和框图，图示了按照本发明各种实施例的系统、方法和计算机程序产品的可能实现的体系架构、功能和操作。在这点上，流程图或框图中的每个方框可以代表一个模块、程序段或代码的一部分，所述模块、程序段或代码的一部分包含一个或多个用于实现规定的逻辑功能的可执行指令。也应当注意，在有些作为替换的实现中，方框中所标注的功能也可以以不同于附图中所标注的顺序发生。例如，两个接连地表示的方框实际上可以基本并行地执行，它们有时也可以按相反的顺序执行，这依所涉及的功能而定。也要注意的是，框图和/或流程图中的每个方框、以及框图和/或流程图中的方框的组合，可以用执行规定的功能或操作的专用的基于硬件的系统来实现，或者可以用专用硬件与计算机指令的组合来实现。
描述于本发明的实施例中所涉及到的单元或模块可以通过软件的方式实现，也可以通过可编程硬件的方式来实现。所描述的单元或模块也可以设置在处理器中，这些单元或模块的名称在某种情况下并不构成对该单元或模块本身的限定。
作为另一方面，本发明还提供了一种计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质可以是上述实施例中电子设备或计算机系统中所包含的计算机可读存储介质；也可以是单独存在，未装配入设备中的计算机可读存储介质。计算机可读存储介质存储有一个或者一个以上程序，所述程序被一个或者一个以上的处理器用来执行描述于本发明的方法。
综上所述，本发明提供的一种银杏叶提取物洗脱过程中总内酯含量的快速测定方法，具有较高的性能和准确性，能够满足定量分析，实现中间品的快速放行和提升产品的均一性。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法，包括以下步骤：
1)将银杏叶提取物样品过层析柱洗脱，获得洗脱液；
2)将步骤1)获得的洗脱液采用近红外光谱法进行测定，获得洗脱液中总萜内酯的吸光度数据，将吸光度数据分别采用不同光谱预处理方法进行光谱预处理，获得各种光谱预处理后吸光度数据；
3)将步骤1)获得的洗脱液采用液相色谱质谱联用法进行测定，获得洗脱液中总萜内酯的含量数据；
4)将步骤3)获得的洗脱液中总萜内酯的含量数据作为实测样本按Kennard-Stone算法原理分别归类为校正集和验证集；
5)将步骤4)获得的校正集中实测样本数据，与对应的各种光谱预处理后吸光度数据拟合出各种光谱预处理后样本-吸光度工作曲线，作为预测模型，再将校正集和验证集中实测样本对应的各种光谱预处理后吸光度数据代入预测模型中，获得校正集和验证集中预测样本数据；
6)将校正集中实测样本数据和预测样本数据分别计算R、RMSEC、RPD，将验证集中实测样本数据和预测样本数据分别计算RMSEP、RSEP，以相关系数R、RMSEC为指标选择波段，以RPD、RMSEP、RSEP为指标选择光谱预处理方法；
7)采用步骤6)选择的光谱预处理方法对步骤6)选择的波段范围内的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据进行光谱预处理后，根据光谱预处理后总萜内酯的吸光度数据与相应总萜内酯的含量数据拟合出总萜内酯的含量-吸光度工作曲线，建立快速测定模型。
2.根据权利要求1所述的一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法，其特征在于，步骤2)中，包括以下条件中任一项或多项：
A1)所述近红外光谱法的测定条件为：空白背景为空气；分辨率为5-10cm-1；图谱扫描次数为30-35次；样品扫描次数为2-4次；扫描时间25-35s；扫描光谱范围为4000～12000cm-1；
A2)所述光谱预处理方法选自导数法、减去一条直线法、矢量归一化法、多元散射校正法中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法，其特征在于，步骤3)中，所述液相色谱质谱联用法进行测定，还包括以下步骤：
a)对照品溶液的制备：将总萜内酯的对照品加入二甲基亚砜溶解并定容，配成对照品溶液，所述总萜内酯包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯；
b)测定：采用液相色谱质谱联用法分别测定供试品溶液和步骤a)中的对照品溶液，通过保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过外标法定量，确定供试品溶液中待测成分的含量。
4.根据权利要求3所述的一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用法中，
所述液相色谱的测定条件为：色谱柱：C18色谱柱；检测器：质谱；检测波长：无；柱温：40-50℃；流速：0.1-0.3ml/min；进样量：0.5-2μl；流动相：0.05-0.2％甲酸水溶液-甲醇，其中，A相为：0.05-0.2％甲酸水溶液，B相为：甲醇；分析时间为60min；梯度洗脱；
所述质谱的测定条件为：电离方式：负离子检测模式，Sensitivity模式，分辨率为25000-35000；毛细管电压-3.0～-2.0kV；样品锥孔电压35-45V；源偏移电压75-85V；离子源温度为115-125℃；脱溶剂温度440-460℃；脱溶剂气流速750-850L/h；锥孔气45-55L/h；雾化气压力5.5-6.5bar；质量数校正范围m/z 50-1000；校正溶液为0.45-0.55mM甲酸钠溶液，流速15-25μL/min；实时校正lock spray为0.95-1.05ng/μL的亮氨酸脑啡肽溶液，m/z554.2615；数据采集方法为fullscan；无能量范围；扫描时间为0.1-0.3s。
5.根据权利要求1所述的一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定模型的建立方法，其特征在于，步骤6)中，包括以下条件中任一项或多项：
B1)所述波段的选择原则为R数值最大且RMSEC数值最小的样本所在区间对应的波段；
B2)所述光谱预处理方法的选择原则为RPD数值最大且RMSEP和RSEP数值最小的样本对应的吸光度数据所采用的光谱预处理方法；
B3)所述R＞0.9且＜1；
B4)所述RMSEP≤RMSEC的2倍；
B5)所述RPD＞2；
B6)所述RSEP≤15％。
6.一种快速测定模型，由权利要求1-5任一所述方法建立。
7.一种银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法，包括：将银杏叶提取物样品过层析柱洗脱，获得的洗脱液采用近红外光谱法进行测定，获得的洗脱液中总萜内酯的吸光度数据代入权利要求6所述的快速测定模型中，获得洗脱液中总萜内酯的含量。
8.一种电子设备，包括存储器和处理器；其中，所述存储器用于存储一条或多条计算机指令，其中，所述一条或多条计算机指令被所述处理器执行以实现权利要求7所述的银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法步骤。
9.一种可读存储介质，其上存储有计算机指令，该计算机指令被处理器执行时实现权利要求7所述的银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法步骤。
10.一种计算机程序产品，包括计算机指令，该计算机指令被处理器执行时实现权利要求7所述的银杏叶提取物洗脱过程中总萜内酯含量的快速测定方法步骤。
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