CN105784635A - 罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，包括化学值的测定、原始光谱获取、光谱数据预处理、PLS定量校正模型的建立、定量校正模型的预测稳定性、罗布麻叶总黄酮含量的模型预测等步骤。与现有技术相比，本发明从根本上解决了现有罗布麻叶总黄酮检测方法存在的费时费力、运行和维护的成本较高等问题，利用近红外光谱仪建立PLS定量模型进行超快速检测，无需对样品进行预处理，方便快捷，对人体和环境没有任何副作用，检测结果相对偏差小，如果检测样品的化学测定值精度高，本发明的预测值则可以接近真实值。

Description

罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法

技术领域

本发明涉及保健食品检测的技术领域，尤其涉及一种罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法。

背景技术

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻的干燥叶，在新疆、敦煌、辽宁、安徽等地均有生长，是被广泛应用的中国传统中药之一。总黄酮是评价罗布麻叶品质的重要指标之一，因为黄酮类化合物是一类天然抗氧化剂，可以提高人体抗氧化能力，具有降低血脂、利尿、抗衰老等多种作用，罗布麻叶含有芦丁、金丝桃苷、三叶豆苷、山奈酚、黄芪豆苷等多种黄酮成分，新疆小花罗布麻中芦丁含量较高。测定罗布麻叶总黄酮含量，可以罗布麻叶资源的开发利用提供参考。

目前对罗布麻叶总黄酮的检测，主要参照《保健食品检测技术方法》所述简单的物理化学分析法检测，如高效液相色谱法(HPLC)、紫外分光光度法、以芦丁为对照品三氯化铝显色法等。上述方法都需要对罗布麻叶进行前置处理，即用有机溶剂如甲醇进行溶解和提取，前置处理时间最少也需要8小时，而且操作中的化学品对操作人员的身体有害、污染环境。不仅都属于有损检测，而且过程繁琐，费时费力、运行和维护的成本较高，不利于罗布麻叶总黄酮含量的快速检测。因此，有必要研究简单、快速、无损的鲜枣品质的鉴别方法，是本领域技术人员呃待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，无需对样品进行预处理，方便快捷，对人体和环境没有任何副作用，检测结果相对偏差小，如果检测样品的化学测定值精度高，本发明的预测值则可以接近真实值。

本发明中的罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，包括如下步骤：化学值的测定、原始光谱获取、光谱数据预处理、PLS定量校正模型的建立、罗布麻叶总黄酮含量的模型预测。

上述化学值的测定具体操作为：所述化学值的测定具体操作为：称取50～100份罗布麻叶粉碎过40～60目筛网，每一份精密称取0.5～1.5g，加乙醇定容至20～30ml摇匀后，超声提取15～25min，放置，吸取上清液0.5～1.5mL，于蒸发皿中，加0.5～1.5g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱，先用15～25mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至20～30mL，此液于波长320～400nm测定吸收值；同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量；

上述原始光谱获取的具体操作为：再称取50～100份罗布麻叶样品分别经粉碎，分别编号，采用近红外光谱仪的旋转漫反射采样系统，每次取4～6g样品粉末，以仪器内置背景为参比，用均匀旋转模式，采集样品近红外光谱，每个样品扫描至少两次，扫描参数设置:光谱集范围1000nm～2400nm，扫描次数30～60次,分辨率4～10cm，每3～5cm采集一个数据点，共采集1400～1600个数据，扫描温度在20℃～25℃，50～80批样品的近红外光谱叠加即可；

所述光谱数据预处理时采用近红外光谱仪进行，依次通过红外光谱数据平滑处理、红外光谱导数处理、多元散射校正(MSC)处理、数据均值中心化处理。用以消除光谱中各种噪声与背景等不确定因素干扰，以增强信息的有效性。

PLS定量校正模型的建立步骤是本发明专利的关键，决定检测数据的准确度。基于偏最小二乘法(PLS)回归法建立定量模型时，用校正集标准差(SEC)、验证集标准差(SEP)、以及校正集预测值与真实值相关系数(RC)等模型评价参数确定定量模型的波段，优选最佳的建模波段为1405～1795nm，1857～2020nm。

所述罗布麻叶总黄酮含量的模型预测步骤的具体操作为：将总黄酮含量未知的待测罗布麻叶粉放置于近红外光谱仪旋转采样池，扫描近红外光谱，然后调用已建好的罗布麻叶总黄酮PLS定量模型，利用该模型在30秒内即对未知罗布麻叶总黄酮指标作出预测。

在罗布麻叶总黄酮含量的模型预测步骤之前可以插入近红外定量模型的外部验证或/和定量校正模型的预测稳定性步骤。

所述近红外定量模型的外部验证时的具体操作为：选取总黄酮含量范围在2.15％～5.70％的40～100个样品为校正集的近红外光谱导入到建立的定量模型中，得到预测集所有样品中总黄酮的质量分数(预测值)，预测值与其实际测定值(紫外光谱法测定的值得的质量分数)对比结果及相关的误差进行统计，建立的模型外部验证结果的预测相对标准误差(SD)应小于0.25。

所述定量校正模型的预测稳定性步骤的具体操作为：从预测样品集中任意选取一份样品，在扫描校正集样品相同的光谱条件下，重复扫描8～15次，然后将扫描的光谱带入到定量模型中，得到样品扫描的光谱对应的预测结果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

第一、本发明不用对样品进行前置处理，大大缩短检测的时间和成本：建立好定量模型后，只对样品(罗布麻叶)进行简单的粉碎，过筛等物理处理即可，一个样品前处理大概需要10分钟，HPLC(高效液相色谱)法或紫外分光光度法都要求对样品进行处理，而且处理时间最快也需一天时间，一天按照8小时计算，一个样品的前处理需要640分钟。该法光前处理就比HPLC(高效液相色谱)法或紫外分光光度法快64倍。不用任何有机溶剂，只需对样品进行简单地粉碎，过筛等物理处理，对环境和检测人员无任何污染和伤害。

第二、本发明检测时速度超快，近红外光谱是间接地定量方法，罗布麻叶总黄酮近红外定量模型一旦建立起来，未知罗布麻叶粉样品只需扫描其红外光谱和调用定量模型就可以得到未知样品中总黄酮含量。检测一个样品的近红外光谱只需30秒时间；而HPLC(高效液相色谱)法或紫外分光光度法检测一个样品(标准曲线和样品的检测)最快需要一小时，也就是需要3600秒。

第三、选择最佳的罗布麻叶总黄酮检测方法、检测条件，如光谱波长的选择、近红外定量模型的外部校验等，使得本发明建立的定量模型具有较高的预测准确度和精度，以达到最准确的预测值。

说明书附图

图1本发明实施例1的罗布麻样品原始近红外光谱。

图2本发明实施例1的定量模型预测值与真实值相关图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1：

化学值的测定：按照《保健食品检验与评价技术规范》(2002年)中“保健食品中总黄酮的测定”方法进行。取64份罗布麻叶粉碎过40目筛网，每份精密称取1.00g，加乙醇定容至25mL,摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL。此液于波长360nm测定吸收值。同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。

并制作芦丁标准曲线，吸取芦丁标准溶液(：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。在140ug/mL～700ug/mL的浓度范围内线性关系良好。算得回归方程Y＝0.0011X+0.1006,R2＝0.9997，计算各样品总黄酮含量，数据备用。

原始光谱获取：罗布麻叶样品(干基)分别经粉碎，过40目标准筛，分别编号为1～64号。采用中国聚光科技有限公司SupNIR2700近红外光谱仪的旋转漫反射采样系统。每次取5.0g样品粉末，以仪器内置背景为参比，用均匀旋转模式，采集样品近红外光谱，每个样品扫描两次。扫描参数设置:光谱集范围1000nm～2400nm，扫描次数32次,分辨率8cm-1，每4cm采集一个数据点，共采集1500个数据。扫描温度为22℃。64批样品的近红外光谱叠加图如图1所示，横坐标为波长(nm),纵坐标为(A)，见图1。

校正集和验证集样本选择：将样品的化学值(总黄酮含量测定值)和采集的原始光谱一一对应，按照校正集样品均匀分布原则，将样品集分成校正集和验证集。选取总黄酮含量范围在2.15％～5.70％的51个样品为校正集，分别编号为LBM01～LBM51；总黄酮含量范围在2.14％～4.81％的，13个样品为验证集，分别编号为LBMYZ-01～LBMYZ-13。校正集和验证集样品中总黄酮含量分布见表1。

表1校正集和验证集中总黄酮含量的分布

光谱数据预处理：近红外光谱中含有随机噪声、基线漂移、样品不均匀、光散射等因素引起的干扰，运用合理的光谱预处理手段可消除各种噪声和干扰，提取近红外光谱的特征信息，提高校正模型的稳定性和预测精度。本发明依次采用红外光谱数据平滑处理、红外光谱导数处理、多元散射校正(MSC)处理、数据均值中心化等预处理方法，这些预处理方法的结合可以有效的优化模型，增强模型的有效性、提高模型的稳定性。

本发明利用近红外光谱仪自带的RIMP.P003.V01B.001软件，依次用Savitzky-Golay平滑，Savitzky-Golay导数，多元散射校正(MSC)，均值中心化等预处理方法，结合偏最小二乘回归分析建立定量分析校正模型。利用校正集预测值与测定值之间的相关系数RC，校正集标准差SEC，预测集标准差SEP等参数优劣，评价校正模型的预测性能，其中RC越接近1.0，模型的预测性能越好，当RC≥O.90时，模型具有较优的预测能力；校正集标准差SEC，预测集标准差SEP越接近零，且同时相互之间越接近，定量模型的预测效果越好。用5种不同预处理方法分别建立定量模型，考察预处理方法对定量模型优劣性影响结果见表2。图2为在最佳预处理方法下建立的定量模型的校正集预测值与测定值之间的相关性图，由图2可以看出，校正模型的预测值与测定值温和程度较高，说明所建立的校正模型预测性能较高。

表2不同预处理方法对校正模型的影响

由表2的数据可以看出，对样品的光谱不做任何预处理直接用PLS法建立的模型的预测性能远远低于任何一种预处理后建的模型的预测性能，说明预处理方法对定量模型的预测性能的影响较为显著地。在五中不同预处理模式中，第五种组合(Savitzky-Golay平滑+Savitzky-Golay导数+多元散射校正(MS)+均值中心化)模式下建立的定量模型稳健性明显优于其他预处理模式，因此将第五种预处理模式选定为最佳预处理模式。

PLS定量模型的建立及参数评价：采用近红外光谱仪自带的RIMP.P003.V01B.001软件，对罗布麻的近红外光谱进行预处理后，采用PLS(偏最小二乘回归)法，用启发式建模方式，建立了罗布麻叶总黄酮含量的PLS定量预测模型。化学分析值(总黄酮含量测定值)和近红外光谱定量模型预测值的相关关系见图2。可知，本模型的预测值与化学分析值存在线性关系。

近红外定量预测模型的评价参数主要有，校正集标准差(SEC)、验证集标准差(SEP)、K-fold交互检验验证集标准差(SECV)以及校正集预测值与真实值相关系数(RC)等，其中SEC、SEP、SECV越接近零，且同时相互之间越接近，定量模型的预测效果越好。当近红外模型相关系数RC≥O.9时，模型具有较优的预测能力，说明模型所得的预测值与真实值之间的相关性非常好。样品光谱和性质(总黄酮含量)之间存在线性关系。本发明建立的罗布麻叶中总黄酮含量预测模型的预测效果见表4(仪器本身直接给出的结果)。

表3PLS定量预测模型的预测效果评价结果

由表3中模型评价参数值可见，建立的总黄酮含量定量预测模型的预测效果较好，用此校正定量模型预测罗布麻叶中总黄酮含量具有可行性。

罗布麻总黄酮近红外定量校正模型预测SEP为0.135,能够满足罗布麻叶中总黄酮定量分析误差要求,。这进一步说明建立的定量校正模型可以应用于新疆罗布麻叶中总黄酮的快速定量分析中。

近红外定量模型的外部验证：采用预测集(LBMYC01～LBMYC13)13个样品，利用相同的方法进行光谱预处理后，调用相应的PLS回归定量模型预测其总黄酮含量，并与化学测量值比较，统计结果见表4

表4模型对验证集样品中总黄酮含量的预测结果

定量校正模型的预测稳定性：为了验证校正定量模型稳定性，从预测样品集中选取LBMYC86样品，在扫描校正集样品相同的光谱扫描条件下，重复扫描十次，然后调用建好的校正模型，分别对LBMYC86样品十次扫描的光谱进行预测，结果见表5。标准偏差为0.10，各数据RSD为3.62％，符合检测要求。

表5定量预测模型稳定性检验结果

实施例2：

化学值的测定：100份罗布麻叶粉碎过60目筛网，精密称取1.00g，加乙醇定容至25mL,摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL，此液于波长380nm测定吸收值；同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。

原始光谱获取：100份罗布麻叶样品分别经粉碎，过40目标准筛，分别编号为1～100号，采用近红外光谱仪的旋转漫反射采样系统。每次取5.0g样品粉末，以仪器内置背景为参比，用均匀旋转模式，采集样品近红外光谱，每个样品扫描两次，扫描参数设置:光谱集范围1500nm～2000nm，扫描次数32次,分辨率8cm-1，每4cm采集一个数据点，共采集1500个数据，扫描温度在25℃，64批样品的近红外光谱叠加图即可。

光谱数据预处理：采用近红外光谱仪进行，依次通过红外光谱数据平滑处理、红外光谱导数处理、多元散射校正(MSC)处理、数据均值中心化处理。用以消除光谱中各种噪声与背景等不确定因素干扰，以增强信息的有效性。

PLS定量校正模型的建立：基于偏最小二乘法(PLS)回归法建立定量模型时，用校正集标准差(SEC)、验证集标准差(SEP)、以及校正集预测值与真实值相关系数(RC)等模型评价参数确定定量模型的波长，申请人经过大量实验选择建模波段为1405～1795nm。以RC,SEC,SEP,SECV等参数，考察不同波段对校正模型预测性能的影响，优选最佳的建模波段，通过实验优选的最佳建模波段为1405～1795nm，1857～2020nm，不同波段对定量模型预测性能的影响见表6。

表6不同波段对定量模型的影响

近红外定量模型的外部验证：选取总黄酮含量范围在2.15％～5.70％的80个样品为校正集的近红外光谱导入到建立的定量模型中，得到预测集所有样品中总黄酮的质量分数(预测值)，预测值与其实际测定值(紫外光谱法测定的值得的质量分数)对比结果及相关的误差进行统计，建立的模型外部验证结果的预测相对标准误差(SD)小于0.20。

定量校正模型的预测稳定性：从预测样品集中任意选取一份样品，在扫描校正集样品相同的光谱条件下，重复扫描12次，然后将扫描的光谱带入到定量模型中，得到样品扫描的光谱对应的预测结果。

罗布麻叶总黄酮含量的模型预测：将总黄酮含量未知的待测罗布麻叶粉放置于近红外光谱仪旋转采样池，扫描近红外光谱，然后调用已建好的罗布麻叶总黄酮PLS定量模型，利用该模型在30秒内即对未知罗布麻叶总黄酮指标作出预测。

实施例3：

化学值的测定：取77份罗布麻叶粉碎过40目筛网，每一份精密称取1.00g，加乙醇定容至25mL,摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL，此液于波长340nm测定吸收值；同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。

原始光谱获取：取77份罗布麻叶样品分别经粉碎，过40目标准筛，分别编号为1～77号，采用近红外光谱仪的旋转漫反射采样系统。每次取5.0g样品粉末，以仪器内置背景为参比，用均匀旋转模式，采集样品近红外光谱，每个样品扫描两次，扫描参数设置:光谱集范围1000nm～2400nm，扫描次数32次,分辨率8cm-1，每4cm采集一个数据点，共采集1500个数据，扫描温度在20℃～25℃，64批样品的近红外光谱叠加图即可。

光谱数据预处理:采用近红外光谱仪进行，依次通过红外光谱数据平滑处理、红外光谱导数处理、多元散射校正(MSC)处理、数据均值中心化处理。用以消除光谱中各种噪声与背景等不确定因素干扰，以增强信息的有效性。

PLS定量校正模型的建立；基于偏最小二乘法(PLS)回归法建立定量模型时，用校正集标准差(SEC)、验证集标准差(SEP)、以及校正集预测值与真实值相关系数(RC)等模型评价参数确定定量模型的波长，优选最佳的建模波段为1857～2020nm。

罗布麻叶总黄酮含量的模型预测：将总黄酮含量未知的待测罗布麻叶粉放置于近红外光谱仪旋转采样池，扫描近红外光谱，然后调用已建好的罗布麻叶总黄酮PLS定量模型，利用该模型在30秒内即对未知罗布麻叶总黄酮指标作出预测。

Claims (4)

1.一种罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：化学值的测定、原始光谱获取、光谱数据预处理、PLS定量校正模型的建立、罗布麻叶总黄酮含量的模型预测；

所述化学值的测定具体操作为：称取50～100份罗布麻叶粉碎过40～60目筛网，每一份精密称取0.5～1.5g，加乙醇定容至20～30ml摇匀后，超声提取15～25min，放置，吸取上清液0.5～1.5mL，于蒸发皿中，加0.5～1.5g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱，先用15～25mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至20～30mL，此液于波长320～400nm测定吸收值；同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量；

所述原始光谱获取的具体操作为：再称取50～100份罗布麻叶样品分别经粉碎，分别编号，采用近红外光谱仪的旋转漫反射采样系统，每次取4～6g样品粉末，以仪器内置背景为参比，用均匀旋转模式，采集样品近红外光谱，每个样品扫描至少两次，扫描参数设置:光谱集范围1000nm～2400nm，扫描次数30～40次,分辨率6～10cm，每3～5cm采集一个数据点，共采集1400～1600个数据，扫描温度在20℃～25℃，50～80批样品的近红外光谱叠加；

所述光谱数据预处理时采用近红外光谱仪工作站如预处理软件进行，对采集的红外光谱依次进行平滑、一节导数、多元散射校正、数据均值中心化等处理；

所述PLS定量校正模型的建立步骤是基于偏最小二乘法回归法建立定量模型时，用校正集标准差、验证集标准差、以及校正集预测值与真实值相关系数确定定量模型预测性的优劣，所述建模波段为1405～1795nm，1857～2020nm；

所述罗布麻叶总黄酮含量的模型预测步骤的具体操作为：将总黄酮含量未知的待测罗布麻叶粉放置于近红外光谱仪旋转采样池上，扫描其近红外光谱，然后调用已建好的罗布麻叶总黄酮PLS定量模型，利用该模型对未知罗布麻叶总黄酮指标作出预测。

2.如权利要求1任一项所述的罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，其特征在于，在罗布麻叶总黄酮含量的模型预测步骤之前插入近红外定量模型的外部验证或/和定量校正模型的预测稳定性步骤。

3.如权利要求2所述的罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，其特征在于，所述近红外定量模型的外部验证时的具体操作为：选取总黄酮含量范围在2.15%～5.70%的40～100个样品为校正集的近红外光谱导入到建立的定量模型中，得到预测集所有样品中总黄酮的质量分数。

4.如权利要求2或3所述的罗布麻叶总黄酮近红外超快速检测方法，其特征在于，所述定量校正模型的预测稳定性步骤的具体操作为：从预测样品集中任意选取一份样品，在扫描校正集样品相同的光谱条件下，重复扫描8～15次，然后将扫描的光谱带入到定量模型中，得到样品扫描的光谱对应的预测结果。