CN102175648A - 近红外光谱鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量的方法 - Google Patents
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Abstract
近红外光谱鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量的方法,包括如下步骤:①收集贝母样品;②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,取谱图中4000~5000cm-1波段进行预处理,并对经预处理后的近红外光谱谱图进行聚类分析,建立定性模型;或者取谱图中4000~7000cm-1波段内经预处理后得到的吸光度,与溴麝香草酚蓝比色法测得的该样品的生物碱含量相关联,采用偏最小二乘法、主成分回归法和多元线性回归法中的一种或几种方法建立生物碱检测的定量校正模型;③采集待测样品近红外光谱谱图,进行相应的预处理后使用所建立的定性模型或定量模型鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量。本发明方法快速、无损伤、环境友好、成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于光学应用领域,尤其是一种近红外光谱快速鉴别不同品种贝母及检测其总生物碱含量的方法。
背景技术
各种贝母成分相近,利用贝母特有的化学成分来区别不同品种的贝母有相当的难度。中国药典中5种贝母则缺少理化鉴别项(中国药典二部,化学工业出版社,2005)。已有许多报道采用性状鉴别法、紫外光谱法、薄层色谱法、DNA芯片技术、质谱法、蒸发光散色法、衍生化法等对贝母进行定性与生物碱定量,一些出版物利用形态学和组织学以及分子生物学方法来鉴定贝母的物种类别(贝母类药材的性状鉴别,药材,2002,25(5):321-324),这已被报告过。然而,由于缺乏足够的特征去表示不同贝母鳞茎,形态组织学鉴定方法不能进行明确鉴定。关于分子生物学方法,其成功的关键在于所加工材料的DNA质量(DNA芯片技术用于贝母的基因分型和种类鉴别,药学学报,2003,38(3):185-190)。此外,上述两项方法未能解决鉴定在外观或纹理上已损坏的贝母草药。最近,通过二维相关红外光谱鉴定淀粉,虽然这一技术进行许多优点,包括速度快,简易性和可以用不完整样本,其应用可能仍然有限,因为贝母淀粉通常认为是无效的和废弃的成分。
其中贝母甾体生物碱是贝母起药理作用的成分。传统的测定方法如紫外法(无紫外吸收的贝母总生物碱定量分析方法研究李萍,曾令杰,李松林中国药学志,2002,37(8).)、两相滴定法(酸性染料两相滴定法测定浙贝母总生物碱的含量.中国现代应用药学杂志,1998,15(3).)、高效液相色谱法(HPLC法测定市售贝母中贝母乙素素含量.中草药.2001,32(1):24~25)。样品处理过程及操作复杂,难以实现快速检测。
发明内容
为了克服不同品种贝母定性的不明确性及高效液相色谱法测定其生物碱含量的操作繁杂,本发明提供一种近红外光谱快速鉴别贝母品种及检测其总生物碱含量的方法。
本发明的目的之一是提供一种近红外光谱鉴别贝母品种的方法,包括如下步骤:
①收集贝母样品;本发明中所建立的贝母样品库包括炉贝母、松贝母、青贝母、大浙贝母、小浙贝母、伊贝母和平贝母,其中浙贝母包括大贝和珠贝。
②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,取谱图中4000~5000cm-1波段进行预处理,并对经预处理后的近红外光谱谱图进行聚类分析,建立定性模型;
其中,谱图预处理的方法选自下列方法中的一种或几种:一阶导数法、二阶导数法、矢量归一法、直线差减法、多元散射校正或最小-最大归一法,优选使用一阶导数法;建立定性模型的方法选自下列方法中的一种或几种:第一范围标定法、标准算法、因子法、一阶导数法或二阶导数法,优选第一范围标定法;
③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,采用与步骤②相同的预处理方法,处理所得谱图中4000~5000cm-1波段,并根据步骤②所建立的模型判断待测贝母样品的品种。
上述本发明的方法中,可以采用现有技术中的多种方式采集近红外光谱,发明人优选使用应用BRUKER公司的傅立叶变换近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱,其采样装置为积分球漫反射测样器件。
本发明的另一目的是提供一种近红外光谱检测贝母总生物碱含量的方法,包括如下步骤:
①收集贝母样品,溴麝香草酚蓝比色法测定样品中生物碱含量;
②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,取谱图中4000~7000cm-1波段内经预处理后得到的吸光度,与溴麝香草酚蓝比色法测得的该样品的生物碱含量相关联,采用偏最小二乘法、主成分回归法和多元线性回归法中的一种或几种方法建立校正模型;优选使用偏最小二乘法;
③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,采用与步骤②相同的预处理方法处理所得谱图中4000~7000cm-1波段,将预处理后得到的吸光度值代入步骤②的校正模型,得到待测贝母样品中生物碱含量。
本发明所述的该方法中,测定样品近红外漫反射光谱的扫描范围是3700~12000cm-1。谱图预处理方法选自下列方法中的一种或几种:矢量归一化法、内标法法、多元散射校正法、一阶导数法和最小-最大归一化法。优选采用一阶导数法。
下面对本发明的内容作详细描述。本发明分为两部分:不同种类贝母的品种鉴别(即定性鉴别)和总生物碱含量测定。
一、对7种贝母的定性鉴别,包括2个步骤:定性模型的建立和定性模型的验证。
(一)建立定性模型
1.样品
浙贝母(大贝)Fritillaria thunbergii Miq、伊贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk、平贝母Fritillaria ussuriensis Maxim、青贝母Fritillaria unibraacteate Hsiao et.K.C.Hsia、松贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、炉贝母Fritillaria delavayi Franch、浙贝母(珠贝)Fritillaria thunbergii Miq。共7种贝母。
2.样品的预处理
7种贝母药材经60℃烘干12h,瓷制研钵研粉碎30min,过100目筛,7种贝母样品各得到约6克粉末。
3.贝母近红外光谱的采集
取7种贝母适量,放入样品瓶中,以金箔为参比,积分球漫反射,扫描范围3700~12000cm-1,分辨率4cm-1。每个样品重复5次,取中间3次入库并求其平均光谱。谱图如图1所示。
4.数据处理
本发明采用德国Bruker公司的OPUS软件进行数据处理。对7种贝母的谱图进行聚类分析,并建立定性模型。
5.聚类分析
(1)聚类分析方法选择
为了得到最适宜的定性方法,首先对7种不同品种的贝母做聚类分析测试,经过经验方法,取光谱信息丰富、强度相对较大的3800~7400cm-1的谱段进行聚类分析,通过实验结果比较,聚类参数选择一阶导数(First derivative)为光谱预处理方法,以第一范围标定(scaling to 1st range)为算法,平滑点数(smoothing points)设为13,以公式计算不同种类贝母近红外光谱的平均距离。
(2)聚类分析结果
聚类分析图(图2)中纵行高度为马氏距离,数值差别越大,表示不同类别贝母的光谱平均距离越大,表示分的越开。同为川贝的3种松贝、青贝、炉贝先聚为一类;平贝母、大浙贝母聚为一类,再与伊贝母聚为一类,最后与小浙贝母聚为一类。在发明的光谱实验和聚类分析参数条件下,可以将7种贝母光谱分开。
6.光谱预处理方法的选择
不同种贝母药材的近红外光谱原谱很相似。截取光谱信息相对最丰富、强度相对较大的区段4000~9000cm-1,这种近红外光谱普遍存在的谱带重叠、解析较难等问题还是比较突出,必须应用光谱预处理方法进行处理后才能扩大谱图之间的差异,提取谱图变化的信息,并将其定性区分。
首先对7种贝母的谱图进行预处理,通过预处理使谱图之间的差别得以扩大,提取更有效的光谱信息,提高信噪比,本文采用一阶导数法(first derivative)。
7.光谱算法的选择
参照聚类分析方法结果,以第一范围标定法(scaling to 1st range)为定性分析算法,平滑点数为13,选取优化后的波段:4000~5000cm-1对谱图进行分析。
8.阈值的设定
DT=Dmax+x SDev.其中DT为阈值,Dmax为最大匹配值(光谱距离最大值)、x为统计学参数,SDev为标准偏差。求阈值时第一范围标定法的x参数值射为4。对该方法的建立结果如表1。
9.选择性参数S判定模型科学性
以上定性方法的选择性系数S如表1
表1第一范围标定法处理结果
S是平均光谱之间距离D(马氏距离)与阈值T1(DT1)与T2(DT2)之和的比率。其结果如下:
S<1:类之间交叉
S=1:类之间有接触
S>1:类是分开的
报告中的S值均大于2,可以很好的区分开7种样品贝母。
(二)定性模型验证
在验证样品集中取七种贝母样品,进行近红外定性分析,结果都被鉴定成功,误判率为0。说明此定性模型可以对七种贝母粉末进行定性分析。其中匹配值(测试光谱与参考光谱之间的光谱距离)小于相应的阈值,而且所有其它物质的匹配值都大于相应的阈值,被成功鉴定。其他6种贝母也被成功鉴定。鉴定结果如图3所示:图面中所示纵坐标为RMSECV(交叉检验的均方根误差)它越小越好。横坐标的数值为维数,当维数到8以后RMSECV值几乎不再改变,因此8为确定的维数。
二、贝母总生物碱定量分析
本技术方案分为3个步骤:对照值的测定、定量模型的建立、定量模型的验证。
(一)紫外光谱法测定7种贝母样品中总生物碱含量作为对照值
1.标准品
贝母素乙(Peiminine),规格:20mg,批号:110751-200607;西贝母碱(Sipeimine),规格:20mg,批号:110767-200504。两种标准品均购于北京药检所。
2.样品
浙贝母(大贝)Fritillaria thunbergii Miq、伊贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk、平贝母Fritillaria ussuriensis Maxim、青贝母Fritillaria unibraacteate Hsiao et.K.C.Hsia、松贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、炉贝母Fritillaria delavayi Franch、浙贝母(珠贝)Fritillaria thunbergii Miq。共7种贝母。
3.生物碱有色离子对的形成
贝母碱在pH 5缓冲溶液条件下,与染料溴麝香草酚蓝形成黄色离子对,能定量地被氯仿提出。
4.最大吸收波长的选择
分别精密吸取贝母素乙和西贝碱标准溶液3ml,按标准曲线项下操作,离子对的氯仿溶液在40UV/VIS型紫外分光光度计上于200~500nm波长范围进行扫描,结果表明,最大吸收波长为410nm,故选作测定波长。
5.准确性评估
按上法在显色后不同时间测定吸收度,结果表明:在显色70min内离子对稳定。
6.制备两种标准品的标准曲线
配置两种贝母生物碱标准品溶液,并与溴麝香草酚溶液定量反应,在410nm处测量吸光度,得出紫外吸收值,制备出两种标准品的线性回归方程。
7.样品生物碱含量的测定
首先对样品生物碱进行提取,然后与溴麝香草酚蓝进行定量染色,最后用应用紫外光谱测定样品生物碱的含量。
[上述生物碱的提取方法参考文献中的方法:中药贝母类的研究X V.21种贝母总生物碱含量测定.中国药科大学学报,1990,21(5):319和无紫外吸收的贝母总生物碱定量分析方法研究李萍,中国药学杂志,2002,37(8)。
(二)贝母总生物碱定量模型的建立
7种贝母的近红外漫反射光谱选自定性分析部分所建的光谱库,以PLS法对贝母总生物碱含量建模,在适宜的光谱预处理基础上,运用偏最小二乘法(PLS)建立NIR光谱多元校正模型。以交叉验证误差均方根(RMSECV)为指标,运用交叉验证确定最佳PLS主成分数。见公式1~2。
本发明中应用近红外OPUS软件提供的交叉检验方法对模型进行检验,并对其进行优化后得到建模的最佳频率范围、最佳主成分数和模型交叉检验所得结果。当RMSECV值最小时,频率范围及主因子数最佳。
OPUS软件提供了交叉检验和外部检验两种方法进行模型检验,本发明采用内部交叉检验,并对其进行优化后显示的是建模的最佳频率范围、最佳主成分数和模型交叉检验所得结果。
用PLS模型对样品进行含量预测,得到相应的预测值,与紫外光谱法测定值比较。通过比较得出PLS模型的预测结果是准确的。
(三)定量模型分析验证
在验证集中取7种贝母粉末,扫描图谱,并用已经建立好的定量模型来分析图谱。
本发明采用近红外光谱技术,对7种不同品种的贝母进行定性鉴别和其总生物碱含量测定具有以下积极效果:
1.很多物质在近红外波段吸收系数低,这使采集样品光谱变得简单,因为样品成分无需稀释,可直接采集光谱数据,这使中药材在生产实时监控变为可行。
2.近红外光谱区内光的散射效应大,并且光的穿透能力较强,这近红外漫反射技术对于固体样品特别是中药材的光谱数据的采集变得快速、方便、有意义。
3.在数据采集和数据分析时,不破坏样品,不使用溶剂,对环境无污染。
4.仪器运行速度快,自动化程度高,降低操作者实验技能要求,大大节省时间及成本。
5.同一批样品谱图即用于不同样品的定性分析,又可以得到精确度高的定量分析结果,工作连续性强。
6.实验核心在于定性和定量模型的建立,对于鉴别、测定环节整个过程可以在很短时间内完成,即一旦模型建立完善,可在工业化生产及质量监控环节快速应用。
本发明应用近红外光谱技术,通过聚类分析建模实现对贝母品种的鉴别,通过最小二乘法(PLS)建模实现对贝母生物碱含量的测定,快速、无损伤、环境友好、成本低廉。与传统的方法相比较,本发明方法更加科学、快速、有效,并可应用于在线生产及质量监控,对近红外光谱技术在中药材领域应用的扩大提供了重要的科学依据。
附图说明
本发明附图5幅,其中:
图1是7种贝母的近红外漫反射光谱图;
图2是7种贝母的聚类分析结果,其中:Ping:平贝母,D-zhe为大浙贝母,Yibeimu为伊贝母,X-zhe为小浙贝母,L为炉贝母,S为松贝母,Q为青贝母,其中数字表示样品编号,纵坐标为马氏距离;
图3最佳主成分数(维数)的确定;
图4为训练集样品的预测值与真值相关图;
图5为模型化学值与预测值的误差相关图。
具体实施方式
下面将结合实施例详细描述本发明,该实施例不应解释为对本发明的限制
实施例1
三种产地贝母的定性鉴别。仪器选用BRUER公司的傅立叶变换近红外光谱仪,型号为MPA,选取浙江的大浙贝母,川贝中炉贝母,东北的平贝母过筛粉末适量,置测量杯中,以金箔为参比,积分球漫反射,扫描次数32次,扫描范围3700~12000cm-1,分辨率4cm-1。每个样品重复5次,取中间3次求平均光谱采用一阶导数法(first derivative)做为光谱预处理方法,以第一范围标定法(scaling to 1st range)为算法,平滑点数取13,选取波段3980.6~8983.4cm-1,参数x为10,建立模型,所建模型的选择性系数S>2,即模型科学性高。用验证集的样品谱图通过所建模型鉴定,结果得到预测样品产地归属与真实产地归属相同的鉴定报告,即三种贝母被成功定性鉴别。
实施例2
大浙贝母和小浙贝母的定性鉴别。仪器选用BRUER公司的傅立叶变换近红外光谱仪,型号为MPA,选取大浙贝母,小浙贝母过筛粉末适量,置测量杯中,以金箔为参比,积分球漫反射,扫描次数32次,扫描范围3700~12000cm-1,分辨率4cm-1。每个样品重复5次,取中间3次求平均光谱采用一阶导数法(first derivative)做为光谱预处理方法,以第一范围标定法(scaling to 1st range)为算法,平滑点数取13,选取波段3980.6~8983.4cm-1,参数x为10,建立模型所建模型的选择性系数S>2,即模型科学性高。用验证集的样品谱图通过所建模型鉴定,得出样品为大浙贝母的鉴定报告,与真实种类相一致。
实施例3
川贝母中炉贝母和松贝母和青贝母的定性鉴别。仪器选用BRUER公司的傅立叶变换近红外光谱仪,型号为MPA,选取炉贝母和松贝母和青贝母过筛粉末适量,置测量杯中,以金箔为参比,积分球漫反射,扫描次数32次,扫描范围3700~12000cm-1,分辨率4cm-1。每个样品重复5次,取中间3次求平均光谱采用一阶导数法(first derivative)做为光谱预处理方法,以第一范围标定法(scaling to 1strange)为算法,平滑点数取13,选取波段3996.1~8983.4cm-1,参数x为10,建立模型。用验证集的样品谱图通过所建模型鉴定,得出样品为松贝母的鉴定报告,与真实种类相一致。
实施例4
7种贝母(大浙贝母、伊贝母、平贝母、青贝母、松贝母、炉贝母、小浙贝母)总生物碱定量分析。仪器选用BRUER公司的傅立叶变换近红外光谱仪,型号为MPA。
首先测定7种贝母样品中总生物碱含量作为对照值,标准品为贝母素乙,规格:20mg,批号:110751-200607;西贝母碱,规格:20mg,批号:110767-200504。两种标准品均购于北京药检所。贝母碱在pH 5缓冲溶液条件下,与染料溴麝香草酚蓝形成黄色离子对,能定量地被氯仿提出。配置两种贝母生物碱标准品溶液,并与溴麝香草酚溶液定量反应,在410nm处测量吸光度,得出紫外吸收值,制备出两种标准品的线性回归方程。再对样品生物碱进行提取,然后与溴麝香草酚蓝进行定量染色,最后用应用紫外光谱测定样品生物碱的含量。
7种贝母总生物碱定量模型的建立
7种贝母的近红外漫反射光谱选自定性分析所建的光谱库,以PLS法对贝母总生物碱含量建模,光谱预处理方法选用一阶导数法,运用偏最小二乘法(PLS)建立NIR光谱多元校正模型。以交叉验证误差均方根(RMSECV)为指标,运用交叉验证确定最佳PLS主成分数。当RMSECV值最小时,频率范围及主因子数最佳。实验采用内部交叉检验,并对其进行优化后显示的是建模的最佳频率范围、最佳主成分数和模型交叉检验所得结果。结果如下:
PLS法光谱预处理方法:一阶导数法
最佳频率范围:4165.8~6082.8
最佳主成分数:8
R2为99.35%、RMSECV为0.00339。
用PLS模型对样品进行含量预测,得到相应的预测值,与紫外光谱法测定值比较,见表2。如此可见,PLS模型的预测结果是准确的。分析结果见表2及图4和图5。
表2PLS法交叉检验建模对预示集的预测结果
定量模型分析验证
在验证集中取7种贝母粉末,扫描图谱,并用已经建立好的定量模型来分析图谱,用于验证定量模型的准确性,结果如下表3所示。
表3定量模型对验证集的验证结果
Claims (9)
1.近红外光谱鉴别贝母品种的方法,包括如下步骤:
①收集贝母样品;
②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,取谱图中4000~5000cm-1波段进行预处理,并对经预处理后的近红外光谱谱图进行聚类分析,建立定性模型;
其中,谱图预处理的方法选自下列方法中的一种或几种:一阶导数法、二阶导数法、矢量归一法、直线差减法、多元散射校正或最小-最大归一法;建立定性模型的方法选自下列方法中的一种或几种:第一范围标定法、标准算法、因子法、一阶导数法或二阶导数法;
③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,采用与步骤②相同的预处理方法处理所得谱图中4000~5000cm-1波段,并根据步骤②所建立的模型判断待测贝母样品的品种。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于步骤①的贝母样品包括炉贝母、松贝母、青贝母、大浙贝母、小浙贝母、伊贝母和平贝母。
3.权利要求1或2所述的方法,其特征在于所述谱图的预处理的方法是一阶导数法,建立定性模型的方法是第一范围标定法。
4.权利要求1所述的方法,其特征在于所述贝母样品的近红外漫反射光谱采集方式是:应用BRUKER公司的傅立叶变换近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱,其采样装置为积分球漫反射测样器件。
5.近红外光谱检测贝母总生物碱含量的方法,包括如下步骤:
①收集贝母样品,溴麝香草酚蓝比色法测定样品中生物碱含量;
②测定贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,取谱图中4000~7000cm-1波段内经预处理后得到的吸光度,与溴麝香草酚蓝比色法测得的该样品的生物碱含量相关联,采用偏最小二乘法、主成分回归法和多元线性回归法中的一种或几种方法建立校正模型;
③测定待测贝母样品的近红外漫反射光谱谱图,采用与步骤②相同的预处理方法处理所得谱图中4000~7000cm-1波段,将预处理后得到的吸光度值代入步骤②的校正模型,得到待测贝母样品中生物碱含量。
6.权利要求5所述的方法,其特征在于所述贝母样品的近红外漫反射光谱采集方式是:应用BRUKER公司的傅立叶变换近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱,其采样装置为积分球漫反射测样器件。
7.权利要求5所述的方法,其特征在于所述谱图的预处理方法选自下列方法中的一种或几种:矢量归一化法、内标法法、多元散射校正法、一阶导数法和最小-最大归一化法。
8.权利要求7所述的方法,其特征在于所述谱图的预处理方法是一阶导数法。
9.权利要求5所述的方法,其特征在于步骤②建立校正模型的方法是偏最小二乘法。
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