CN104596976A - 近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质含量的方法，属于造纸法再造烟叶技术领域。该方法主要通过以下步骤实现：（1）样品的收集；（2）测定样品参考值；（3）采集原始光谱；（4）校正样品集和验证样品集的选择；（5）光谱预处理；（6）建立PLS模型；（7）模型验证。通过近红外技术建立了测定再造烟叶产品的蛋白质含量的PLS模型，具有检测速度快、精确度高、重现性好等优点，对开展卷烟产品降焦减害，提高抽吸品质等研究具有重要的辅助作用。

Description

近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法

技术领域

本发明属于造纸法再造烟叶领域，具体涉及近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法。

背景技术

造纸法再造烟叶是卷烟生产中的重要原料，在烟丝中添加适量的再造烟叶，不仅能改善卷烟的物理性能和化学成分，提高卷烟的吸食安全性，还能充分利用烟草资源，降低成本。目前造纸法再造烟叶存在刺激性大、木质气重等问题，影响其在卷烟产品中的添加量和使用效果。蛋白质是再造烟叶的重要组成部分，其对于烟叶的吸味品质有不利的影响，燃吸时烟叶中的蛋白质会使烟气苦味增加并有烧羽毛的气味，因此准确、迅速测定烟草中的蛋白质含量对评价再造烟叶质量有着重要意义。

目前，再造烟叶中蛋白质含量的测定主要是克达尔法或改良的凯氏定氮法，这些方法操作繁琐、费时。近年来，国内烟草检测部门引进了烟草化学自动分析仪，采用连续流动分析方法测定烟草总氮，虽然简化了操作，但存在通过测定样品总氮换算蛋白质含量时不能消除可溶性氮的影响问题，而先进的蛋白质测定仪价格昂贵且需专门的试剂，目前尚难普及。鉴于此，有必要开发一种新的快速的测定蛋白质含量方法，为分析评价再造烟叶的蛋白质含量提供一定的参考。

近红外光照射到物质后，会发生吸收、透射、全反射、漫反射等几种相互作用形式。近红外光谱的采集方式主要有三种：透射式、漫反射式和透漫射式。

对于光通透性较好的液体样品，近红外光可以穿透整个样品，多采用透射方式进行光谱扫描，所测得数据较为准确。近红外光不能完全穿透造纸法再造烟叶，故采用漫反射方式进行光谱扫描。近红外漫反射光进入样品内部后，发生无数次反射、折射、衍射、吸收后，返回入射面的光，这种分析光负载了样品的结构和组成信息，是一项快速、对环境友好的检测技术，目前应用近红外漫反射光谱分析技术测定烟草常规化学成分、风格、均匀性等方面已有报道，但用于造纸法再造烟叶蛋白质含量测定的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、易行、快速测定再造烟叶蛋白质的方法。本发明采用近红外光谱无损检测技术不仅提高分析效率，节约成本，对于准确测定再造烟叶蛋白质，提高检测效率，客观反应产品质量，具有明显实用性。对于稳定控制造纸法再造烟叶产品内在品质，发挥造纸法再造烟叶稳定卷烟产品质量和塑造卷烟风格具有明显的有益效果。

本发明采用的技术方案如下：

近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，包括如下步骤：

步骤（1），样品的的收集：收集准备一批具有代表性的造纸法再造烟叶产品；

步骤（2），测定样品参考值：利用标准方法对步骤（1）收集的造纸法再造烟叶产品逐个进行蛋白质的测定，得到样品参考值；

步骤（3），采集原始光谱：采用近红外光谱漫反射的方式对步骤（1）收集的造纸法再造烟叶产品逐个进行光谱扫描，得到原始光谱；所述的光谱采集条件为：扫描范围：4000cm^-1~10000cm^-1；分辨率：8cm^-1；扫描次数不低于72次；

步骤（4），校正样品集和验证样品集的选择：在步骤（3）所得原始光谱中采用标准GB/T 29858-2013的方法选出校正样品集和验证样品集；

步骤（5），光谱预处理：对步骤（4）校正样品集和验证样品集中的光谱进行预处理，消除噪声和基线漂移的影响；

步骤（6），建立PLS模型：将步骤（5）处理后的校正样品集与步骤（2）所得样品参考值进行一一对应，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应的蛋白质测定数据进行拟合，建立定量模型，过程中进行检测及剔除异常值，对剔除异常值剩余的光谱数值，再次与所得样品参考值进行一一对应，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应的蛋白质测定数据进行拟合，建立得到蛋白质指标的定量模型；

步骤（7），模型验证：利用步骤（5）处理后的验证样品集对步骤（6）所建立的蛋白质指标的定量模型进行外部预测。

所述步骤（2）的样品参考值测定是利用标准方法对所收集的样品逐个进行蛋白质的测定，得到参考值。所述标准方法是烟草行业标准YC/T 166-2003《烟草和烟草制品 总蛋白质含量的测定》；

进一步，所述步骤（3）的原始光谱是通过下列方法获得的：取步骤（1）收集到的造纸法再造烟叶产品，每个产品粉碎成粉末并混合均匀后，放入样品杯中，轻压平整，样品厚度≥10mm，利用近红外光谱技术采用漫反射的方式进行扫描并采集光谱，依次对每个再造烟叶产品采用相同的方法进行扫描并采集光谱，得到每个产品对应的原始光谱。

进一步，优选的是步骤（3）中每个再造烟叶产品的原始光谱是通过3次平行实验得到的光谱进行平均得到的。

进一步，优选的是步骤（5）所述预处理是指对原始光谱进行矢量归一化、二阶导数和Norris Derivative 滤波预处理。

进一步，优选的是Norris Derivative 滤波为Norris（3，5），即对原始光谱进行SNV+二阶+Norris（3，5）预处理。

上述技术方案中所述步骤（6）中检测及剔除异常值是采用检测杠杆值的方法，具体通过下列步骤：

按下列公式计算样品杠杆值：

其中，H _i 为样品杠杆值，t _i 为样品i的因子向量，T ^T T为建模集的因子得分矩阵，为t _i 的转置；

当样品杠杆值大于3k/n，其中k为主成分数，n为样品个数，其光谱对回归具有显著的影响，应剔除。

进一步，所述步骤（7）的模型验证是采用t检验方法确定验证样品集输入步骤（6）的定量模型所得的预测值与相应的步骤（2）测得的样品参考值是否有统计意义上的偏差：即，将步骤（6）所建立的蛋白质指标的定量模型的预测值与步骤（2）的样品参考值t值与自由度d_v-1的临界值t_(a,dv-1)进行比较，取显著水平a=0.05，当｜t｜＜t_(a,dv-1)，概率P>0.05时，说明两种方法的检测结果不存在显著性差异，模型验证成功，该模型可用于测定造纸法再造烟叶的蛋白质。

测定蛋白质：将待测造纸法再造烟叶样品的原始光谱输入步骤（6）建立的蛋白质指标的定量模型，即测定得到蛋白质。

PLS模型是主成分回归校正方法（PCR）的发展。在主成分回归分析中，通过一定的主因子数对光谱矩阵进行分解，以达到数据降维消除无用信息（噪声）的目的。而在PLS回归分析中，除了对光谱矩阵进行分解外，同时也对浓度矩阵进行分解降维，并引入相互间的信息。其原理如下：

（1）矩阵分解的模型为：

A_m×p=T_m×kP_k×p+E_A

C_m×n=U_m×kQ_k×n+E_C

其中，A为光谱矩阵；C为浓度或性质矩阵；T为光谱矩阵的得分矩阵；U为浓度矩阵的得分矩阵；P为光谱矩阵的载荷矩阵-主成分矩阵；Q为浓度矩阵的载荷矩阵-主成分矩阵；E_A为应用PLS进行回归分析时引入的光谱误差矩阵；E_C为应用PLS进行回归分析时引入的浓度误差矩阵；m为样本数；p为波长数；k为主成分数。

（2）得分矩阵T、U的回归分析，求出相关系数矩阵B

U_m×k=T_m×fB_k×k

（3）在预测分析时，按A_m×p=T_m×kP_k×p+E_A由样品的光谱矩阵A未知和分解得到的载荷矩阵P，求出样品的得分矩阵T_未知，在根据C_未知=T_未知BQ求出未知样品的浓度。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法对于稳定控制造纸法再造烟叶产品内在品质，发挥造纸法再造烟叶稳定卷烟产品质量和塑造卷烟风格具有明显的有益效果本发明收集产品后无需损坏样品且不用进行磨样等前处理。

a.分析速度快：测量一个样品3min内完成，通过建立的蛋白质模型可迅速测定再造烟叶产品的蛋白质，并初步判断样品质量的波动情况；

b.属非破坏性分析技术：近红外光谱测量过程中不损伤样品，从外观到内部都不会对样品产生影响；

c.分析成本低、无污染：在样品分析过程中不消耗样品本身，不用任何化学试剂，成本降低，且对环境不造成任何污染；

d.测试重现性好：光谱测定受人为因素干扰较小，测定具有稳定性；

e.便于实现在线分析：近红外光谱在光纤中具有良好的传输特性，便可实现在线分析及远程监控。

本发明方法简单，易行，快速，采用近红外光谱无损检测技术不仅能提高分析效率，节约成本，对于准确测定再造烟叶蛋白质，提高检测效率，客观反应产品质量，具有明显实用性。本发明方法具有检测速度快，无污染，绿色环保，准确度高、重现性好等优点，适用于再造烟叶产品蛋白质的实现现场分析、快速检测及其产品质量波动的在线监测。

附图说明

图1为步骤（6）所建立蛋白质指标的定量模型的数据拟合图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

利用近红外漫反射光谱测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，包括如下步骤：

步骤（1），样品的的收集：收集具有代表性的造纸法再造烟叶样品250-300个；

步骤（2），测定样品参考值：利用标准方法（烟草行业标准YC/T 166-2003《烟草和烟草制品 总蛋白质含量的测定》；）对步骤（1）收集的造纸法再造烟叶产品逐个进行蛋白质的测定，得到样品参考值；

步骤（3），采集原始光谱：取步骤（1）收集到的造纸法再造烟叶产品，每个产品粉碎成粉末并混合均匀后，放入样品杯中，轻压平整，样品厚度≥10mm，每个产品取3个平行样，利用近红外光谱技术采用漫反射的方式进行扫描并采集光谱，每个平行样扫一次光谱，每个产品对应3个平行光谱，再将3个平行光谱平均得到一个原始光谱，依次对每个再造烟叶产品采用相同的方法进行扫描并采集光谱，得到每个产品对应的原始光谱；所述的光谱采集条件为：扫描范围：4000cm^-1~10000cm^-1；分辨率：8cm^-1；扫描次数不低于72次；

步骤（4），选择校正样品集和验证样品集：在步骤（3）所得原始光谱中采用标准GB/T 29858-2013 方法选出校正样品集和验证样品集；

步骤（5），光谱预处理：对步骤（4）校正样品集和验证样品集中的光谱进行矢量归一化、二阶导数和Norris Derivative 滤波预处理，Norris Derivative 滤波为Norris（3，5），消除噪声和基线漂移的影响；

步骤（6），建立PLS模型：选择全光谱范围内对校正集样品进行PLS 回归并全交叉验证，当模型的主成分数达到8，模型的均方根交叉验证误差RMSECV最小，选择模型的最适宜的主成分数为8。

将步骤（5）处理后的校正样品集与步骤（2）所得样品参考值进行一一对应，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应的蛋白质测定数据进行统计拟合，建立定量模型，过程中进行检测及剔除异常值，

按下列公式计算样品杠杆值：

H _i 为样品杠杆值，t _i 为样品i的因子向量，T ^T T为建模集的因子得分矩阵，为t _i 的转置。

当样品杠杆值大于3k/n，其中k为主成分数，n为样品个数，其光谱对回归具有显著的影响，应剔除；通过计算得到所有步骤（3）中校正样品集和验证样品集的光谱杠杆值都小于3k/n，没有异常样品需剔除；

对剔除异常值剩余的光谱数值，再次与所得样品参考值进行一一对应，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应的蛋白质测定数据进行拟合，建立得到蛋白质指标的定量模型（见图1），定量模型的相关系数为0.9588，RMSECV为 0.0987，可见光谱数据与样品的指标定量之间具有显著的线性关系，说明样品的近红外光谱包含有与指标定量密切相关的信息；

步骤（7），模型验证：利用步骤（5）处理后的验证样品集中的50个产品对步骤（6）所建立的蛋白质指标的定量模型进行外部预测，按下列公式计算均方根预测误差RMSEP：

 

其中，D_if_i=x_i-y_i为第i个样品近红外测定值x_i与作为分析基准的该样品参比值y_i之差。利用公式计算得到均方根预测误差RMSEP为0.1061，利用PLS建立的模型具有较高的预测准确度和预测稳定性。表1为PLS模型预测集预测结果。采用t检验方法确定验证样品集输入步骤（6）的定量模型所得的预测值与相应的步骤4测得的样品参考值是否有统计意义上的偏差：即，将步骤（6）所建立的蛋白质指标的定量模型的预测值与步骤（2）的样品参考值t值与自由度d_v-1的临界值t_(a,dv-1)进行比较，取显著水平a=0.05。该实施例中通过所建立的定量的校正模型预测验证样品结果与标准测定方法进行配对t检验，t值根据95%置信区间查出，t_0.05,49=2.009，PLS所建定量模型预测结果与标准参考方法测定值｜t｜＜t_0.05,49，P＞0.05，两种方法的检测结果不存在显著性差异，用PLS所建定量校正模型预测的结果是可靠的。

表1 PLS模型预测集预测结果

测定蛋白质：将待测造纸法再造烟叶样品10个的原始光谱输入步骤（6）建立的蛋白质指标的定量模型，即测定得到蛋白质；每个样品预测5次，同时应用步骤（2）的标准方法对样品蛋白质进行测定，其测定结果如下表2所示，由表2可看出在生产实践中应用近红外漫反射光谱对再造烟叶产品定量检测是完全可行的。

表2实际样品测定结果

利用此模型可快速、准确的测定再造烟叶成品的蛋白质，对实现现场分析、监测再造烟叶产品质量稳定性及质量的波动情况，具有重要意义。

另外，步骤（4）的预处理之所以采用SNV+二阶+Norris（3，5）预处理，是通过不同光谱预处理下校正样品集的PLS模型结果，如表3，表3为不同光谱预处理下校正集的PLS模型结果；从表1其中可以看出，不同光谱预处理方法对PLS建模结果有不同的影响，SNV+二阶+Norris（3，5）效果较好。

表3不同光谱预处理下PLS模型结果

注：k为主成分数，RMSECV为均方根交叉验证误差，RMSEC为均方根校正误差，MSC为多元散射校正，SNV为矢量归一化，Norris（a,b）为Norris Derivative 滤波，a是段长，b是段间距，Savitzky-Golay（a,b）为多项式平滑方法，a是平滑的数据点数，b是多项式次方数；一阶为一阶导数；二阶为二阶导数。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定 。

Claims (7)

1.近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），样品的的收集：收集准备一批具有代表性的造纸法再造烟叶产品；

步骤（2），测定样品参考值：利用标准方法对步骤（1）收集的造纸法再造烟叶产品逐个进行蛋白质的测定，得到样品参考值；

步骤（3），采集原始光谱：采用近红外光谱漫反射的方式对步骤（1）收集的造纸法再造烟叶产品逐个进行光谱扫描，得到原始光谱；所述的光谱采集条件为：扫描范围：4000cm^-1~10000cm^-1；分辨率：8cm^-1；扫描次数不低于72次；

步骤（4），校正样品集和验证样品集的选择：在步骤（3）所得原始光谱中采用标准GB/T 29858-2013的方法选出校正样品集和验证样品集；

步骤（5），光谱预处理：对步骤（4）校正样品集和验证样品集中的光谱进行预处理，消除噪声和基线漂移的影响；

步骤（6），建立PLS模型：将步骤（5）处理后的校正样品集与步骤（2）所得样品参考值进行一一对应，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应的蛋白质测定数据进行拟合，建立定量模型，过程中进行检测及剔除异常值，对剔除异常值剩余的光谱数值，再次与所得样品参考值进行一一对应，应用偏最小二乘法把光谱数据与其对应的蛋白质测定数据进行拟合，建立得到蛋白质指标的定量模型； 

步骤（7），模型验证：利用步骤（5）处理后的验证样品集对步骤（6）所建立的蛋白质指标的定量模型进行外部预测。

2.根据权利要求1所述的近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤（3）的原始光谱是通过下列方法获得的：取步骤（1）收集到的造纸法再造烟叶产品，每个产品粉碎成粉末并混合均匀后，放入样品杯中，轻压平整，样品厚度≥10mm，利用近红外光谱技术采用漫反射的方式进行扫描并采集光谱，依次对每个再造烟叶产品采用相同的方法进行扫描并采集光谱，得到每个产品对应的原始光谱。

3.根据权利要求2所述的近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于，步骤（3）中每个再造烟叶产品的原始光谱是通过3次平行实验得到的光谱进行平均得到的。

4.根据权利要求1所述的近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于，步骤（5）所述预处理是指对原始光谱进行矢量归一化、二阶导数和Norris Derivative 滤波预处理。

5.根据权利要求1所述的近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于，Norris Derivative 滤波为Norris（3，5）。

6.根据权利要求1所述的近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于，所述步骤（6）中检测及剔除异常值是采用检测杠杆值的方法，具体通过下列步骤：

按下列公式计算样品杠杆值：

其中，H _i 为样品杠杆值，t _i 为样品i的因子向量，T ^T T为建模集的因子得分矩阵，为t _i 的转置；

当样品杠杆值大于3k/n，其中k为主成分数，n为样品个数，其光谱对回归具有显著的影响，应剔除。

7.根据权利要求1所述的近红外漫反射光谱技术测定造纸法再造烟叶蛋白质的方法，其特征在于：所述步骤（7）的模型验证是采用t检验方法确定验证样品集输入步骤（6）的定量模型所得的预测值与相应的步骤（2）测得的样品参考值是否有统计意义上的偏差：即，将步骤（6）所建立的蛋白质指标的定量模型的预测值与步骤（2）的样品参考值t值与自由度d_v-1的临界值t_(a,dv-1)进行比较，取显著水平a=0.05，当｜t｜＜t_(a,dv-1)，概率P>0.05时，说明两种方法的检测结果不存在显著性差异，模型验证成功，该模型可用于测定造纸法再造烟叶的蛋白质。