CN104062257B - 一种基于近红外光谱测定溶液中总黄酮含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于近红外光谱测定复方阿胶浆中总黄酮含量的方法，属于中医药研究领域。本发明通过实验室浓缩稀释配制不同浓度样本，与复方阿胶浆成品样本共同组成样本集，采集样本集的近红外光谱图，进行异常样本剔除和样本集的划分，选择合适的光谱波段、数据预处理方法得到溶液样本特征光谱信息，以亚硝酸钠‑硝酸铝比色法测得总黄酮含量为参照值，应用化学计量学技术，构建样本近红外光谱与其总黄酮含量之间关系的定量校正模型，采集待测复方阿胶浆成品的近红外光谱，利用构建的定量校正模型快速计算其总黄酮含量。本发明方法有利于提高复方阿胶浆成品的质量控制水平，保证成品质量稳定、可靠。

Description

一种基于近红外光谱测定溶液中总黄酮含量的方法

技术领域

本发明涉及一种基于近红外光谱测定溶液中总黄酮含量的方法，具体涉及一种基于近红外光谱测定复方阿胶浆中总黄酮含量的方法，属于中医药研究技术领域。

背景技术

药品成品检验是药品在进入市场前必经的最后一道质量控制程序，直接关系到消费者的用药安全。目前中药药品的检测方法多为色谱法，这类方法需要在分析前经过复杂的样品预处理，分析时间也较长，而且传统测定方法一次只能测定一个指标，延长了批生产过程的总耗时。

复方阿胶浆是东阿阿胶股份有限公司独家生产的中药保护品种，它是根据明代医家张介宾《景岳全书》中的两仪膏（熟地黄、人参），加阿胶、党参等中药制成，主要用于气血两虚引起的头晕目眩、心悸失眠、食欲不振、贫血、白细胞减少症及放化疗的增效减毒。

2010版《中国药典》中对于复方阿胶浆的含量测定仅有总氮量一项，不足以反映复方阿胶浆成品中有效成分的整体状况，难以满足对复方阿胶浆成品进行含量分析与监控的要求。因此，迫切需要建立复方阿胶浆成品中指标成分含量的简捷快速测定方法，以满足生产企业对成品指标含量进行快速测定的需求。

近红外光谱（Near Infrared Spectroscopy,NIRS）是可见光与中红外光谱之间波长范围为780至2500nm的光谱区。该光谱区主要是含氢基团(C-H、N-H、O-H)的倍频与合频吸收，通过扫描样品的近红外光谱，可以得到样品中有机分子含氢基团的特征信息。近红外光谱用于中药质量分析能从整体上反映其化学组成信息，具有样品无需或仅需极少的预处理、操作简便、不消耗化学试剂以及可实现在线过程控制等优势。该技术需要与化学计量学结合，其中常用的化学计量学技术主要有多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘回归等。近年来，近红外光谱已被广泛应用于中药领域，在定性和定量测定中都显示了巨大的潜力。

但由于中成药成分复杂，有效成分含量偏低且其近红外光谱中吸收重叠现象严重等问题，有关中药成方制剂的近红外光谱研究报导尚较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于近红外光谱测定溶液中总黄酮含量的方法，具体涉及一种基于近红外光谱测定复方阿胶浆中总黄酮含量的方法，一方面为复方阿胶浆成品的快速定量分析提供了一种新的测定方法，减轻成品检验的工作量，缩短批生产过程的总耗时；另一方面也可适当提高抽检比例，以增强成品检验结果的可靠性。

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

一种基于近红外光谱测定溶液中总黄酮含量的方法，所述的方法包括以下步骤：

1.样本的收集：实验室浓缩稀释配制不同浓度样本，与复方阿胶浆成品样本共同组成样本集以增加样本集的代表性；

2.样本集中各样本总黄酮含量的测定：以亚硝酸钠-硝酸铝比色法测得样本中总黄酮的含量，具体操作步骤如下：

（1）对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

（2）标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0、1、2、3、4、5mL至25mL容量瓶中，加水补足5mL，精密加入质量分数为5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，再精密加入质量分数为10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠溶液10mL，摇匀，加水至刻线，摇匀，放置15分钟，在500nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（3）供试品溶液的测定：取0.4mL复方阿胶浆成品样品（或0.2mL实验室配制样品），与对照品相同方法测定，另取等量的样品加10mL氢氧化钠溶液并定容至25mL作为试样空白。

3.近红外光谱数据采集：使用近红外光谱仪采集样本近红外光谱；

优选的，采用透反射模式采集样本溶液的近红外光谱图；

优选的，近红外光谱仪以仪器内置背景为参比，分辨率为4cm^-1，扫描次数为128次，光谱采集波数范围为4000-10000cm^-1；

更优选的，所述的光谱波数范围为4429-4900cm^-1、6469-7377cm^-1、7377-8000cm^-1、4429-8000cm^-1任一波段或其组合波段。

4.校正模型的建立：使用多元校正方法构建校正集样本总黄酮含量与近红外特征光谱之间的定量校正模型，用于待测样本中总黄酮含量的预测。

应用化学计量学技术，建立总黄酮含量的定量校正模型。在建立校正模型之前，首先需要鉴别并剔除异常样本并对样本集进行划分，以获得代表性强的校正集样本和验证集样本，其中，用于建立模型的样本为校正集样本，用于模型验证和评价的样本为校正集样本。本发明采用Chauvenet检验法和杠杆值与学生化残差值相结合的方法进行异常样本的剔除，兼顾了化学值和光谱数据的异常，有助于提高模型的预测效果。

Chauvenet检验法首先计算所有样品光谱的平均光谱，然后计算每个样品光谱与平均光谱之间的马氏距离，将距离值从小到大的顺序排列，根据Chauvenet判别准则判定距离值最大的样品光谱是否为异常，若是则继续判别距离值第二大的样品光谱是否为异常，以此类推，直至某一样品光谱被判定为正常。本发明中软件根据准则自动判断光谱是否为异常。Chauvenet判别准则公式如下：

$|x_1-\stackrel{\‾}{x}|>Z_c\mathrm{\σ}$

式中，为所有样品马氏距离的平均值,Z_c为一个与样品个数有关的常数,可查表得,σ为均方差。

杠杆值的计算公式为：

$h_i=\frac{1}{h}+t_i^T{\left(T^{T}T\right)}^{-1}{t}_i$

式中，h_i为杠杆值，n为样品数，t_i为第i个预测样本的回归因子向量,T为校正样本的回归因子得分矩阵。

学生残差r_i的计算公式为：

$r_i=\frac{f_i}{\sqrt{\mathrm{RMSE}(1-h_i)}}$

式中，f_i为第i个样品的残差值，RMSE为校正集均方根偏差。

在建模过程中，杠杆值衡量的是一个校正集样品对模型的影响程度，学生残差值则表示预测能力的好坏。通常含量值处于校正集均值处的样品，其杠杆值较小，若某个样品的杠杆值较大，则可能是光谱扫描或者其他分析方法在测定时引入误差；若一个样品的学生残差值较高，那么说明校正集模型对此样品的预测能力较差。当一个样本的杠杆值或学生残差值比较高时，则将该样本暂列为异常样本。

如何挑选具有代表性的样本建立模型是近红外分析技术的关键问题之一。有代表性的校正集样本不但可以减少建模的工作量，而且直接影响所建模型的适用性和准确性。常用的样本集划分的方法有随机抽样（Random Sampling,RS）法、含量梯度法、Kennard-Stone（KS）法、Duplex法和Sample set Partitioning based on jointx-y distance（SPXY）法等，不同的划分方法的特点如下：

（1）随机抽样法：即随机选取一定数量的样本组成校正集。校正集组成方法简单，不需要进行数据挑选，但每次组成校正集的样本可能差异很大，不能保证所选样本代表性以及模型的外推能力。

（2）含量梯度法：是一种常规选择方法，是将样品集中按某个组分的含量值顺序（由大到小或反之）排列，然后从中按序抽取样品组成校正集或是验证集。这种方法简单直观，但是校正集样品的代表性差。

（3）KS法：是把所有的样本都看作校正集候选样本，依次从中挑选部分样本进入校正集。首先，选择欧氏距离最远的两个样本向量对进入校正集。定义dij为从第i个样本向量到j样本向量的欧氏距离，假设已有k(k<n)个样本向量被选进训练集，针对第v个待选样本向量，定义最小距离：D_kv=min(d_1v,d_2v,…,d_kv)。拥有D_kv最大值的那个待选样本进入训练集。如此循环，直至达到预先设定的样本数。该法在一定程度上避免了校正集样品分布的不均匀，缺点是需要进行数据转换和计算样本两两空间距离，计算量较大。

（4）Duplex法：此算法是在KS法的设计试验方法上发展而来的。Duplex法要指定预测样本集合的样本数。该法与KS法同样都是通过光谱差异来挑选校正集样本，都没有考虑浓度矩阵y，所以上述两种方法不能保证所选择的样本都能够按照空间距离分布均匀。

（5）SPXY法：此算法同样是在KS法的基础上发展而来，实验证明SPXY法能够有效地用于近红外定量模型的建立。SPXY法的逐步选择的过程和KS法相似：Kennard-Stone法是把所有的样本都看作校正集候选样本，首先选择欧氏距离最远的两个向量对进入校正集，在后续迭代过程中拥有最小距离中最大值的待选样本被选入校正集，以此类推，直至达到预设样本数，该法缺点是在计算时只考虑X变量（光谱数据）；而SPXY法则是在样本间距离计算时将X变量（光谱数据）和y变量（化学值）同时考虑在内，首先分别计算样本p和q在X和Y空间内的距离,其公式如下：

$d_x(p,q)=\sqrt{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\&Sigma;}}}{[x_p\left(j\right)-x_q\left(j\right)]}^2};p,q\&Element;[1,N]$

$d_y(p,q)=\sqrt{{(y_p-y_q)}^2};p,q\&Element;[1,N]$

式中，d_x(p,q)和d_y(p,q)分别为样本p和q在X和Y空间内的距离，j为变量。

为保证样本在X空间和y空间具有相同的权重，分别除以它们在数据集中的最大值，其公式如下:

$d_{\mathrm{xy}}(p,q)=\frac{d_x(p,q)}{\max d_x(p,q)}+\frac{d_y(p,q)}{\max d_y(p,q)};p,q\&Element;[1,N]$

SPXY法优点在于能够有效地覆盖多维向量空间，从而改善所建模型的预测能力。

确定校正集和验证集样本后对其光谱进行波段选择和预处理，得到样本的特征光谱信息。通过对光谱波段进行筛选，可以避免引入过多冗余信息，改善模型性能。采取不同预处理方法对光谱进行预处理可以去掉高频噪音对信号的干扰，消除散射效应的影响及光谱中平直的基线漂移。选择合适的建模波段和预处理方法后，采用偏最小二乘回归法建立近红外数据与总黄酮含量之间的定量校正模型，并通过各模型评价指标考察模型性能。

优选的，所述模型的优化性能评价指标为：以相关系数r、校正集均方根偏差RMSEC及交叉验证均方根偏差RMSECV为指标优化建模参数；模型对待测样本的预测能力用验证集相关系数r和验证集均方根偏差RMSEP来考核。

5.待测样本中总黄酮含量的测定：

取待测的复方阿胶浆成品，按照与校正集样本相同的光谱采集参数采集近红外光谱，将特征光谱输入校正模型，便可快速计算得到未知样品中总黄酮含量值。

上述校正模型在实际应用时可以在校正集和验证集中加入新的样本，扩充模型的适用范围，对模型进行不断的更新与完善，操作步骤同前。

本发明将近红外光谱技术引入中药成方制剂的质控中，以复方阿胶浆为例，采用近红外光谱结合化学计量学方法实现对复方阿胶浆中总黄酮含量的快速测定。与传统的检测方法相比，大大缩短测定时间，不需要大量的反应试剂，节省了大量的人力和物力。本发明有利于提高复方阿胶浆的质量控制水平，保证成品质量稳定、可靠，可在中药制剂的成品检验环节中推广应用。

本发明通过实验室配制不同浓度的复方阿胶浆样本，与成品样本共同组成样本集，扫描得到样本集的近红外光谱图，首先进行异常样品剔除和样本集的划分，然后选择合适的光谱波段、预处理方法得到复方阿胶浆特征光谱信息，以亚硝酸钠-硝酸铝比色法测得的样本总黄酮含量为参照值，建立复方阿胶浆近红外特征光谱与其总黄酮含量之间的定量校正模型。将未知总黄酮含量的复方阿胶浆成品按同样的方法采集其近红外光谱，利用所构建的校正模型即可快速计算得到其总黄酮含量。

附图说明

附图1为复方阿胶浆近红外光谱图；

附图2为异常样本剔除中的Chauvenet检验结果图；

附图3为异常样本剔除中的杠杆值与学生化残差分布图；

附图4为复方阿胶浆中总黄酮偏最小二乘回归模型的预测值与参比值的相关关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

材料：复方阿胶浆药材提取液由山东东阿阿胶股份有限公司提供；

仪器:傅立叶变换近红外光谱仪由美国Thermo Fisher公司生产。

实施例1：

1.样本的收集：

将60批复方阿胶浆成品样本等分为两份。其中30批成品直接进行含量测定；剩余30批成品随机分组合并,每5批成品合并为1份，共得到6份样本，每份样本体积为100mL。将这6份样本在70℃下减压浓缩至体积减少为50mL，再用超纯水进行逐级稀释，每次加入15mL超纯水，第1份和第3份加9次水，共获得18份样本；其余4份分别加10次水，共获得40份样本，6份浓缩液按上述操作共获得58份样本。将稀释样本与成品样本共同组成样本集，共88份样本。

2.样本总黄酮含量的测定：

以亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定样本集中总黄酮含量作为参考值。测得的样本集各样本中总黄酮含量的分布范围是0.389-3.238mg·mL^-1。

3.样本近红外光谱数据采集：

使用ANTARISⅡ傅立叶变换近红外光谱仪采集样本近红外光谱。采样模式为透反射光谱采集模式。采集相关参数为：以仪器内置背景为参比，分辨率为4cm^-1，扫描次数为128次，光谱采集波数范围为4000-10000cm^-1。采集到的样本集复方阿胶浆原始近红外光谱图如图1。

4.校正模型的建立：

（1）异常样本的剔除：

采用Chauvenet检验法和杠杆值与学生化残差值相结合的方法进行异常样本的剔除，Chauvenet检验结果如图2所示，经Chauvenet检验，编号为24和73的样本与样本集所有样品的平均光谱差异显著，因此将其作为异常样本进行剔除。

建模样本的杠杆值与学生化残差分布图如图3。由图可知，编号为6，31，40，50和79的样本的杠杆值较大，编号为39和60的样本的学生化残差值较大，因此将这些样本暂列为异常样品。

针对杠杆值和学生化残差值剔除的异常样本（编号为73、17、18、93、94），若直接剔除，则有可能将非异常样本误当作异常样本剔除掉。为避免发生这样的错误，需要对被判定为异常的样本进行逐一回收，根据回收后的模型性能确定样本的去留，这样在很大程度上避免了异常样本的误判，从而更加稳定和具有代表性。采用通过将异常样本逐一回收，建立模型，确定上述异常样本对模型的作用，比较未剔除、全部剔除和逐个回收多种情况下的模型结果，从中选出最优的模型以确定所要剔除的浓度异常样本。结果见表1。由于尚未进行样本集划分，所有的样品均用作校正集样本，采用偏最小二乘回归建立样本近红外光谱与其总黄酮含量之间的定量校正模型，采用r_c、r_cv、RMSEC和RMSECV作为模型性能指标。结果表明，回收样本31、39、40、50和60使模型性能不同程度下降，因而将这些样品定为异常样品并将其从样品集中剔除。回收样本6和79后模型性能略有改善，因此将这些样本重新归入样本集。

表1逐个回收剔除样本后的模型性能

注：主成分数为软件自动判断出的影响模型性能的因子。

（2）样本集的划分：

有代表性的校正集样本不但可以减少建模的工作量，而且直接影响所建模型的适用性和准确性。本发明采用SPXY法进行校正集和验证集的划分，以建立稳健的近红外光谱分析模型。SPXY算法函数于Matlab软件中编写。

经过异常样品剔除后剩余的81份样本中，60份被选入校正集，另外21份样品组成验证集。校正集与验证集样品中总黄酮含量的浓度范围分别为0.491-2.958mg/mL和0.529-1.418mg/mL，可见校正集样品的含量覆盖了验证集样品的含量范围。

（3）波段范围建模优化：

分别以4429-4900cm^-1、6469-7377cm^-1、7377-8000cm^-1、4429-8000cm^-1及其组合建模，结果见表2。结果表明：4429-8000cm^-1波段所建模型性能最优，相关系数较高，且RMSEC和RMSECV值都较小，因此选择4429-8000cm^-1波段进行建模。

表2不同波段范围PLS法建模优化结果

注：主成分数为软件自动判断出的影响模型性能的因子。

（4）光谱预处理方法建模优化：

对原始光谱分别进行了多元散射校正（MSC）、标准正则变换（SNV）、一阶导数、二阶导数、Savitsky-Golay滤波平滑（SG）和Norris导数滤波平滑等预处理方法，并以所建模型的各种性能参数作为判定依据进行优选。结果见表3。结果表明：相比原始光谱模型，MSC和SNV校正模型校正集和交叉验证相关系数均增大，RMSEC和RMSECV均减小，说明模型性能有所提高。其中MSC的拟合结果又略好于SNV。经过导数和平滑处理后的光谱建立的模型各项参数均有不同程度的下降，其中经过SG+1^st D和MSC+SG+1^st D处理后的模型交叉验证相关系数明显减小，RMSECV显著增大，表明模型预测性能降低明显。综上分析，选择MSC对原始光谱进行预处理。

表3不同光谱预处理方法PLS法建模优化结果

注：主成分数为软件自动判断出的影响模型性能的因子。其中，Raw Spectra：原始光谱；MSC：多元散射校正；SNV：标准正则变换；SG：SG滤波平滑；Norris：Norris平滑；1^stD：一阶导数光谱；2^ndD：二阶导数光谱。

（5）校正模型建立：

经过异常样本鉴别剔除7个异常样品并采用SPXY法将样本集划分为校正集和验证集后，对波段范围为4429-8000cm^-1的样本集近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，运用偏最小二乘回归法建立复方阿胶浆样品特征光谱和总黄酮含量之间的校正模型，其中偏最小二乘回归算法以及建模波段和预处理方法的优选均通过TQ analyst软件（版本8.5.25,Thermo Fisher,Madson,Wisconsin,USA）实现。模型的校正集相关系数为0.9910，RMSEC为0.0677；交叉验证相关系数为0.9808，RMSECV为0.0988；验证集相关系数为0.9798，RMSEP为0.0696，表明复方阿胶浆特征光谱与总黄酮含量之间存在良好的相关性。模型的校正和验证结果相近，具有较好的预测能力和模型稳定性。图4为总黄酮近红外预测值和参考值之间的相关图，相关图同样表明所建回归模型具有较好的拟合效果及预测能力。

5.待测样品中总黄酮含量的快速测定：

取待测的复方阿胶浆成品，按照与校正集样本相同的光谱采集参数采集近红外光谱，将特征光谱输入校正模型，便可快速计算得到待测样品中总黄酮含量值。

Claims (1)

1.一种基于近红外光谱测定复方阿胶浆中总黄酮含量的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)样本的收集：

将60批复方阿胶浆成品样本等分为两份，其中30批成品直接进行含量测定；剩余30批成品随机分组合并,每5批成品合并为1份，共得到6份样本，每份样本体积为100mL，将这6份样本在70℃下减压浓缩至体积减少为50mL，再用超纯水进行逐级稀释，每次加入15mL超纯水，第1份和第3份加9次水，共获得18份样本；其余4份分别加10次水，共获得40份样本，6份浓缩液按上述操作共获得58份样本，将稀释样本与成品样本共同组成样本集，共88份样本；

2)样本总黄酮含量的测定：

以亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定样本集中总黄酮含量作为参考值；

3)样本近红外光谱数据采集：

使用ANTARISⅡ傅立叶变换近红外光谱仪采集样本近红外光谱，采样模式为透反射光谱采集模式，采集相关参数为：以仪器内置背景为参比，分辨率为4cm^-1，扫描次数为128次，光谱采集波数范围为4000-10000cm^-1；

4)校正模型的建立：

(1)异常样本的剔除：

采用Chauvenet检验法和杠杆值与学生化残差值相结合的方法进行异常样本的剔除；

针对杠杆值和学生化残差值剔除的异常样本，若直接剔除，则有可能将非异常样本误当作异常样本剔除掉，为避免发生这样的错误，需要对被判定为异常的样本进行逐一回收，根据回收后的模型性能确定样本的去留，这样在很大程度上避免了异常样本的误判，从而更加稳定和具有代表性，采用通过将异常样本逐一回收，建立模型，确定上述异常样本对模型的作用，比较未剔除、全部剔除和逐个回收多种情况下的模型结果，从中选出最优的模型以确定所要剔除的浓度异常样本，由于尚未进行样本集划分，所有的样品均用作校正集样本，采用偏最小二乘回归建立样本近红外光谱与其总黄酮含量之间的定量校正模型，采用r_c、r_cv、RMSEC和RMSECV作为模型性能指标；

(2)样本集的划分：

采用SPXY法进行校正集和验证集的划分，以建立稳健的近红外光谱分析模型，SPXY算法函数于Matlab软件中编写；

(3)波段范围建模优化：

选择4429-8000cm^-1波段进行建模；

(4)光谱预处理方法建模优化：

选择MSC对原始光谱进行预处理；

(5)校正模型建立：

经过异常样本鉴别剔除异常样品并采用SPXY法将样本集划分为校正集和验证集后，对波段范围为4429-8000cm^-1的样本集近红外光谱数据进行多元散射校正预处理，运用偏最小二乘回归法建立复方阿胶浆样品特征光谱和总黄酮含量之间的校正模型，其中偏最小二乘回归算法以及建模波段和预处理方法均通过TQ analyst软件实现，模型的校正集相关系数为0.9910，RMSEC为0.0677；交叉验证相关系数为0.9808，RMSECV为0.0988；验证集相关系数为0.9798，RMSEP为0.0696；

5)待测样品中总黄酮含量的测定：

取待测的复方阿胶浆成品，按照与校正集样本相同的光谱采集参数采集近红外光谱，将特征光谱输入校正模型，计算得到待测样品中总黄酮含量值。