CN101791331B - 一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法，首先收集不同煎煮时间、不同提取工序的丹参提取液作为校正集样本，采用磷钼钨酸/干酪素法进行鞣质含量的测定，并将测量结果作为参照值，同时采用紫外分光光度计测得这些校正集样本稀释液在200～480nm范围的光谱数据，应用化学计量学技术，建立丹参提取液紫外光谱与其鞣质含量的定量校正模型，将未知鞣质含量的丹参提取液样本，按同样的方法测定其紫外光谱数据，利用已建立的定量校正模型便可快速计算出鞣质的含量值。本发明方法仪器简单、操作简便、测量速度快、节省了大量的人力和物力，可用于丹参注射液生产过程中鞣质含量的快速检测，并可在中药注射剂生产中推广应用。

Description

一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法

技术领域

本发明涉及中药生产质量监控方法，更具体地说是一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的紫外光谱检测方法。

背景技术

鞣质是中药材中广泛存在的一类水溶性多元酚类化合物，具有沉淀蛋白的作用。该化合物是由没食子酸(或其聚合物)的葡萄糖(及其它多元醇)酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者混合共同组成的植物多元酚。鞣质在中药注射剂中不仅会影响制剂的稳定性和澄明度，还可能会引起一系列严重的生理反应，例如，某些鞣质注入体内会引起黄疸和肝坏死等一系列临床症状。因此，鞣质在中药注射剂生产过程中常作为杂质除去。近年来中药注射剂的安全性问题已引起人们的广泛关注。鞣质检查已成为中药注射剂的特殊检查项目之一。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，是我国传统医药学中应用最早且最广泛的药物之一，丹参注射液是国家基本医疗保险药品乙类品种，对治疗冠心病等心血管疾病具有较好的疗效。丹参注射液的生产流程包括提取、浓缩、醇沉、活性炭脱色等工序，各工序中的鞣质含量监测是丹参注射液生产过程质量控制的重要监控点。

传统的以干酪素为吸附剂，以磷钼钨酸为显色剂的鞣质含量测定法操作繁琐、耗时。远不能满足对丹参注射液生产过程进行鞣质含量分析与监控的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法，可有效地满足丹参注射液生产过程中提取液鞣质含量快速测定的需求，从而保证最终产品质量。

本发明通过如下步骤实现：

1.校正集样本收集：收集不同批次丹参第1～3次提取过程中获取的丹参提取液样本作为校正集样本；

2.采用磷钼钨酸/干酪素法测定校正集样本鞣质含量：

(1)试剂、溶液配置：(按2005版中国药典附录XB中的方法配制供试品溶液和对照品溶液，)

磷钼钨酸试剂的配制取Na₂WO₄ 100g，Na₂MoO₄ 25g，加水700ml使其溶解，加100ml HCl，50ml H₃PO₄，加热回流10h，放冷，再加150g Li₂SO4，50ml水和0.2ml溴水，煮沸约15min除去残留的Br，冷却，加水稀释至1000ml，过滤，即得，

对照品溶液的配制精密称取没食子酸50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解，定容，混匀后，精密吸取5.0ml置于50ml棕色量瓶中，加水定容，备用(每ml含没食子酸0.05mg)，

供试品溶液的配制 精密量取丹参提取液适量于棕色量瓶中，加水稀释15～35倍，摇匀，滤过，弃去初滤液，备用，

(2)标准曲线测定 分别精密量取对照品溶液0.5ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml置于25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别精密量取蒸馏水适量，补足体积至13ml，加29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，照中国药典2005年版一部附录VA紫外一可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(3)总酚含量测定 精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，在760nm波长处测定吸光度A，按标准曲线法计算总酚含量，

(4)不被吸附多酚含量测定 精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1h，时时振摇，取出放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，在760nm波长处测定吸光度A′，按标准曲线法计算不被吸附多酚含量，

(5)鞣质含量计算

丹参提取液中鞣质含量＝提取液中总酚含量-提取液中不被吸附多酚含量；

3.校正集样本紫外光谱数据采集：

校正集样本供试品溶液制备 精密量取丹参提取液0.5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，备用，

紫外光谱数据采集 使用紫外分光光度计，采集校正集样本供试液200～480nm波长范围的紫外光谱扫描数据；

4.校正集样本的选择：

使用计算机定制软件(如TQ，Unscrambler等)残差分布图的方法对样本进行选择，将残差值较大的数据暂定为异常样本，以相关系数和交叉验证误差均方根RMSECV作为校正模型性能优劣判定依据，使用逐一回收的方法确定上述异常样本对模型性能优劣的影响，剔除影响模型性能的异常样本，最后确定校正集样本数，

校正模型及验证模型的评价参数：

(1)相关系数R²：

$R^2=1-\frac{\mathrm{\Σ}{(Y_i-{\hat{Y}}_i)}^2}{\mathrm{\Σ}{(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}^2}$

式中，Y_i为标准法测定的参照值，

为由校正模型预测值，

为Y_i均值。R²值越接近1，表示校正模型的预测值与真实值越接近，

(2)交叉验证误差均方根(RMSECV Root mean square error of crossvalidation)：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{({\hat{Y}}_{\mathrm{CVi}}-Y_i)}^2}{n}}$

式中，

为校正模型交叉验证的分析结果，n为校正集样本数。此参数是评价内部交叉验证好坏的质量指标，RMSECV越小，模型的预测精度越高，

(3)预测误差均方根(RMSEP Root mean square of prediction)：

$\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{({\hat{Y}}_i-Y_i)}^2}{m}}$

式中，m为用于检验模型的验证集样本数。此参数是外部验证评价模型好坏的质量指标，RMSEP越小，模型的预测性能越好；

5.定量校正模型的建立：

本发明利用化学计量学多元校正法，包括多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)和偏最小二乘回归(PLS)，建立鞣质含量回归模型，采用留一法全交叉进行内部验证，

在建立定量校正模型前，首先需要使用计算机定制软件(Unscrambler9.6)对光谱进行波段选择，得到丹参提取液特征光谱信息。接着建立特征光谱数据和鞣质含量之间的数学模型，采用留一法全交叉进行验证来确立模型的最佳因子数和最小RMSECV，本发明的校正集由X变量(光谱数据)和Y变量(鞣质含量)组成；

6.定量校正模型的验证：

收集丹参提取液样本，采用磷钼钨酸/干酪素法测定样本鞣质含量，选取鞣质含量落在校正集鞣质含量范围之内的样本作为验证集进行模型的外部验证，按校正集样本紫外光谱数据采集方法采集验证集紫外光谱数据，并将光谱特征值输入已经建立的校正模型中，计算得到验证集样本鞣质含量并与磷钼钨酸/干酪素法测定的样本鞣质含量参照值比较；

上述校正模型可以根据实际需要，增加校正集和验证集，对模型进行不断的更新与完善，操作步骤同前；

7.丹参提取液鞣质含量测定：

取未知鞣质含量的丹参提取液，按校正集样本紫外光谱数据采集方法采集样本紫外光谱数据，把特征光谱输入定量校正模型，便可快速计算得到提取液中鞣质含量值。

本发明的另一个目的是提供该方法在丹参注射液提取过程中提取液的鞣质含量测定中的应用。

本发明提供的快速测定丹参提取液中鞣质含量的紫外光谱法操作简便、测量速度快、所用的仪器设备方便易得，适用于生产过程的鞣质含量快速监测。

附图说明

图1为本发明建立定量校正模型的流程示意图。

图2为鞣质对照品没食子酸和丹参提取液紫外光谱对照图。

图3为丹参提取液的紫外光谱图。

图4为丹参提取液样品集样本的残差分布图。

图5为丹参提取液鞣质含量PCR回归模型的参比值与预测值之间相关关系。

图6为丹参提取液鞣质含量PLS回归模型的参比值与预测值之间相关关系。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：

方法流程参见图1。

1.校正集样本收集：

收集22个批次丹参第1次提取的提取液22份、第二次提取的提取液17份、第三次提取的提取液14份共计丹参提取液样本53份，作为校正集样本。

2.校正集样本参照值的测定：

采用2005版中国药典附录XB中磷钼钨酸/干酪素法测定校正集样本鞣质含量，并将显色反应时间统一控制为30min。校正集样本鞣质含量分布范围为11.2～303.5μg/ml。

3.校正集样本紫外光谱数据采集：

取校正集样本，用水定量稀释100倍，混匀，过滤，取续滤液，置于0.5cm石英比色皿中，使用紫外可见分光光度计，采集校正集样本紫外光谱数据。光谱采集相关参数为：光谱扫描范围200～480nm，每隔1nm采集一个光谱点，每个样品平行扫描3次，取平均光谱图作为样本的紫外光谱。采集到的鞣质对照品没食子酸和丹参提取液紫外光谱对照图及丹参提取液紫外光谱图分别见附图2和附图3。图2中1为丹参提取液，2为没食子酸。

4.校正集样本的选择：

采用Unscrambler9.6软件的残差分布图对样本数据进行选择，53个样本残差分布图见附图4，其中编号为1-7、1-8、1-10、2-20和3-20样本的残差值较大，将其暂列为异常样本。使用逐一回收的方法确定上述异常样本对模型的影响(以R²、RMSECV和RMSEP作为校正模型性能优劣的判定依据)，分析结果见表1。从表1可知，样本1-7和1-8的较大地影响模型性能，应该予以剔除，最后确定校正集样本数为51，样本集鞣质含量分布范围为11.2～197.1μg/ml。

表1逐一回收异常样本后的鞣质模型性能对比分析表

5.校正模型的建立：

利用主成分回归PCR法建立鞣质含量回归模型，采用留一法全交叉进行内部验证。定量分析使用Unscrambler9.6软件。

首先使用Unscrambler9.6软件对光谱进行波段选择，以得到丹参提取液特征光谱信息。由表2可知，波段的选择对PCR法建立的模型性能的影响不显著。PCR回归选择250～480nm波段建立鞣质定量回归模型，其性能相对最优，即相关系数R²最大为0.940，RMSECV最小为18.2μg/ml。选择250～480nm波段进行定量建模，所建鞣质定量模型预测值与参照值的相关图见附图5。由图可知该模型预测值与参照值之间相关性良好，模型有较好的性能。

表2基于PCR回归结合不同波段范围所建鞣质定量模型的分析结果

6.校正模型的验证

取10份丹参提取液，按校正集测定参数测定其紫外特征光谱，将该光谱数据输入已建立的鞣质定量模型中计算样品的鞣质含量，与磷钼钨酸/干酪素法测定的鞣质含量数据比较，结果见表3。得到的预测值与参照值的预测误差均方根RMSEP为9.4μg/ml，为可接受的预测误差。

表3 PCR鞣质含量模型参照值与预测值比较

样品编号	参照值(μg/ml)	PCR模型预测值(μg/ml)
			1	34.2	33.3
2	47.1	53.2
			3	84.8	92.2
4	90.9	98.9
			5	124.2	130.1
6	129.6	140.7
			7	139.4	153.6

8	159.6	161.7
			9	164.3	183.3
10	176.7	177.1

7.未知含量的丹参提取液样本中鞣质含量的预测

取待测的丹参提取液样本，按校正集样本紫外光谱数据采集方法采集紫外光谱数据，把特征光谱输入定量校正模型，快速获得提取液中鞣质含量预测值。

实施例2：

按照实施例1的方法，区别之处在于使用偏最小二乘回归(PLS)法建立鞣质定量校正模型，采用留一法全交叉进行内部验证。定量分析使用Unscrambler9.6软件。

1.选用与实施例1相同的校正集样本数据。

2.使用Unscrambler9.6软件对光谱进行波段选择，由表3可知，波段的选择对PLS法建立的模型性能的影响不显著。PLS回归选择250nm～480nm波段建立鞣质含量模型鞣质，其模型性能相对最优，即相关系数R²最大为0.937，RMSECV最小为18.6μg/ml。选择250～480nm波段采用PLS法建立鞣质定量回归模型。所建鞣质定量模型预测值与参照值的相关图见附图6。由图可知该模型预测值与参照值之间相关性良好，模型有较好的性能。

表3基于PLS回归结合不同波段范围所建鞣质含量模型的分析结果

3.校正模型的验证：

取10份丹参提取液，按校正集样本测定参数测定其紫外特征光谱，将该光谱数据输入已建立的鞣质定量模型中计算样品的鞣质含量，与磷钼钨酸/干酪素法测定的鞣质含量数据比较，结果见表4。得到的预测值与参照值的预测误差均方根RMSEP为9.3μg/ml，为可接受的预测误差。

表4 PLS鞣质含量模型参照值与预测值比较

样品编号	参照值(μg/ml)	PLS模型预测值(μg/ml)
			1	34.2	33.4
2	47.1	52.5
			3	84.8	92.5
4	90.9	99.1
			5	124.2	129.9
6	129.6	140.4
			7	139.4	153.6
8	159.6	161.2
			9	164.3	183.2
10	176.7	177.5

4.未知含量的丹参提取液样本中鞣质含量的预测

取待测的丹参提取液样本，按校正集样本紫外光谱数据采集方法采集紫外光谱数据，把特征光谱输入定量校正模型，快速获得提取液中鞣质含量预测值。

Claims (3)

1.一种快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)校正集样本收集：收集丹参提取过程不同煎煮时间、不同提取工序的丹参提取液样本；

(2)校正集样本鞣质含量的测定：按2005版中国药典附录XB中的方法配制供试品溶液和对照品溶液，磷钼钨酸/干酪素法测定丹参提取液中鞣质含量，将显色反应时间统一控制为30分钟，并将测得的含量值作为参照值；

(3)校正集样本紫外光谱的采集：将澄清的丹参提取液稀释液放置于石英比色皿中，置紫外分光光度计中，获取校正集样本紫外特征光谱数据；

(4)校正集样本的选择：使用计算机定制软件残差分布图的方法对采集到的丹参提取液样本进行选择，将残差值较大的数据定为异常样本，以相关系数(R²)、交叉验证误差均方根和预测误差均方根作为校正模型性能优劣判定依据，使用逐一回收的方法确定上述异常样本对模型性能优劣的影响，剔除影响模型性能的异常样本，最后确定校正集样本数；

(5)校正模型的建立：使用多元校正方法，建立校正集样本鞣质含量与紫外特征光谱之间的数学模型；

(6)校正模型的验证：取丹参提取液，测定其紫外特征光谱，将该光谱数据输入已建立的多元校正数学模型中计算样品的鞣质含量，与磷钼钨酸/干酪素法测定的鞣质含量数据比较，要求测量误差小于15％；

(7)校正模型的应用：采集待测样本的紫外特征光谱，将该光谱数据输入经验证的校正模型中，计算丹参提取液中鞣质的含量；

步骤(3)紫外光谱测定条件为：采用0.5cm石英比色皿，波长扫描范围为200～480nm，每隔1nm采集一个光谱点，每个样品平行扫描3次，取平均光谱图作为样本的紫外光谱；

校正集样本的公式如下：

(1)相关系数R²

$R^2=1-\frac{\mathrm{\Σ}{(Y_i-{\hat{Y}}_i)}^2}{\mathrm{\Σ}{(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}^2}$

式中，Y_i为标准法测定的参照值，

为由校正模型预测值，为Y_i均值，

(2)交叉验证误差均方根：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{({\hat{Y}}_{\mathrm{CVi}}-Y_i)}^2}{n}}$

式中，为校正模型交叉验证的分析结果，n为校正集样本数，

(3)预测误差均方根：

$\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{({\hat{Y}}_i-Y_i)}^2}{m}}$

式中，m为用于检验模型的验证集样本数。

2.根据权利要求1所述的快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法，其特征在于，使用多元校正法建立丹参提取液中鞣质含量与其紫外特征谱图之间关系的定量校正模型，采用的多元校正方法选自主成分回归法和偏最小二乘法。

3.根据权利要求1所述的快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法在丹参注射液提取过程中提取液的鞣质含量测定中的应用。

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