CN104535524A - 一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法,运用偏最小二乘法将高效液相色谱法测定的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量数据与近红外光谱信息进行关联，建立起银杏叶提取过程中槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量的多元定量校正模型；并利用所建立定量校正模型对未知银杏叶提取过程中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量进行快速检测。本发明方法可以对银杏叶提取过程中的提取液进行实时取样，并实时监测银杏叶提取液中的总黄酮醇苷含量变化；结果准确可靠。

Description

一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法
技术领域
本发明属于中药分离纯化的技术领域，具体地，涉及一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法。
背景技术
在中药制药过程中，提取过程作为中药生产的特色环节之一，决定着中药中不同成分在成品中的比例，即决定着药品疗效。目前，我国中药提取过程的质量控制仍十分被动，只对终端产品进行质检，很少考虑工艺过程中的成分变化，生产工艺很难得到精确控制，从而导致中药产品批次间质量差异较大，这也是中药难以现代化、国际化的主要原因之一。因此，发展形成从中药制药源头——提取工艺过程解决产品稳定性和可靠性问题的快速分析方法，对于中药工业技术进步和产品质量升级具有重大现实意义。
银杏叶具有益心、活血止痛、敛肺平喘之功效，是一种常用中药。总黄酮苷作为银杏叶中的主要成分，具有显著的药理、药效作用，因此，在银杏叶生产加工各工艺环节过程中常被用来作为质控指标。传统的分析方法，如高效液相色谱法、紫外分光光度法等，常需对所取样品进行繁杂的预处理，耗费大量的试剂，并且信息反馈滞后，无法满足生产过程中即时分析的需要。
近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIRS)分析技术是上世纪90年代发展起来的一项现代分析技术。它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量等多个学科的最新研究成果，以其独特的高效、快速、成本低、环保等突出优点，在农业、食品、石油化工和制药工程等学科中得到了广泛应用。在化学制药领域，NIRS已被运用于原料药质量分析、反应过程、制粒过程、混合过程、微波真空干燥过程、压片过程、包衣和包装过程，作为一种极有前途的过程分析技术，其在中药生产领域也展现出了巨大的应用潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法。本发明方法可以对银杏叶提取过程中的提取液进行实时取样，并实时监测银杏叶提取液中的总黄酮醇苷含量变化；结果准确可靠。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法，包括以下步骤：
(1)收集不同批次的银杏叶提取过程液作为校正样本集，对其进行近红外光谱扫描，采集体现槲皮素、山奈素、异鼠李素特性的近红外光谱信息；其中，光谱采集条件为：扫描范围12500～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数96次，每个样品测定2次，取平均光谱用于近红外建模；
(2)运用高效液相色谱法分别测定所述银杏叶提取过程液中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量；按下式换算成总黄酮醇苷的含量：
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51；
(3)运用偏最小二乘法将所述步骤(2)高效液相色谱法测定的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量数据与所述步骤(1)得到的近红外光谱信息进行关联，建立起银杏叶提取过程中槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量的多元定量校正模型；其中，用于构建定量校正模型的近红外光谱波段为两个波段，包括12493.2～7498.2cm-1、以及6101～5446.2cm-1；
(4)利用所述步骤(3)建立的定量校正模型对未知银杏叶提取过程中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量进行快速检测；按下式换算成总黄酮醇苷的含量：
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。
所述银杏叶提取过程液包括银杏叶提取液和银杏叶解析液。
所述步骤(2)中，所述高效液相色谱法分别测定所述银杏叶提取过程液中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量的色谱条件为:色谱柱：Welch Ultimate XB—C18，4.6*250mm，5μm；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明方法可以对银杏叶提取过程中的提取液进行实时取样，并实时监测银杏叶提取液中的总黄酮醇苷含量变化；结果准确可靠。
(2)本发明结果表明，近红外光谱技术可以对银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量进行有效检测。本发明具有方法简单、快速、准确性高等特点，相对于一般仪器检测方法，可有效解决提取过程中总黄酮醇苷含量变化的监控问题，具有较强的实用价值，可推广运用于中药生产过程。
(3)水分子所含的OH基，在近红外谱区的6900cm-1和5180cm-1附近有很强的倍频与合频吸收谱带，而其它各种物质分子的倍频与合频吸收相对较弱，因此水溶液物质体系中，水就成为近红外光谱分析时的强干扰因素。所以本发明在建模过程中避开水分的强干扰吸收波段进行建模，通过RMSECV和R2作为评价指标，通过对不同光谱区间进行建模试验，最终选定总黄酮苷的最佳建模波段为“12493.2～7498.2cm-1、6101～5446.2cm-1”，从而避免了过多的冗余信息和干扰信息，改善模型性能，提高了计算速度。此时RMSECV最小，相关系数R2接近1，总黄酮苷的吸收特性在近红外光谱中得到了很好地体现。
附图说明
图1为12批银杏提取液近红外光谱图。
图2为12批银杏解析液近红外光谱图。
图3为12批银杏下柱液中段近红外光谱图。
图4为12批银杏下柱液后段近红外光谱图。
图5为混合对照品液相色谱图。
图6为银杏提取液液相色谱图。
图7为银杏下柱液中段液相色谱图。
图8为银杏下柱液后段液相色谱图。
图9为银杏解析液液相色谱图。
图10为校正集样本中槲皮素NIR预测值与HPLC测定值之间的相关图。
图11为校正集样本中山奈素NIR预测值与HPLC测定值之间的相关图。
图12为校正集样本中异鼠李素NIR预测值与HPLC测定值之间的相关图。
图13为NIRS预测的未知批次银杏叶提取过程槲皮素含量变化曲线。
图14为NIRS预测的未知批次银杏叶提取过程山奈素含量变化曲线。
图15为NIRS预测的未知批次银杏叶提取过程异鼠李素含量变化曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
实施例1
1、校正集样本的收集
收集不同批次的银杏提取液、银杏下柱液中段、银杏下柱液后段以及银杏解析液各12批，共48批提取过程液样本作为校正集用于近红外建模。
注：但银杏下柱液中段、银杏下柱液后段经液相检测，未检出其中含有槲皮素、山奈素以及异鼠李素，故真正用于银杏提取物近红外建模的校正集包含了12批银杏提取液和12批银杏解析液。
2、样本近红外透射光谱图的采集
仪器：MPA傅立叶变换近红外光谱仪(德国BRUKER公司)，测样装置为透射样品腔或透射光纤探头，TE-InGaAs检测器，光谱采集及信息处理软件为OPUS或Unscramber数据处理软件。
光谱采集条件：扫描范围12500～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数96次，每个样品测定2次，取平均光谱用于近红外建模。近红外光谱图见图1～4。
3、校正集样本中总黄酮苷化学建模参考值的测定(HPLC)
参考2010版中国药典银杏叶项下总黄酮苷含量测定的高效液相色谱条件，对校正集样本进行总黄酮苷的测定，以此作为建模参考值。具体方法如下：
色谱条件色谱柱：Welch Ultimate XB—C18，4.6*250mm，5μm；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李鼠对照品，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备取本品约35mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4:1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量。
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51
HPLC测定结果见图5～9及表1。
表1总黄酮苷化学建模参考值的测定(HPLC)结果
4、选择能体现总黄酮苷特性的最优建模波段
水分子所含的OH基，在近红外谱区的6900cm-1和5180cm-1附近有很强的倍频与合频吸收谱带，而其它各种物质分子的倍频与合频吸收相对较弱，因此水溶液物质体系中，水就成为近红外光谱分析时的强干扰因素。所以本项目在建模过程中避开水分的强干扰吸收波段进行建模，通过RMSECV和R2作为评价指标，通过对不同光谱区间进行建模试验(槲皮素，见表2)，最终选定总黄酮苷的最佳建模波段为“12493.2～7498.2cm-1、6101～5446.2cm-1”，从而避免了过多的冗余信息和干扰信息，改善模型性能，提高了计算速度。此时RMSECV最小，相关系数R2接近1，总黄酮苷的吸收特性在近红外光谱中得到了很好地体现。
表2不同光谱波段的建模结果
5、多元校正模型的建立
在筛选出最佳建模波段和选定最佳光谱处理方法后，运用偏最小二乘法，通过内部留一交叉验证，建立了银杏叶提取液样本的近红外光谱和HPLC测定值之间的总黄酮苷定量校正模型。以该模型预测的校正集样本的总黄酮苷(槲皮素、山奈素和异鼠李素)含量与HPLC测得值之间的相关关系图见图10～12。
6、模型的预测
采集未知批次银杏叶提取过程中样品的近红外光谱，将其输入所建模型，即可快速得到其中总黄酮苷含量。该数据与HPLC参照方法测得值比较，结果见表3～5，图13～15。模型对银杏叶提取过程液样品的预测效果以相关系数r、预测误差均方根RMSEP和预测相对标准偏差RSEP％来评价，其中r越接近1，同时RMSEP和RSEP％越小，模型的预测效果就越好。
表3槲皮素NIR预测结果
表4山奈素NIR预测结果
表5异鼠李素NIR预测结果
如上所述，便可以较好地实现本发明。

Claims (3)

1.一种近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集不同批次的银杏叶提取过程液作为校正样本集，对其进行近红外光谱扫描，采集体现槲皮素、山奈素、异鼠李素特性的近红外光谱信息；其中，光谱采集条件为：扫描范围12500～4000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数96次，每个样品测定2次，取平均光谱用于近红外建模；
(2)运用高效液相色谱法分别测定所述银杏叶提取过程液中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量；按下式换算成总黄酮醇苷的含量：
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51；
(3)运用偏最小二乘法将所述步骤(2)高效液相色谱法测定的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量数据与所述步骤(1)得到的近红外光谱信息进行关联，建立起银杏叶提取过程中槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量的多元定量校正模型；其中，用于构建定量校正模型的近红外光谱波段为两个波段，包括12493.2～7498.2cm-1、以及6101～5446.2cm-1；
(4)利用所述步骤(3)建立的定量校正模型对未知银杏叶提取过程中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量进行快速检测；按下式换算成总黄酮醇苷的含量：
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。
2.根据权利要求1所述的近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法，其特征在于，所述银杏叶提取过程液包括银杏叶提取液和银杏叶解析液。
3.权利要求1所述的近红外在线监控银杏叶提取过程中总黄酮醇苷含量变化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述高效液相色谱法分别测定所述银杏叶提取过程液中的槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量的色谱条件为:色谱柱：Welch Ultimate XB—C18，4.6*250mm，5μm；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。
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