CN102252992B - 一种对中药提取过程进行近红外在线检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对中药提取过程进行近红外在线检测的方法，该方法包括以下步骤：步骤1，安装近红外在线检测系统，步骤2，采集中药提取液并进行近红外光谱的测定，步骤3，采用已知分析方法对提取液样本各种技术指标进行测定，步骤4，将步骤2得到的光谱数据和步骤3测定到的各种技术指标之间建立一种对应关系，使从光谱数据可以知道提取液各种技术指标，步骤5，对实际生产中的中药提取过程进行监测。

Description

一种对中药提取过程进行近红外在线检测方法

技术领域

本发明属于近红外在线检测技术领域，特别是采用近红外透射光谱法来监测中药提取过程中各技术指标的实时、准确信息。

背景知识

提取工艺是中药生产的关键环节，也是大多数中药制药过程的起点，直接关系到药材的利用率。目前，提取工艺的质量控制主要依靠经验和传统质量分析方法，缺乏有效的指标性成分含量实时监测手段。实际生产中提取时间往往是固定的，基本不考虑原料药材质量差异和工况波动导致的提取终点提前或滞后，易造成不同批次提取液质量的不稳定，导致中药药品批次间的质量差异，以及能源、时间的浪费，药材利用率的降低等。故研究发展中药提取过程中活性成分含量的快速无损测定方法，有助于解决提取过程中关键工艺环节的质量控制问题，从产品的源头上解决中药产品工艺和成分的稳定性、可靠性问题，对于中药工业技术进步和产品质量升级具有重大现实意义。

近红外（NIR）光谱技术作为一种快速的过程分析技术，已经被成功应用于不同的分析领域，如食品、药物、石油等。近红外技术的广泛使用主要得益于其具有快速分析、样品处理简单、无需消耗试剂等特点，是一种快速无损的绿色分析技术。近年来，近红外技术已经越来越多的被应用于中药研究，包括药材产地鉴别、有效组分含量测定和制药过程的在线检测和监控。从近年来研究进展情况看来，近红外光谱分析技术是最有希望在中药生产过程实现在线检测及质量控制的过程分析技术之一。

在中药质量控制及生产应用领域，近红外光谱作为一种在线检测技术应用于指标成分的测定已有相关专利文献，如专利（CN02137234.9，CN200710022408.9，CN200810050095.2和CN200410090617.3）等。但是这些专利均为离线采集近红外光谱，也并没有将所建模型真正应用于在线检测。

本发明将近红外光谱分析技术引入中药生产的提取过程，实现对各指标成分和含固量的实时监测以及提取过程终点的快速判断，有利于提高中药提取过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。

发明内容

本发明提供一种近红外光谱检测系统，以及利用该系统对中药提取过程进行实时监测，以便获得即时动态的中药提取过程中技术指标的信息，用以监控中药提取过程中生成的产品的质量。

同时，本发明还提供一种中药提取过程近红外光谱在线检测方法，该方法的检测目标包括提取液中含固量以及提取过程终点，为中药质量控制提供一种新方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种近红外光谱检测系统，该系统包括提取罐1、泵2、在线过滤器3、缓冲罐4、外循环管路5、流量计6、近红外光谱仪7、光纤探头8、流通池9、取样口12以及用于控制流通池中提取液流量的阀门10、11，阀门用于控制流通池中提取物流速，流速控制在0-60ml/min；在线过滤器用于滤除固体杂质颗粒，过滤精度范围10-100微米，具体结构见附图1。

本发明还包括用本发明的近红外光谱检测系统检测中药提取过程中的中间产物和最终产物的技术指标的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，安装近红外在线检测系统

步骤2，采集中药提取液并进行近红外光谱的测定

步骤3，采用已知分析方法对提取液样本各种技术指标进行测定

步骤4，将步骤2得到的光谱数据和步骤3测定到的各种技术指标之间建立一种对应关系，使从光谱数据可以知道提取液各种技术指标，并将这种对应关系用数学模型表示，输入本发明的系统中。

步骤5，用以经录入了步骤4数学模型的本发明的近红外光谱检测系统对实际生产中的中药提取过程进行监测。

其中，步骤1中，近红外在线检测系统由以下部分组成：提取罐1、泵2、在线过滤器3、缓冲罐4、外循环管路5、流量计6、近红外光谱仪7、光纤探头8、流通池9、取样口12以及用于控制流通池中提取液流量的阀门，具体结构见附图1。

步骤2中，所述中药是任何一种或多种可以用于提取的中药，所述提取使用的是中药领域的常规提取方法，如水提，醇提，中药提取得到提取液，用本发明的系统进行提取液的采集，并用近红外光谱仪对采集的提取液进行光谱测定，测定样本时以空气为背景，波段范围为4000～10000cm^-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm^-1，光纤透射式探头光程2mm，光纤10m×2，近红外光谱的测定时间间隔为1或2分钟；提取液样本的采集时间间隔为5或10分钟，采集提取液样本的同时采集近红外光谱。

步骤3中所述采用已知分析方法对提取液样本各种技术指标进行测定，其中已知方法包括但不限于：高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法、气相色谱法，这些方法可以测定提取液中药物成分的浓度。提取液中含固量的测定精则可采用烘干法。用上述方法可以得到提取液的各种技术指标，如药物成分的浓度以及提取液中含固态物质的量。

步骤4中所述将步骤2得到的光谱数据和步骤3测定到的各种技术指标之间建立一种对应关系，从光谱数据可以知道各种技术指标。其中对应关系的建立采用数学模型并应用计算机计算。如在建立步骤4的对应关系时，用偏最小二乘回归（PLSR）法建立各指标成分和含固量模型，并采用各模型评价指标考察模型性能

模型评价指标包括相关系数（R）、交互验证误差均方根（RMSECV）、最佳主因子数（Factor）、校正集和验证集预测误差均方根（RMSEC、RMSEP）、校正集和验证集相对偏差（RSEC和RSEP）和相对分析误差（RPD）。当R值接近于1，RMSECV、RMSEC和RMSEP值相互接近且较小，RSEC和RSEP相互接近且小于10%，RPD值大于3时说明所见模型具有较好的稳定性和预测精度，可以用于中药提取过程的在线检测。

模型使用一段时间后继续按建模方法采集新的近红外光谱和样本数据，用于更新原有模型。

以上步骤特别是步骤2和3可以重复多次，以便得到一种平均的准确的测定数据。在实际中药生产过程中由于原料批次、环境变化、人为差异等多种因素的变化影响，导致原模型建模样品的代表性不足引起“模型失效”。因此，在模型使用一段时间之后需要通过模型更新方法，将新的样品加入到原模型中去，扩充模型所包含的变异范围，从而扩展模型的适用性。其中，新样品的近红外光谱采集条件以及各指标成分和含固量的测定方法与原模型相同。采用移动窗标准偏差（MBSD）和（或）一致性检验（CT）方法判断提取过程终点。

MBSD计算方法：获取第⑤步中用于建模的光谱数据。首先确定用于计算标准偏差的连续光谱条数n，即确定移动块窗口宽度，接着按（1）式计算终点判断开始时测得的n条光谱之间的标准偏差Si，，然后按（2）式计算Si的平均值S。按时间顺序剔除原n条光谱中最早的那条光谱，并加入最后那条光谱的下一条的光谱，重新计算Si、S。依次重复剔除、加入和计算操作，最后对偏差平均值S作图，当S值接近于0且趋于稳定时判断达到提取过程终点。

$\mathrm{Si}=\sqrt{\frac{\underset{j=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{Xij}-\stackrel{\‾}{\mathrm{Xi}})}^2}{n-1}}---\left(1\right)$

$S=\frac{\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{S}_i}{m}---\left(2\right)$

其中X_ij为第j条光谱在波数i处的吸光度值，为窗口内n条光谱在波数i处的吸光度值的平均值，m为选取的波数总数。

CT计算方法：获取第⑤步中用于建模的光谱数据，挑选其中在提取过程最后5或10分钟采集到的光谱数据作为参考光谱集。计算参考光谱在每个波长点λ处吸收度的平均值和标准偏差（S.D.）,然后将每个波长点的平均值加减多少倍的S.D.作为该波长点的可信区间(confidence band)，待测光谱在该波长点处的吸收度与平均值的差值除以S.D.，得到的就是一致性指数(conformity index，CI)。一致性检验就是将待测光谱的CI与之前设定的CI限度(CI limit)进行比较，从而快速简单地判断待测光谱与参考光谱是否具有一致性。当CI值进入所设定的限度范围内且趋于稳定时表示已通过一致性检验，此时提取过程达到提取终点。

步骤5中所述对实际生产中的中药提取过程进行监测，是通过在线采集中药提取液并进行近红外光谱的测定，通过步骤4的对应关系得到中药提取液的各种技术指标。步骤5所述的实际生产中的中药提取过程为任何一种已经录入了本发明系统的实际生产过程，可以直接使用本发明的系统对生产过程中的提取液进行近红外检测。

另外，在选择近红外光谱时需要保证光谱的灵敏性和准确性，需要对建模波段进行预处理

预处理方法包括导数法、平滑法，导数法可用于消除因流速、温度波动等引起的基线漂移，减少峰与峰之间的重叠并使有效信息显现出来，平滑法则可以降低高频随机噪声。导数法包括一阶导数和二阶导数，平滑法包括Karl Norris导数平滑滤波和Savitzky-Golay平滑滤波。

在选择建模波段时需排除以下波段：4500～5450cm^-1波段，即“水峰”，由于提取溶剂大部分为水或醇，两者均含有OH基，极性强，在近红外谱区的1940nm（5155cm^-1）附近有很强的合频与倍频吸收谱带，而其它各种物质分子的倍频与合频吸收相对较弱；4000～4600cm^-1波段，主要为光纤吸收；吸收度大于1.5的波段，属饱和吸收波段。排除以上波段后，根据模型性能评价参数确定最佳建模波段。

附图说明

附图1是提取过程近红外在线检测系统简图

1—多功能提取罐

2—泵

3—在线过滤器

4—缓冲罐

5—外循环管路

6—流量计

7—近红外光谱仪

8—光纤探头

9—流通池

10、11—阀门

12—取样口

13—冷凝器

附图2是在线采集到的赤芍提取液原始近红外光谱图

附图3是近红外预测值与实际值的相关图

附图4是赤芍提取过程模型预测与实际测定趋势对照图

图3、4中：A图为含固量；B图为芍药苷；C图为苯甲酸。

附图5是模型更新前后含固量预测结果比较

图5中：A为模型扩充前相关图；B为模型扩充前预测值和实际测定值趋势对照；C为模型扩充后相关图；D为模型扩充后预测值和实际测定值趋势对照）。

附图6是提取过程偏差平均值S随提取时间变化图

附图7是提取过程CI值随提取时间变化图

具体实施方式

下面结合附图和实施实例做进一步说明，但本发明并不限于此。

实施例：赤芍药材提取过程

1.近红外光谱和提取液样本在线采集

赤芍药材240kg，加10倍量纯化水浸泡1h后开始升温。升温十分钟后开始采集提取液样品，样品采集的时间间隔为10min，同时，每隔2.5min在线采集提取液的近红外光谱。近红外在线检测系统见附图1，流通池中提取液流速为30mL/min。升温过程开始时记为零点，到达设定的提取温度（100℃）后开始保温。保温时间为2h，前60min内，每隔5min从取样口采集一份提取液样品；后60min内，每隔10min从取样口采集一份提取液样品。所取样品分别用于芍药苷、苯甲酸和含固量的测定。重复5批赤芍药材的提取实验，记为Batch A、B、C、D和E，每批次的实验都以相同方式进行取样和采集光谱，所得数据用于建立定量模型。

2.各指标成分浓度和含固量的测定

①指标成分：芍药苷和苯甲酸

HPLC色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇～0.5%醋酸溶液（v/v,30:70）；流速1mL/min；检测波长230nm；柱温40℃；进样量10μL。

精密称取芍药苷对照品19.27mg，用甲醇溶解，定容至50mL量瓶，得0.3854mg/mL的芍药苷对照品储备溶液。精密称取苯甲酸对照品37.20mg，用甲醇溶解，定容至50mL量瓶，精密吸取1mL该溶液至l0mL容量瓶，加甲醇至刻度，得0.0744mg/mL的苯甲酸对照品储备溶液。精密吸取芍药苷和苯甲酸的混合对照品（4：1）溶液2、4、6、8、10、12μL，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以色谱峰面积对进样浓度进行线性回归，标准曲线分别在0.77～4.62μg和0.15～0.89μg范围内线性良好，相关系数R值分别为0.9996和0.9999。

②含固量

烘干至恒重的扁形瓶（两次烘干后重量差小于5mg）称重X0，取样品约10mL至扁形瓶，称重X1，水浴蒸干，105℃烘5h，取出置干燥器内冷却30min，迅速称重X2。含固量按下式计算：

3.选择近红外光谱建模波段和预处理方法

①建模波段的选择

去除以下波段：4000～4600cm-1（光纤吸收）、4500～5450cm^-1（水峰）和吸收度大于1.5的饱和区域。根据提取液近红外光谱图的吸收特征将完整的波段分成5个不同的波长区间：5450～6100，61000～7500，7500～9750和9750～12000cm^-1。不同波段选取对所得模型性能评价指标的影响见表1。从表1可见，当使用5450-6100,7500-12000cm^-1这两个波段时三个模型均有较好的稳定性和预测精度。

表1近红外波段选取对模型性能评价指标的影响

②预处理方法的选择

在近红外透射光谱的采集过程中，环境的变化(温度、提取液流速等)会引起光谱基线的偏移，随机噪声和样品背景干扰都会对校正结果产生影响。因此，在对近红外光谱进行分析之前，一般要对光谱数据进行预处理，以提高所建立模型的预测准确性。导数法可以消除信号中含有的低频背景和常数项，降低高次项的幂次，从而使高频信号显现出来，便于找出光谱中被较强背景吸收所覆盖的特征光谱带的准确峰值范围，但导数处理的同时会引入噪声，降低信噪比。平滑可以降低高频随机噪声。本实验采用Karl Norris导数平滑滤波和Savitzky-Golay平滑滤波这两种比较常用的滤波方法。本实验采用留一交互验证法比较了不同预处理方法对模型性能的影响，见表2。通过综合比较芍药苷、苯甲酸和含固量模型均采用一阶导数和Norris平滑处理时得到的RMSECV值小，相关系数高，建模效果比较理想。

表2不同预处理方法对模型性能评价指标的影响

4.采用偏最小二乘回归（PLSR）法建立芍药苷、苯甲酸和含固量模型

在5450-6100和7500-12000cm^-1波段范围内，采用一阶导数和Karl Norris一阶导数平滑处理，将5批提取实验（Batch A,B,C,D and E）的数据全部用于建模。含固量、芍药苷和苯甲酸模型的NIR预测值和实际测定值的相关图见图3。模型校正集相关系数均大于0.980，RMSECV值较小，且三个模型的RPD值均大于3，说明模型性能良好。

5.在线分析提取过程中各指标成分和含固量

将所建模型用于在线预测赤芍提取过程中含固量、芍药苷和苯甲酸浓度，预测结果如图4所示。从图中可以看出，含固量、芍药苷和苯甲酸浓度预测趋势与实际测定值的变化趋势基本一致，能够满足中药生产过程实时分析的精度要求。

6.模型更新

在实际中药生产过程中由于原料批次、环境变化、人为差异等多种因素的变化影响，先前建立的模型往往会出现预测偏差变大甚至完全无法预测的现象。为解决由于原模型建模样品的代表性不足引起的“模型失效”问题，可通过模型更新方法，将新的样品加入到原模型中去，扩充模型所包含的变异范围，从而扩展模型的适用性。对模型进行更新后样品含固量预测值与实际值的偏差有所降低，预测效果得到了一定的改善，相关系数提升至0.9938。模型扩充后含固量预测结果见图5所示。

7.提取过程终点快速判断

①移动窗标准偏差（moving block of standard deviation,MBSD）法

获取用于建立定量模型的光谱数据，即采用Karl Norris一阶导数平滑处理近红外光谱，消除光谱的基线漂移并减小噪声，再选择5450-6100和7500-12000cm-1光谱区间，用以剔除噪声较大的光谱区间，。采用MBSD法计算相邻3张近红外光谱的偏差值，当偏差值接近于0且趋于稳定时判断达到提取过程终点。

赤芍提取过程光谱偏差平均值S随提取时间变化如图6所示，当提取开始110min后S值趋于稳定，说明提取过程已达终点。采用MBSD法预测得到的提取终点和实际测定得到的结果基本吻合，可以利用MBSD法快速判断提取终点。

②一致性检验法（conformity test，CT）

获取用于建立定量模型的光谱数据，挑选提取过程最后10分钟采集到的光谱数据作为参考光谱集。实验中CI限度设定为3，当CI值小于3且趋于稳定时判断达到提取终点。如图7所示，当提取开始110min左右时CI值低于3且趋于稳定，说明提取过程基本达到混合终点，可以停止提取进行下一步工序。

Claims (1)

1.一种对赤芍药材提取过程进行近红外在线检测方法，其特征在于：步骤如下：

1）近红外光谱和提取液样本在线采集

赤芍药材240kg，加10倍量纯化水浸泡1h后开始升温，升温十分钟后开始采集提取液样品，样品采集的时间间隔为10min，同时，每隔2.5min在线采集提取液的近红外光谱，流通池中提取液流速为30mL/min，升温过程开始时记为零点，到达100℃后开始保温，保温时间为2h，前60min内，每隔5min从取样口采集一份提取液样品；后60min内，每隔10min从取样口采集一份提取液样品，所取样品分别用于芍药苷、苯甲酸和含固量的测定，重复5批赤芍药材的提取实验，记为Batch A、B、C、D和E，每批次的实验都以相同方式进行取样和采集光谱，所得数据用于建立定量模型；

2）各指标成分浓度和含固量的测定

①指标成分：芍药苷和苯甲酸

HPLC色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18柱，型号250mm×4.6mm,5μm；流动相为体积比30：70=甲醇：0.5%醋酸溶液；流速1mL/min；检测波长230nm；柱温40℃；进样量10μL；

精密称取芍药苷对照品19.27mg，用甲醇溶解，定容至50mL量瓶，得0.3854mg/mL的芍药苷对照品储备溶液，精密称取苯甲酸对照品37.20mg，用甲醇溶解，定容至50mL量瓶，精密吸取1mL该溶液至l0mL容量瓶，加甲醇至刻度，得0.0744mg/mL的苯甲酸对照品储备溶液，精密吸取芍药苷和苯甲酸的混合对照品溶液2、4、6、8、10、12μL，混合对照品溶液中芍药苷：苯甲酸=4：1，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以色谱峰面积对进样浓度进行线性回归，标准曲线分别在0.77～4.62μg和0.15～0.89μg范围内线性良好，相关系数R值分别为0.9996和0.9999；

②含固量

烘干至恒重的扁形瓶称重X₀，取样品约10mL至扁形瓶，称重X₁，水浴蒸干，105℃烘5h，取出置干燥器内冷却30min，迅速称重X₂，含固量按下式计算：

3）选择近红外光谱建模波段和预处理方法

①建模波段的选择

去除以下波段：光纤吸收4000～4600cm^-1、水峰4500～5450cm^-1和吸收度大于1.5的饱和区域，根据提取液近红外光谱图的吸收特征将完整的波段分成4个不同的波长区间：5450～6100，6100～7500，7500～9750和9750～12000cm^-1，不同波段选取对所得模型性能评价指标的影响见表1，从表1可见，当使用5450-6100,7500-12000cm^-1这两个波段时三个模型均有较好的稳定性和预测精度；

表1近红外波段选取对模型性能评价指标的影响

②预处理方法的选择

在近红外透射光谱的采集过程中，环境的变化会引起光谱基线的偏移，随机噪声和样品背景干扰都会对校正结果产生影响，因此，在对近红外光谱进行分析之前，一般要对光谱数据进行预处理，以提高所建立模型的预测准确性，导数法可以消除信号中含有的低频背景和常数项，降低高次项的幂次，从而使高频信号显现出来，便于找出光谱中被较强背景吸收所覆盖的特征光谱带的准确峰值范围，但导数处理的同时会引入噪声，降低信噪比，平滑可以降低高频随机噪声，采用Karl Norris导数平滑滤波和Savitzky-Golay平滑滤波这两种比较常用的滤波方法，采用留一交互验证法比较了不同预处理方法对模型性能的影响，见表2，通过综合比较芍药苷、苯甲酸和含固量模型均采用一阶导数和Norris平滑处理时得到的RMSECV值小，相关系数高，建模效果比较理想，

表2不同预处理方法对模型性能评价指标的影响

4）采用偏最小二乘回归法建立芍药苷、苯甲酸和含固量模型

在5450-6100和7500-12000cm^-1波段范围内，采用一阶导数和Karl Norris一阶导数平滑处理，将5批提取实验Batch A,B,C,D和E的数据全部用于建模，得到含固量、芍药苷和苯甲酸模型的NIR预测值和实际测定值的相关图，模型校正集相关系数均大于0.980，RMSECV值较小，且三个模型的RPD值均大于3，说明模型性能良好，

5）在线分析提取过程中各指标成分和含固量

将所建模型用于在线预测赤芍提取过程中含固量、芍药苷和苯甲酸浓度，得到预测结果图，从图中可以看出，含固量、芍药苷和苯甲酸浓度预测趋势与实际测定值的变化趋势基本一致，能够满足中药生产过程实时分析的精度要求，

6）模型更新

在实际中药生产过程中由于原料批次、环境变化、人为差异的变化影响，先前建立的模型往往会出现预测偏差变大甚至完全无法预测的现象，为解决由于原模型建模样品的代表性不足引起的模型失效问题，可通过模型更新方法，将新的样品加入到原模型中去，扩充模型所包含的变异范围，从而扩展模型的适用性，对模型进行更新后样品含固量预测值与实际值的偏差有所降低，预测效果得到了一定的改善，相关系数提升至0.9938，得到模型扩充后含固量预测结果图；

7）提取过程终点快速判断

①移动窗标准偏差法

获取用于建立定量模型的光谱数据，即采用Karl Norris一阶导数平滑处理近红外光谱，消除光谱的基线漂移并减小噪声，再选择5450-6100和7500-12000cm^-1光谱区间，用以剔除噪声较大的光谱区间，采用MBSD法计算相邻3张近红外光谱的偏差值，当偏差值接近于0且趋于稳定时判断达到提取过程终点；

赤芍提取过程光谱偏差平均值S随提取时间变化，当提取开始110min后S值趋于稳定，说明提取过程已达终点，采用MBSD法预测得到的提取终点和实际测定得到的结果基本吻合，可以利用MBSD法快速判断提取终点；

②一致性检验法

获取用于建立定量模型的光谱数据，挑选提取过程最后10分钟采集到的光谱数据作为参考光谱集，实验中CI限度设定为3，当CI值小于3且趋于稳定时判断达到提取终点，当提取开始110min左右时CI值低于3且趋于稳定，说明提取过程基本达到混合终点，可以停止提取进行下一步工序。

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