CN101984343A - 一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，通过建立中药大孔树脂吸附和洗脱过程药液有效成分含量与近红外光谱之间的定量模型，并将模型用于待测样品的含量预测，实现了大孔树脂吸附和洗脱过程有效成分含量的快速定量，从而实现吸附过程泄漏点和终点以及洗脱过程起点与终点的快速判断，使整个大孔树脂分离纯化过程中操作更加合理。本发明具有方法简便、结果准确、分析速度快等优点，可快递判断中药大孔树脂分离纯化过程关键点从而实现这个过程的在线质量监测，解决了传统离线分析方法耗时长、效率低、试剂消耗量大等缺点，为中药大孔树脂分离纯化过程质量控制提供使用方法。
Description
技术领域
本发明属中药分离纯化判别方法，涉及一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的快速判别方法，具体是中药大孔树脂分离纯化过程药液中有效成分含量的近红外在线快速测定。
背景技术
大孔树脂分离纯化技术作为一种新型固液柱层析分离技术，具有选择性好，吸附容量大，再生处理方便及吸附迅速、解吸容易、操作简便等优点，克服了中药产品传统分离提纯工艺粗(杂质多)、大(服用量大)、黑(颜色深)等缺点，在天然产物有效成分的精制纯化中已被广泛应用。通过大孔吸附树脂的纯化，往往期望得到纯度较高的产品，因此在实际的工业生产中，对工艺的稳定性、产品的纯度、产率、原料的利用率等方面都提出了较高要求，需要对整个树脂纯化工艺进行精细的全程监控。大孔树脂吸附分离是一个比较复杂的过程，其主要步骤有上柱、吸附和洗脱，在实际生产中，为了提高生产效率且不造成浪费，需考察树脂纯化各步骤对有效成分的影响，建立有效成分含量测定方法及吸附过程泄漏点和终点以及洗脱过程起点与终点的判定方法。
目前常规的质量监控方式主要依赖经验和取样离线分析，辅助以薄层色谱法、分光光度法、高效液相色谱法等常规质量分析方法。但这些方法存在样品前处理复杂、分析周期长、费用高、速度慢等缺点，而且分析结果具有滞后性，不能体现生产过程的实时状况，因此也难以实现工程化和自动化，导致生产过程质量得不到有效控制，产品质量的稳定性和均一性差。因此中药大孔树脂分离纯化过程的在线质量检测是提高其产品质量的技术难题，建立能够在线检测的大孔树脂柱质量分析系统，是当前中药工业中迫切需要解决的问题。
大孔树脂分离纯化过程关键点主要包括吸附过程泄漏点和终点以及洗脱过程起点与终点，这些关键点的判定，关系到大孔树脂分离纯化过程操作的合理性和最终效果，因此，实现这些关键点的快速判断对树脂分离纯化具有重大指导意义。通常，吸附过程泄漏点是指吸附时流出液中开始出现目标有效成分，吸附过程终点是指吸附时流出液中目标有效成分含量达上样液中目标有效成分含量的10％。洗脱过程起点是指洗脱时流出液中开始出现目标有效成分，洗脱过程终点是指有效成分含量相对浓度变化率RCCRi趋于所设定阈值时的取样点，该阈值因对象的不同而不同。
近红外光谱(NIRS)分析技术是一种典型的绿色分析技术，不消耗化学试剂，不破坏分析样品，不产生任何污染，具有原位、快速、非接触等特点，并可同时进行多组分测定，已在天然药物分析方面得到了广泛应用，如药材产地和真伪的判别，中药提取、浓缩和药物粉末混合、干燥等过程的在线监测等。本发明将近红外光谱分析技术用于中药大孔树脂分离纯化过程药液有效成分的快速检测，有利于提高中药大孔树脂分离纯化过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。
发明内容
本发明针对目前中药大孔树脂分离纯化过程存在的问题，提供了一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，该方法可实现整个过程流出液中有效成分含量的实时在线检测，并实现吸附过程泄漏点和终点以及洗脱过程起点与终点的快读判断，为中药大孔树脂分离纯化过程在线质量控制提供方法。
本发明通过以下技术方案实现：
(1)大孔树脂近红外在线监测系统
大孔树脂近红外在线监测系统主要包括树脂柱、流量调节阀、三通阀、流通池、光纤、近红外光谱仪、计算机，在大孔树脂柱流出口设置流量调节阀用于调节药液的流量大小，流出口下端通过橡胶管连接接三通阀b端，三通阀a端通过橡胶管与流通池竖直方向下端连接，流通池竖直方向上端连接橡胶管以便收集药液，药液在流通池中的流向为竖直方向从下往上，流通池水平方向接光纤，光纤连接到近红外光谱仪上，近红外光谱仪与计算机连接，三通阀c端用于样品收集；
(2)收集大孔树脂吸附和洗脱过程药液样品并采集其近红外光谱图
在大孔树脂吸附和洗脱过程，设定合适的间隔时间，在三通阀c端分别进行样品收集，在收集样品之前扫描药液的近红外光谱图，以空气为背景，波段范围为4000-10000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1；
(3)采用HPLC法测定样品中有效成分的含量
枳壳大孔树脂分离纯化过程药液中有效成分以柚皮苷为指标，地黄叶大孔树脂分离纯化过程药液中有效成分以麦角甾苷为指标，在合适色谱条件下分别测定每份样品中指标成分的含量；
枳壳提取液大孔树脂纯化过程建模使用的波数范围为6500-7500cm-1，地黄叶提取液大孔树脂纯化过程建模使用的波数范围为5500-6200cm-1和5600-6100cm-1，有效成分含量测定的参比方法为HPLC法；
(4)选择校正集样本并对其近红外光谱进行合适的预处理
分别选择吸附和洗脱过程的部分样品作为校正集样本，采用导数法、Norris卷积平滑法、Savitzky-Golay卷积平滑法、均值中心化法、方差标准化法等方法对光谱进行预处理，消除环境因素对光谱产生的影响(如基线偏移，随机噪声和背景干扰等)，并以相关系数(R2)和交叉验证误差均方根(RMSECV)为评价指标选择最佳的光谱预处理方法。光谱预处理方法包括：一级导数法、二级导数法、Norris卷积平滑法、Savitzky-Golay卷积平滑法、均值中心化法或方差标准化法等；
(5)波段选择和近红外光谱与有效成分含量之间校正模型的建立
水分子在6944cm-1和5155cm-1附近有很强的合频与倍频吸收谱带，而其它各种物质分子的倍频与合频吸收相对较弱，为了减少溶剂吸收对模型的干扰，本发明采用相关光谱法合理去除水分子的两个强吸收峰，再根据校相关系数(R2)、正均方根误差(RMSEC)、预测均方根误差(RMSEP)、交叉验证误差均方根(RMSECV)等对建模波段进行局部修饰，确定最优建模波段和主因子数。然后采用偏最小二乘(PLS)法建立近红外光谱与有效成分含量之间的校正模型。建立模型时通过样品杠杆值、学生残差和样品的马氏距离来判断异常样品并将其剔除；
(6)将待测样品的近红外光谱代入步骤(5)中的校正模型中获得其有效成分含量信息
将待测样品的近红外光谱代入已经建立的模型中，预测待测样品中有效成分的含量，并绘制大孔树脂分离纯化过程吸附和洗脱过程预测值和HPLC测定值的曲线进行比较，以预测集相关系数(R2)和预测均方根误差(RMSEP)为指标对模型预测性能进行评价；
(7)根据样品有效成分含量信息对关键点进行判断
所述关键点指吸附过程泄漏点和终点以及洗脱过程起点与终点，所述的吸附过程泄漏点是指吸附时流出液中目标有效成分泄漏率大于零，吸附过程终点是指吸附时流出液中目标有效成分含量泄漏率大于10％，所述的洗脱过程起点是指洗脱时流出液中出现目标有效成分，洗脱过程终点是指有效成分含量相对浓度变化率RCCRi趋于设定阈值时的取样点；
所述的目标有效成分泄漏率计算方法：
所述的样品有效成分含量相对浓度变化率RCCRi计算方法是：
其中Ci、Ci+1分别为相邻两个取样点样品中有效成分含量。
本发明通过建立中药大孔树脂分离纯化过程药液有效成分含量与近红外光谱之间的定量模型，并将模型用于待测样品的含量预测，实现了大孔树脂分离纯化过程指标成分含量的快速分析以及吸附过程泄漏点和终点以及洗脱过程起点与终点的快速判断。本发明具有方法简便、结果准确、分析速度快等优点，可用于中药大孔树脂分离纯化过程在线质量监测，解决了传统离线分析方法耗时长、效率低、试剂消耗量大等缺点，为中药大孔树脂分离纯化过程质量控制提供了新技术。
附图说明
图1是中药大孔树脂分离纯化过程近红外在线检测装置示意图。
图2是枳壳提取液大孔树脂吸附过程样品的近红外原始光谱。
图3是枳壳提取液大孔树脂洗脱过程样品的近红外原始光谱。
图4是枳壳提取液大孔树脂吸附过程柚皮苷定量校正模型相关关系图。
图5是枳壳提取液大孔树脂洗脱过程柚皮苷定量校正模型相关关系图。
图6是枳壳提取液大孔树脂吸附过程泄漏点和终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图。
图7是枳壳提取液大孔树脂洗脱过程起点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图。
图8是枳壳提取液大孔树脂洗脱过程终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图。
图9是地黄叶提取液大孔树脂吸附过程样品的近红外原始光谱。
图10是地黄叶提取液大孔树脂洗脱过程样品的近红外原始光谱。
图11是地黄叶提取液大孔树脂吸附过程麦角甾苷定量校正模型相关关系图。
图12是地黄叶提取液大孔树脂洗脱过程麦角甾苷定量校正模型相关关系图。
图13是地黄叶提取液大孔树脂吸附过程泄漏点和终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图。
图14是地黄叶提取液大孔树脂洗脱过程起点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图。
图15是地黄叶提取液大孔树脂洗脱过程终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
枳壳提取液大孔树脂分离纯化过程关键点的快速判别
(1)大孔树脂近红外在线监测系统
参见图1，大孔树脂近红外在线监测系统主要包括树脂柱1、流量调节阀2、三通阀3、流通池4、光纤5、近红外光谱仪6、计算机7，在大孔树脂柱1流出口设置流量调节阀2用于调节药液的流量大小，流出口下端通过橡胶管连接接三通阀3b端，三通阀3a端通过橡胶管与流通池4竖直方向下端连接，流通池4竖直方向上端连接橡胶管以便收集药液，药液在流通池4中的流向为竖直方向由下往上，流通池4水平方向接光纤5，光纤5连接到近红外光谱仪6上，近红外光谱仪6与计算机7连接，三通阀3c端用于样品收集；
(2)指标成分的HPLC测定
用高效液相色谱法(HPLC)测定枳壳提取液大孔树脂(HPD400A)分离纯化过程中指标成分柚皮苷的含量，并以此作为对照值用于建模。柚皮苷HPLC测定色谱条件为：Agilent SB-C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈-0.03％磷酸溶液(20∶80，v/v)为流动相；流速1.0mL/min；检测波长280nm；柱温35℃；进样量5μL。在建立模型时，吸附过程校正集样品中柚皮苷的含量范围为0.07-28.97g/L，验证集样品中柚皮苷的含量范围为0.25-22.88g/L；洗脱过程校正集样品中柚皮苷的含量范围为0.08-60.68g/L，验证集样品中柚皮苷的含量范围为0.12-60.25g/L。
(3)扫描样品的NIR透射光谱
光谱扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，液体样品池为2mm光程的石英比色皿。实验采用空气为参比进行光谱采集，测量时环境温度为18℃，湿度为40％，吸附和洗脱过程的原始近红外光谱分别见附图2和附图3。
(4)异常点样品剔除
结合马氏距离法、杠杆值与学生化残差等方法综合判别异常点样品和强影响点样品，并予以剔除。
(5)光谱预处理
分别比较不同预处理方法对模型性能的影响，以交叉验证误差均方根(RMS ECV)和相关系数R为评价指标进行优选。最终吸附过程采用原始光谱，而洗脱过程采用一阶导数与norris卷积平滑处理的近红外光谱用于建模。
(6)波段选择
对于吸附过程，采用相关系数法与方差分析法进行波段的选择，结合相关光谱图和残差光谱图，选择相关系数值与光谱标准偏差值较大的波段，最终选择6500-7500cm-1用于建模。对于洗脱过程，通过考察预处理后的近红外光谱，选择吸收较强的光谱区域，最终选择4000-5500cm-1和6500-7500cm-1两个波段用于建模。
(7)近红外定量校正模型建立
将前三次实验收集的流出液样本作为校正集。吸附过程中剔除2个异常样本，采用原始光谱在6500-7500cm-1波段进行建模。校正模型的相关系数达到0.9912，且校正集的RPD＞5(等于6.7)，可见该模型性能较好。洗脱过程剔除4个异常样本，采用一阶导数与norris平滑处理，在4000-4700cm-1，5000-6000cm-1波段内进行建模。所建模型的预测值与HPLC测定值之间相关性良好，测量结果趋于一致，校正模型相关系数R大于0.9。吸附与洗脱模型的相关关系图见附图4和附图5。
(8)待测样品的预测
将建立的吸附模型对第四根柱子吸附过程收集的前16个样品进行柚皮苷洗脱过程含量预测，预测集相关系数R2为0.9906，RMSEP为1.76，RPD等于5(＞3)，满足过程预测的要求，表明该模型可以较好的进行树脂吸附过程柚皮苷浓度的预测将建立的洗脱模型对第四根柱子收集的前16个样品进行柚皮苷洗脱过程含量预测，预测集相关系数R2为0.978，RMSEP为3.56。根据HPLC测定值和NIR预测值分别绘制吸附过程泄漏点和终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图以及洗脱过程起点与终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图，附图6-8显示NIR预测值与HPLC测定值曲线整体趋势大体吻合，表明本发明提供的方法可用于枳壳提取液大孔树脂分离纯化过程关键点的判断，且比传统方法更加快速、简便。
实施例2
地黄叶提取液大孔树脂分离纯化过程关键点的快速判别
(1)大孔树脂近红外在线监测系统同实施例1；
(2)指标成分的HPLC测定
采用高效液相色谱法(HPLC)测定地黄叶提取液大孔树脂(D101)分离纯化过程中指标成分麦角甾苷的含量，并以此作为对照值用于建模。柚皮苷HPLC测定色谱条件为：DIAMOND-C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；甲醇-1％冰醋酸溶液(35∶65，v/v)为流动相；流速1.0mL/min；检测波长334nm；柱温40℃；进样量10μL。在建立模型时，吸附过程校正集样品中麦角甾苷的含量范围为0.01-15.18g/L，验证集样品中麦角甾苷的含量范围为0.03-14.41g/L；洗脱过程校正集样品中麦角甾苷的含量范围为0.01-17.28g/L，验证集样品中麦角甾苷的含量范围为0.11-16.08g/L。
(3)扫描样品的NIR透射光谱
光谱扫描范围4000～10000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，液体样品池为2mm光程的石英比色皿。实验采用空气为参比进行光谱采集，测量时环境温度为20℃，湿度为50％。附图9和附图10分别为吸附与洗脱过程样品的原始近红外光谱。
(4)光谱预处理
在全波段条件下，采用留一交互验证法比较了不同预处理方法对模型性能的影响。最终选择采用一阶导数+Norris卷积平滑+数据标准化(包括mean centering technique和variance scaling technique)对原始近红外光谱进行预处理，同时采用比例标度方法(Variance Scaling)，忽略个别光谱数据缩放对建模造成的影响。
(5)波段选择
采用(3)中预处理方法对原始光谱进行预处理，同时去除5000cm-1和7000cm-1附近的水和醇羟基两个强吸收带，然后采用相关系数法进行建模波段的选择。对于吸附过程，采用5600-6100cm-1波段进行建模，而对于洗脱过程，选择5500-6200cm-1波段进行建模。
(6)定量校正模型的建立
分别随机选择地黄叶吸附和洗脱过程前四批实验的其中一批作为验证集，其余三批作为校正集，在优化了光谱预处理方法和用于建模的波长区间后，采用PLS法建立测定地黄叶大孔树脂吸附和洗脱过程中麦角甾苷浓度的NIRS校正模型。采用一阶导数，Norris平滑法和数据标准化处理(MCT)之后，对于吸附过程，选择5500-6200cm-1这个波长区间进行建模；对于洗脱过程，选择5600-6100cm-1这个波长区间进行建模，吸附与洗脱模型的相关关系图见附图11和附图12。
(7)待测样品的预测
将两个定量模型分别用于预测校正集和验证集的麦角甾苷含量，根据HPLC测定值和NIR预测值分别绘制吸附过程泄漏点和终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图以及洗脱过程起点与终点HPLC测定值与NIR预测值曲线对照图，附图13-15显示NIR预测值与HPLC测定值趋于一致，表明本发明提供的方法可用于地黄叶提取液大孔树脂分离纯化过程关键点的判断，且比传统方法更加快速、简便。
本发明提供的一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的快速判别方法，通过建立中药大孔树脂吸附与洗脱过程的近红外PLS多元校正模型，可以实现大孔树脂分离纯化过程中药液指标成分吸附与洗脱过程有效成分含量曲线的快速检测。该方法简便快捷，同传统方法相比，可以节省大量的分析时间，实时准确，从而为发展中药等天然药物实时在线监测技术提供了新的方法，也为中药生产过程在线质量控制技术提供了思路。
Claims (5)
1.一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，通过以下技术方案实现：
(1)设置大孔树脂近红外在线监测系统
该系统由树脂柱(1)、流量调节阀(2)、三通阀(3)、流通池(4)、光纤(5)、近红外光谱仪(6)、计算机(7)组成，在大孔树脂柱(1)流出口设置流量调节阀(2)，大孔树脂柱(1)流出口下端通过橡胶管连接接三通阀(3)b端，三通阀(3)a端通过橡胶管与流通池(4)下端连接，流通池(4)上端连接橡胶管，流通池(4)左右端连接光纤(5)，光纤(5)与近红外光谱仪(6)连接，近红外光谱仪(6)与计算机(7)连接，三通阀(3)c端用于样品收集；
(2)收集药液样品并采集近红外光谱图
在大孔树脂吸附和洗脱过程，设定间隔时间，在三通阀(3)c端分别进行药液样品收集，在收集样品之前扫描药液的近红外光谱图，以空气为背景，波段范围为4000-10000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1；
(3)测定样品中有效成分的含量
以药液中有效成分为大孔树脂分离纯化过程中的指标，采用HPLC法，分别测定每份样品中指标成分的含量；
(4)对近红外光谱进行预处理
分别选择吸附和洗脱过程的部分样品作为校正集样本，采用导数法、Norris卷积平滑法、Savitzky-Golay卷积平滑法、均值中心化法、方差标准化法对光谱进行预处理，并以相关系数R2和交叉验证误差均方根为评价指标选择最佳的光谱预处理方法；
(5)建立校正模型
采用相关光谱法合理去除水分子在6944cm-1和5155cm-1附近的两个强吸收峰，再根据校相关系数R2、正均方根误差、预测均方根误差、交叉验证误差均方根对建模波段进行局部修饰，确定最优建模波段和主因子数，然后采用偏最小二乘法建立近红外光谱与有效成分含量之间的校正模型；
(6)获得有效成分含量信息
将待测样品的近红外光谱代入步骤(5)中已经建立的校正模型中，预测待测样品中有效成分的含量，并绘制大孔树脂分离纯化过程吸附和洗脱过程预测值和HPLC测定值的曲线进行比较，以预测集相关系数R2和预测均方根误差为指标对模型预测性能进行评价；
(7)判别样品有效成分关键点
根据样品有效成分含量信息对关键点进行判断，所述关键点指吸附过程泄漏点和吸附过程终点以及洗脱过程起点与洗脱过程终点，
所述的吸附过程泄漏点是指吸附时流出液中目标有效成分泄漏率大于零，吸附过程终点是指吸附时流出液中目标有效成分含量泄漏率大于10％，所述的洗脱过程起点是指洗脱时流出液中出现目标有效成分，洗脱过程终点是指有效成分含量相对浓度变化率RCCRi趋于设定阈值时的取样点；
所述的目标有效成分泄漏率计算方法：
所述的样品有效成分含量相对浓度变化率RCCRi计算方法是：其中Ci、Ci+1分别为相邻两个取样点样品中有效成分含量。
2.根据权利要求1所述的一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，其特征在于，步骤(3)中，选择中药枳壳时，大孔树脂分离纯化过程中的药液有效成分以柚皮苷为指标；选择中药地黄叶时，大孔树脂分离纯化过程中的药液有效成分以麦角甾苷为指标；枳壳提取液大孔树脂纯化过程建模使用的波数范围为6500-7500cm-1，地黄叶提取液大孔树脂纯化过程建模使用的波数范围为5500-6200cm-1和5600-6100cm-1，有效成分含量测定的参比方法为HPLC法。
3.根据权利要求1所述的一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，其特征在于，步骤(4)中光谱预处理方法选用：一级导数法、二级导数法、Norris卷积平滑法、Savitzky-Golay卷积平滑法、均值中心化法或方差标准化法。
4.根据权利要求1所述的一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，其特征在于，步骤(5)建立模型时通过样品杠杆值、学生残差和样品的马氏距离来判断异常样品并将其剔除。
5.根据权利要求1所述的一种中药大孔树脂分离纯化过程关键点的判别方法，其特征在于，药液在流通池(4)中的流向为竖直方向由下往上。
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