CN104977271B - 一种红花醇沉过程有效成分近红外在线检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种红花醇沉过程有效成分近红外在线检测方法，包括①近红外在线检测循环管路；②在线采集红花醇沉液的近红外透射光谱及醇沉液样本；③采用高效液相色谱法和烘干称重法测得醇沉液样本中各质控指标(包括羟基红花黄色素A和可溶性固形物含量)信息；④采用偏最小二乘算法建立各质控指标模型；⑤将所建模型用于在线分析醇沉过程中各质控指标的变化趋势。本发明将近红外光谱技术用于红花醇沉过程，采用流通池结合光纤探头的方式，实现了红花醇沉过程中羟基红花黄色素A和可溶性固形物含量的在线定量分析，为红花醇沉过程的在线控制提供依据及有效的指导。

Description

一种红花醇沉过程有效成分近红外在线检测方法

技术领域

本发明属于近红外在线检测领域，具体涉及一种红花醇沉过程有效成分近红外在线检测方法。

背景技术

红花具有活血通络的功效，有效成分主要集中在水溶性红花黄色素，如羟基红花黄色素A等。醇沉工艺是红花药材中有效成分纯化以及去除杂质的常用工艺手段，直接关系到红花成品的功效和质量稳定性。目前，醇沉工艺的质量控制主要依靠经验和传统质量分析方法(HPLC等)，耗时费力，缺乏有效的指标性成分含量的实时监测手段，易造成不同批次醇沉液质量的不稳定，导致药品批次间的质量差异，以及原药材、能源、时间等的浪费。故研究发展红花醇沉过程中关键质控指标的在线检测方法，有助于解决红花醇沉过程中关键控制指标的质量控制问题，对于中药工业技术进步和产品质量升级具有重大现实意义。

近红外(NIR)光谱技术作为一种快速无损的绿色分析技术，具有快速分析、样品处理简单、无需消耗试剂等特点。近年来，近红外光谱技术已经越来越多的被应用于中药研究，包括药材产地鉴别、有效组分含量测定和制药过程的在线检测和监控。从近年来研究进展情况看来，近红外光谱分析技术是最有希望在中药生产过程实现在线检测及质量控制的过程分析技术之一。目前红花醇沉工艺过程一般不检测有效成分，或者手动离线检测有效成分，其检测过程中，容易污染药液，影响药液质量，此外，由于离线数据的提供往往都滞后于生产过程，无法及时反馈生产现状，容易造成生产成本的提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红花醇沉过程的在线检测方法。该方法的检测目标为实现红花醇沉过程中各质控指标的在线定量分析，为红花醇沉过程质量控制提供方法。

该方法包括以下步骤：

步骤1，安装近红外在线检测循环管路；

步骤2，在线采集红花醇沉液的近红外透射光谱及醇沉液样本；

步骤3，采用传统分析方法(高效液相色谱法和烘干称重法)测得醇沉液样本中各质控指标信息；

步骤4，剔除异常光谱；

步骤5，选择近红外光谱建模波段和预处理方法；

步骤6，用偏最小二乘算法建立各质控指标模型，并采用各模型评价指标考察模型性能；

步骤7，已建模型用于在线分析红花醇沉过程中各质控指标的变化趋势。

本发明具体方案如下：

(1)安装近红外在线检测循环管路：

近红外在线检测循环管路依次连接以下部件：变频离心泵、双联过滤器、手动阀1、流通池(含近红外光纤探头)、取样口、手动阀2。变频离心泵将醇沉罐内的醇沉药液输送至双联过滤器，过滤后经过手动阀1流过流通池，近红外光纤探头对流通池内的醇沉药液进行光谱采集，通过取样口取样流通池内的醇沉药液，流通池通过手动阀2与醇沉罐连通。

使用时，打开变频离心泵，醇沉液经由双联过滤器滤除固体颗粒后到达流通池，连接在流通池左右两边的光纤探头适时在线采集流通池中醇沉液的近红外光谱，最后醇沉液分为两路，一路回醇沉罐，另一路通过取样口，用于收集醇沉液样品。流通池及循环管路中醇沉液流速控制在2L/min以内。双联过滤器用于滤除醇沉液中的大部分固体杂质颗粒，过滤精度为80微米。

(2)在线采集红花醇沉液的近红外透射光谱及醇沉液样本：

采用透射法采集近红外光谱，光谱范围为4000cm^-1～12000cm^-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm^-1，以空气为参比。每隔1分钟在线采集通过流通池的醇沉液近红外光谱；每隔5分钟从取样口采集醇沉液样本。采集醇沉液样本的同时采集近红外光谱。收集不同批次醇沉过程中的醇沉液样品，随机选择其中1/4～1/3批次的数据作为验证集，其余样品作为校正集参与建模。

(3)采用传统分析方法(高效液相色谱法和烘干称重法)测得醇沉液样本中各质控指标信息：

所述的醇沉液样本的各质控指标包括羟基红花黄色素A和可溶性固形物含量。采用高效液相色谱法(HPLC)测定醇沉液样本中羟基红花黄色素A浓度；使用烘干称重法测定可溶性固形物含量。

a、HPLC色谱条件：Agilent eclipse C18分析柱(250×4.6mm，5μm)；甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液(v/v，26∶2∶72)为流动相；流速1mL/min；检测波长403nm；柱温40℃；进样量5μL。

醇沉液样本于1500r/min高速离心机中离心10分钟，滤过(0.45μm微孔滤膜)，取续滤液用于液相分析。

b.烘干称重法：醇沉液样本于1500r/min高速离心机中离心10分钟，取上清液用于可溶性固形物含量分析。烘干至恒重的扁形瓶(两次烘干后重量差小于5mg)称重X₀，取样品约10mL至扁形瓶，称重X₁，水浴蒸干，105℃烘5h，取出置干燥器内冷却30min，迅速称重X₂。可溶性固形物含量按下式计算：

可溶性固形物＝(X₂-X₀)/(X₁-X₀)×100％

(4)剔除异常光谱

醇沉过程中产生的气泡以及流通池中的固体颗粒都会影响近红外光谱的采集，导致异常光谱的产生。本发明计算光谱的马氏距离，并使用肖维勒(Chauvenet)准则剔除异常光谱。若测量值Xi(l≤i≤n)的残差满足|Vi|＞Wnσ则Xi被视为异常数据，予以剔除。其中，Vi为残差，σ为标准差，Wn可查表得到。

(5)选择近红外光谱建模波段和预处理方法；

采用一阶导数法(Savitzky-Golay平滑)和标准正交变换算法预处理近红外光谱数据，分别用于消除基线漂移、噪音及固体颗粒等对光谱的影响。在选择建模波段时需排除以下波段：4500～5450cm^-1波段，即“水峰”；7500～12000cm^-1波段，存在较大的噪声，且没有显著的特征吸收。然后，通过光谱和质控指标的相关系数确定建模波段。因此，对于可溶性固形物含量模型使用5450～7500cm^-1波段，对于羟基红花黄色素A模型则使用5450～6100cm^-1波段。

(6)使用偏最小二乘算法建立各质控指标模型，并采用各模型评价指标考察模型性能；

模型评价指标包括：模型评价指标包括相关系数(R)、校正集和验证集预测误差均方根(RMSEC、RMSEP)、校正集和验证集相对偏差(RSEC和RSEP)。当R值接近于1，RMSEC和RMSEP值相互接近且RMSEP小于2倍的RMSEC，RSEC和RSEP相互接近且小于20％时说明所见模型具有较好的稳定性和预测精度，可以用于红花醇沉过程的在线检测。

(7)将已建模型用于在线分析红花醇沉过程中各质控指标的变化趋势。

在线采集红花醇沉液的近红外光谱图，将光谱数据输入到校正模型中，经过计算即可实时得知醇沉液中各质控指标的信息。

本发明将近红外在线分析技术引入到红花醇沉过程，实现对各质控指标(羟基红花黄色素A和可溶性固形物含量)的实时监测，有利于提高红花醇沉过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。

附图说明

图1是醇沉过程近红外在线检测系统简图。

图2是偏最小二乘模型在线分析红花醇沉过程中羟基红花黄色素A浓度预测值与实际测定值的趋势对照图。

图3是偏最小二乘模型在线分析红花醇沉过程中可溶性固形物含量预测值与实际测定值的趋势对照图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例做进一步的说明。

实施例1：

1.安装近红外在线检测循环管路

近红外在线检测循环管路依次连接以下部件：变频离心泵、双联过滤器、手动阀1、流通池(含近红外光纤探头)、取样口、手动阀2。变频离心泵将醇沉罐内的醇沉药液输送至双联过滤器，过滤后经过手动阀1流过流通池，近红外光纤探头对流通池内的醇沉药液进行光谱采集，通过取样口取样流通池内的醇沉药液，流通池通过手动阀2与醇沉罐连通。

使用时，打开变频离心泵，醇沉液经由双联过滤器滤除固体颗粒后到达流通池，连接在流通池左右两边的光纤探头适时在线采集流通池中醇沉液的近红外光谱，最后醇沉液分为两路，一路回醇沉罐，另一路通过取样口，用于收集醇沉液样品。流通池及循环管路中醇沉液流速控制在2L/min以内。双联过滤器用于滤除醇沉液中的大部分固体杂质颗粒，过滤精度为80微米。

2.近红外光谱和醇沉液样本的在线采集

醇沉罐内开始加醇时作为醇沉过程计时零点。醇沉过程中每隔1分钟在线采集醇沉液近红外光谱图，每隔5分钟从取样口采集醇沉液样本。近红外在线检测系统参见图1。所取样本分别用于羟基红花黄色素A和可溶性固形物含量的测定。重复15批红花的醇沉实验，每批次的实验都以相同方式进行取样和采集光谱。计算所有近红外光谱的马氏距离，并使用肖维勒(Chauvenet)准则剔除异常光谱。若测量值Xi(l≤i≤n)的残差满足|Vi|＞Wnσ则Xi被视为异常数据，予以剔除。其中，Vi为残差，σ为标准差，Wn可查表得到。根据计算结果，有11个样本的光谱异常，将这些样本剔除后剩余数据用于建立定量模型。

3.各指标成分浓度和可溶性固形物含量的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定醇沉液样本中羟基红花黄色素A浓度。使用烘干称重法测定可溶性固形物含量。

4.选择近红外光谱建模波段和预处理方法

采用一阶导数法(Savitzky-Golay平滑)和标准正交变换算法预处理近红外光谱数据，分别用于消除基线漂移、噪音及固体颗粒等对光谱的影响。

在选择建模波段时需排除以下波段：4500～5445cm^-1波段，即“水峰”；7500～12000cm^-1波段，存在较大的噪声，且没有显著的特征吸收。为了保证光谱选择区域的准确性，本发明对光谱和质控指标的相关系数进行了考察。选择相关系数大于0.8的光谱区域，根据计算结果，可溶性固形物含量模型使用5445～7500cm^-1波段，羟基红花黄色素A模型则使用5445～6100cm^-1波段。

5.采用偏最小二乘回归算法建立各质控指标模型

在适当波段范围内，采用一阶导数法(Savitzky-Golay平滑)和标准正交变换算法预处理方法，剔除异常光谱后将剩余数据用于建立偏最小二乘回归模型。可溶性固形物含量和羟基红花黄色素A的校正和验证结果见表1。可以看出，偏最小二乘回归模型的校正集和验证集相关系数均大于0.96，RMSEC和RMSEP值较小而且互相接近，RSEP值都能控制在10％以内。各质控指标偏最小二乘回归模型的校正和验证结果相近，泛化能力强，具有较好的模型稳定性和预测能力。

表1各质控指标偏最小二乘回归模型的校正和验证结果比较

6.在线分析醇沉过程中各质控指标变化趋势

将所建偏最小二乘回归模型用于在线分析5批红花醇沉过程中可溶性固形物含量和羟基红花黄色素A浓度，所得数据归为未知样品集，预测结果如表2所示。通过对比校正集、验证集和未知样品集的各模型评价指标值可以看出，偏最小二乘回归模型具有较高的预测准确度。各质控指标模型的RMSEC值和RMSEP值均与校正集和验证集结果相似，并且RMSEP值小于2倍RMSEC，RSEP值也都控制在10.3％以内。

采用偏最小二乘回归模型在线分析某一批次红花醇沉过程，各质控指标的预测趋势与实际测定值参见图2～3。从图中可以看出，各质控指标的预测趋势与实际测定值的变化趋势基本一致，能够满足中药生产过程实时分析的精度要求。

表2各质控指标偏最小二乘回归模型的在线分析结果(未知样品集)

Claims (1)

1.一种红花醇沉过程有效成分近红外在线检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)安装近红外在线检测循环管路

近红外在线检测循环管路依次连接以下部件：变频离心泵、双联过滤器、手动阀1、流通池，含近红外光纤探头、取样口、手动阀2，变频离心泵将醇沉罐内的醇沉药液输送至双联过滤器，过滤后经过手动阀1流过流通池，近红外光纤探头对流通池内的醇沉药液进行光谱采集，通过取样口取样流通池内的醇沉药液，流通池通过手动阀2与醇沉罐连通；

使用时，打开变频离心泵，醇沉液经由双联过滤器滤除固体颗粒后到达流通池，连接在流通池左右两边的光纤探头适时在线采集流通池中醇沉液的近红外光谱，最后醇沉液分为两路，一路回醇沉罐，另一路通过取样口，用于收集醇沉液样品，流通池及循环管路中醇沉液流速控制在2L/min以内，双联过滤器用于滤除醇沉液中的大部分固体杂质颗粒，过滤精度为80微米；

(2)在线采集红花醇沉液的近红外透射光谱及醇沉液样本

采用透射法采集近红外光谱，光谱范围为4000cm^-1～12000cm^-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm^-1，以空气为参比，每隔1分钟在线采集通过流通池的醇沉液近红外光谱；每隔5分钟从取样口采集醇沉液样本；采集醇沉液样本的同时采集近红外光谱，收集不同批次醇沉过程中的醇沉液样品，随机选择其中1/4～1/3批次的数据作为验证集，其余样品作为校正集参与建模，

(3)采用传统分析方法,高效液相色谱法和烘干称重法,测得醇沉液样本中各质控指标信息

所述的醇沉液样本的各质控指标包括羟基红花黄色素A和可溶性固形物含量，采用高效液相色谱法测定醇沉液样本中羟基红花黄色素A浓度；使用烘干称重法测定可溶性固形物含量，

a、HPLC色谱条件：AgilenteclipseC18分析柱，250×4.6mm，5μm；甲醇-乙腈-0.7％磷酸溶液，v/v，26∶2∶72为流动相；流速1mL/min；检测波长403nm；柱温40℃；进样量5μL，

醇沉液样本于1500r/min高速离心机中离心10分钟，滤过，0.45μm微孔滤膜，取续滤液用于液相分析，

b.烘干称重法：醇沉液样本于1500r/min高速离心机中离心10分钟，取上清液用于可溶性固形物含量分析，烘干至恒重的扁形瓶，两次烘干后重量差小于5mg，称重X0，取样品约10mL至扁形瓶，称重X1，水浴蒸干，105℃烘5h，取出置干燥器内冷却30min，迅速称重X2，可溶性固形物含量按下式计算：

可溶性固形物＝(X2-X0)/(X1-X0)×100％

(4)剔除异常光谱

醇沉过程中产生的气泡以及流通池中的固体颗粒都会影响近红外光谱的采集，导致异常光谱的产生，本发明计算光谱的马氏距离，并使用肖维勒准则剔除异常光谱，若测量值Xi(1≤i≤n)的残差满足|Vi|＞Wnσ则Xi被视为异常数据，予以剔除，其中，Vi为残差，σ为标准差，Wn可查表得到，

(5)选择近红外光谱建模波段和预处理方法：

采用一阶导数法，Savitzky-Golay平滑和标准正交变换算法预处理近红外光谱数据，分别用于消除基线漂移、噪音及固体颗粒对光谱的影响，在选择建模波段时需排除以下波段：4500～5450cm^-1波段，即“水峰”；7500～12000cm^-1波段，存在较大的噪声，且没有显著的特征吸收，然后，通过光谱和质控指标的相关系数确定建模波段，因此，对于可溶性固形物含量模型使用5450～7500cm^-1波段，对于羟基红花黄色素A模型则使用5450～6100cm^-1波段，

(6)使用偏最小二乘算法建立各质控指标模型，并采用各模型评价指标考察模型性能

模型评价指标包括：模型评价指标包括相关系数，R、校正集和验证集预测误差均方根，RMSEC、RMSEP、校正集和验证集相对偏差，RSEC和RSEP，当R值接近于1，RMSEC和RMSEP值相互接近且RMSEP小于2倍的RMSEC，RSEC和RSEP相互接近且小于20％时说明所见模型具有较好的稳定性和预测精度，可以用于红花醇沉过程的在线检测，

(7)将已建模型用于在线分析红花醇沉过程中各质控指标的变化趋势在线采集红花醇沉液的近红外光谱图，将光谱数据输入到校正模型中，经过计算即可实时得知醇沉液中各质控指标的信息。