CN112414962B - 一种测定羟基红花黄色素a含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定羟基红花黄色素A含量的方法，涉及羟基红花黄色素A含量的测定领域。使用时，仅仅需要采用紫外光谱数学模型即可快速地检测出待测品中羟基红花黄色素A的含量。该方法具有如下的技术效果：方法简单、耗时较少，检测所需要的仪器设备便宜，检测成本低廉，且不产生有机溶剂、废气和废液。检测方法获得的结果准确，且重复性良好。
Description
技术领域
本发明涉及羟基红花黄色素A含量的测定领域，具体而言，涉及一种测定羟基红花黄色素A含量的方法。
背景技术
羟基红花黄色素A在红花黄色素提取物中的含量较高，作为红花活血化瘀活性有效成分之一。其结构稳定性较差，遇热，遇光不稳定，因此其标定难度较高。现有的标定方法是采用高效液相色谱法进行含量检测的。目前，高效液相色谱虽然能实现羟基红花黄色素A含量的准确测定，但是存在色谱仪昂贵，耗费时间长，操作要求高，推广应用难度大等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定羟基红花黄色素A含量的方法以解决上述技术问题。
针对现有的测定方法面临需要采用价格昂贵的高效液相色谱仪、需要花费大量的时间(对照品的配置、样品的制备、流动相的制备、检测)等问题。本发明提供了一种紫外光谱法对羟基红花黄色素A的含量的快速测定。
本发明是这样实现的：
一种测定羟基红花黄色素A含量的方法，方法采用紫外光谱法，方法包括如下步骤：取待测品，用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描，分别获得待测样本在217nm、227nm、267nm、292nm、403nm、450nm、480nm和500nm下的吸光度，依次记为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9，然后将上述吸光度代入如下的模型中进行计算获得待测品的羟基红花黄色素A含量Y；
模型为：
Y＝-0.114*X1+0.0694*X2-0.0201*X3-0.0907*X4+1.059*X5+0.744*X6-0.110*X7-0.272*X8-0.278*X9-0.043；
在一种实施方式中，上述待测品为红花注射液。
使用时，仅仅需要采用上述的紫外光谱数学模型即可快速地检测出待测品中羟基红花黄色素A的含量。该方法具有如下的技术效果：方法简单、耗时较少，检测所需要的仪器设备便宜，且不产生有机溶剂、废气和废液。
上述数学模型是发明人经过长期的试验提出的可用于红花注射液中羟基红花黄色素A的含量测定的模型。只需采用紫外光谱法对待测品进行光谱分析，将获得的吸光度代入上述方程求出Y即为待测品的羟基红花黄色素A含量。经过多次的模型检验，结果显示本发明提供的模型的预测值与实测值相关性良好，可以用于快速分析红花注射液中的羟基红花黄色素A的含量，且结果准确。
在一种实施方式中，将稀释后的待测品用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描。
在一种实施方式中，上述稀释后的待测品是指稀释后的待测品在200nm±30nm处的吸光度小于3.0，且在400nm±30nm处的吸光度大于0.2。
需要说明的是，上述的稀释倍数为经验范围值，在实际的实施方式中，可以根据紫外光谱信号的强度进行自适应选择，并不限于上述的稀释倍数范围内。待测品的吸光度在200nm附近吸光度小于3.0，400nm附近的吸光度大于0.2时，其紫外光谱信号较为稳定。
在一种实施方式中，将稀释200-250倍后的待测品用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描。
可选的，上述将待测品稀释至210倍、215倍、220倍、230倍、240倍或250倍。
一种测定羟基红花黄色素A含量的方法，方法包括利用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计对待测品在X波长下进行光谱扫描，将获得的吸光度数据作为建模的自变量，并利用高效液相色谱对待测品中羟基红花黄色素A的含量进行检测，检测后的羟基红花黄色素A的含量作为因变量，建立羟基红花黄色素A的含量检测模型；
采用紫外光谱法对新的待测样本进行羟基红花黄色素A含量的测定，获得的吸光度值代入建立的羟基红花黄色素A的含量检测模型中；
在X波长范围下进行光谱扫描是指在200-600nm波长范围下进行光谱扫描。
需要说明的是，上述X波长范围下进行光谱扫描是指获得待测物在一定波长范围内的吸光度数据。
可选的，利用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计对待测品在X波长下进行光谱扫描时，扫描步进为1nm，扫描速度选择中速。在其他实施方式中，也可以根据需要设置扫描的步进和速度。
在一种实施方式中，上述羟基红花黄色素A的含量检测模型的建立包括根据因变量和自变量，利用偏最小二乘线性回归法，得到回归系数及相应的羟基红花黄色素A的含量检测模型。
在一种实施方式中，上述采用紫外光谱法对新的待测样本进行羟基红花黄色素A含量的测定并将获得的吸光度值代入建立的羟基红花黄色素A的含量检测模型包括：取新的待测样本，用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描，分别获得新的待测样本在X波长下的吸光度，然后将上述吸光度代入建立的羟基红花黄色素A的含量检测模型中进行计算获得新的待测样本中羟基红花黄色素A含量。
待测品与新的待测样本均为红花注射液。
需要说明的是，当构建完成羟基红花黄色素A的含量检测模型后，该模型即可适用于该待测物类型的羟基红花黄色素A的含量检测。例如，以红花注射液为待测品构建了羟基红花黄色素A的含量检测模型，那么该模型适用于其他样本的红花注射液中羟基红花黄色素A检测。
在一种实施方式中，上述方法还包括进行模型的检验，模型的检验包括：取已知浓度的待测品用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描，获得已知浓度的待测品在X波长下的吸光度，然后将已知浓度的待测品在X波长下的吸光度代入建立的羟基红花黄色素A的含量检测模型中进行计算得到实测值，比较实测值与已知浓度的相关性。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种测定羟基红花黄色素A含量的方法，使用时，仅仅需要采用紫外光谱数学模型即可快速地检测出红花注射液中羟基红花黄色素A的含量。该方法具有如下的技术效果：方法简单、耗时较少，检测所需要的仪器设备便宜，检测成本低廉，且不产生有机溶剂、废气和废液。检测方法获得的结果准确，且重复性良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为羟基红花黄色素A的紫外光谱图；
图2为建模组样本S1-S10预测结果与实测值相关图；
图3为稀释250倍后的红花注射液紫外光谱；
图4为检验组CH1-CH20预测结果与实测值相关图；
图5为红花注射液403nm下的液相色谱图；
图6为重复性试验光谱堆叠图；
图7为精密度试验光谱堆叠图；
图8为稳定性试验光谱堆叠图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
为探究紫外光谱快速检测羟基红花黄色素的可行性，本实施例先用全波长扫描(200-600nm)羟基红花黄色素A的紫外光谱，结果参照图1所示。从图1中可以看出，羟基红花黄色素A在227nm、392nm、403nm处存在强吸收峰。由此可知，227nm、392nm、403nm吸收波长是潜在建模波长。
进一步地，利用高效液相色谱法，采用DAD检测器，检测红花注射液的图谱，计算不同吸收光谱下羟基红花黄色素峰与非羟基红花黄色素峰面积比例，结果见表1。从表1中可以看出在403nm处，羟基红花黄色素A占总峰面积比例最大，但占有比例只达到30.5％。表明若只403nm波长的吸光度进行羟基红花黄色素A的定量分析，结果会不准确。因此需要基于吸光度建立数学模型。图5中列举出了红花注射液在403nm下的高效液相色谱图。
高效液相色谱法检测的色谱条件与系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-含0.5％三乙胺的1％冰醋酸溶液(9:91)为流动相，检测波长为403nm，柱温为30℃，理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于6000。
对照品溶液的制备：取分析纯羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.1mg羟基红花黄色素A对照品的溶液，即得对照品溶液。
测定方法包括如下步骤：分别精密吸取对照品溶液与红花注射液各10μl，注入液相色谱仪，测定羟基红花黄色素A的峰面积，得到如下表1的数据。
表1不同检测波长下羟基红花黄色占总峰面积的统计表。
实施例1
本实施例提供了一种测定红花注射液中羟基红花黄色素A含量的方法。其包括如下步骤：
(1)取待测红花注射液稀释250倍，然后用紫外可见光分光光度计进行波长扫描，扫描波长范围为(200～600nm)，扫描步进为1nm，扫描速度选择中速。
(2)分别获得测定待测红花注射液在217nm、227nm、267nm、292nm、403nm、450nm、480nm和500nm下的吸光度，然后将上述吸光度代入如下的数学模型中进行计算获得羟基红花黄色素A含量；
数学模型为：
Y＝-0.114*X1+0.0694*X2-0.0201*X3-0.0907*X4+1.059*X5+0.744*X6-0.110*X7-0.272*X8-0.278*X9-0.043；
待测红花注射液在217nm、227nm、267nm、292nm、403nm、450nm、480nm和500nm下的吸光度分别对应为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9；
Y为待测红花注射液的羟基红花黄色素A含量。
实施例2
本实施例提供了一种测定红花注射液中羟基红花黄色素A含量的方法。其包括构建模型和模型的检验，具体包括：
(1)构建模型
利用高效液相色谱法检测样品羟基红花黄色素A的含量作为因变量。具体的，取红花注射液，用高效液相色谱法检测其含量。编号S1-S10的样本是取自不同样本的红花注射液，用于建模用；而编号CH1-CH20的样本是取自与S1-S10完全不同的红花注射液，用于后续模型的检验用。
检测结果参照表2所示。表2中还示出了另外的20批红花注射液经过高效液相色谱检测后的羟基红花黄色素A的含量。
表2红花注射液羟基红花黄色素A检测结果。
然后用紫外可见光分光光度仪对编号S1-S10的样本进行紫外吸收检测。检测波长分别为217nm、227nm、267nm、292nm、403nm、450nm、480nm和500nm。编号S1-S10的样本在上述波长下的紫外吸收数据参照表3所示。
表3编号S1-S10的样本的紫外吸收数据。
进一步地，将表2中编号S1-S10的样本建模用数据和表3中的紫外吸收数据导入spss软件，利用偏最小二乘线性回归法，对数据进行处理，结果得到回归系数，回归系数参照表4所示。
表4偏最小二乘线性回归系数
| 项目 | 系数 |
| 常数 | -0.043 |
| 变量1 | -0.114 |
| 变量2 | 0.069 |
| 变量3 | -0.020 |
| 变量4 | -0.091 |
| 变量5 | 1.059 |
| 变量6 | 0.744 |
| 变量7 | -0.110 |
| 变量8 | -0.273 |
| 变量9 | -0.279 |
将表3所示的编号S1-S10的样本紫外吸收数据分别与表4中相应的系数进行乘积求和，再计算与原来的因变量(即为表2中S1-S10中建模用数据)的相关性，结果相关系数为0.998。说明模型预测与实际值相关性良好。
得到如下预测模型：
Y＝-0.114*X1+0.0694*X2-0.0201*X3-0.0907*X4+1.059*X5+0.744*X6-0.110*X7-0.272*X8-0.278*X9-0.043r＝0.998
例如，对于样本编号S1，X1指代217nm的变量1(即为吸光度值)，吸光度值为1.667；X2指代227nm的变量2，吸光度值为1.319；X3指代267nm的变量3，吸光度值为1.029；X4指代292nm的变量4，吸光度值为0.803；X5指代392nm的变量5，吸光度值为0.263；X6指代403nm的变量6，吸光度值为0.236；X7指代450nm的变量7，吸光度值为0.09；X8指代480nm的变量8，吸光度值为0.033；X9指代500nm的变量9，吸光度值为0.02。将上述X1-X9代入上述预测模型中，即可求出实测值Y实，然后将实测值Y实与表2中的编号为S1-S10的建模用数据(即为羟基红花黄色素A的预测含量)进行相关性分析，分析图参照图2所示(同样的方式计算样本编号S2-S10，得到图2)。
实验例1
本实验例取红花注射液，分别稀释100倍、250倍、500倍，以200nm附近吸光度小于3.0，且400nm附近的吸光度大于0.2为选择依据。紫外光谱数据参照图3所示，由图3可知，当红花注射液稀释250倍时，紫外光谱信号较好。
实验例2
本实验例对实施例2中的数学模型进行检验，具体地将表5所示的紫外光吸收数据代入实施例2所示的数学模型中进行检验计算，并计算预测结果与实测值的相关性，结果见图4。从图4中可以知道，预测值与实测值相关性良好。相关系数为0.989。说明本模型用于模型外数据含量预测，结果准确。
表5编号为CH1-CH20样本的紫外吸收数据。
实验例3
本实验例进行重复性实验。取同一批红花注射液，用纯化水稀释250倍，共六份。分别在200～600nm波长下进行紫外光谱扫描，重复性试验光谱堆叠图参照图6所示。结果显示6个样品的紫外光谱重合，说明本发明提供的检测方法重复性良好。检测步骤参照实施例1所示。
实验例4
本实验例进行仪器的精密度试验。取同一配制好的供试品(红花注射液)，在200～600nm波长下连续紫外光谱扫描六次。精密度试验光谱堆叠图参照图7所示，结果显示6次检测的紫外光谱重合，说明仪器精密度良好。
实验例5
本实验例进行样品的稳定性试验，取红花注射液适量，用纯化水稀释250倍，分别于0小时、1小时、2小时、4小时和6小时下进行200～600nm波长扫描。稳定性试验光谱堆叠图参照图8所示，结果显示，待测样品在2小时检测时，紫外光谱发生了微小变化，表面样品暴露于空气中时，稳定性较差。
即采用本方法进行待测样品的检测时，需要及时配制待测液，及时检测。
本发明基于红花注射液紫外光谱数据和对应批次的高效液相色谱检测的羟基红花黄色素A含量检测数据，建立的一个最终只以紫外光谱数据为基础的羟基红花黄色素A含量检测模型。该检测模型建立后，可以广泛用于企业的产品质量控制，仅使用分光度计检测，就可以实现羟基红花黄色素A的含量测定，而无需高效液相色谱检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，所述方法采用紫外光谱法，所述方法包括如下步骤：取新的待测样本，用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描，分别获得新的待测样本在217nm、227nm、267nm、292nm、392nm、403nm、450nm、480nm和500nm下的吸光度，依次记为X1、X2 、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9，然后将上述吸光度代入如下的模型中进行计算获得新的待测样本的羟基红花黄色素A含量Y；
所述模型为：
Y=-0.114*X1+0.0694*X2-0.0201*X3-0.0907*X4+1.059*X5+0.744*X6-0.110*X7 -0.272*X8 -0.278*X9-0.043；
所述新的待测样本为红花注射液。
2.根据权利要求1所述的测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，将稀释后的新的待测样本用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描。
3.根据权利要求2所述的测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，稀释后的新的待测样本是指稀释后的新的待测样本在200nm±30nm处的吸光度小于3.0，且在400nm±30nm处的吸光度大于0.2。
4.根据权利要求3所述的测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，将稀释200-250倍后的新的待测样本用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描。
5.一种测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，所述方法包括利用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计对待测品在X波长下进行光谱扫描，将获得的吸光度数据作为建模的自变量，并利用高效液相色谱对待测品中羟基红花黄色素A的含量进行检测，检测后的羟基红花黄色素A的含量作为因变量，建立羟基红花黄色素A的含量检测模型；采用紫外光谱法对新的待测样本进行羟基红花黄色素A含量的测定，分别获得新的待测样本在217nm、227nm、267nm、292nm、392nm、403nm、450nm、480nm和500nm下的吸光度，依次记为X1、X2 、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9，获得的吸光度值代入建立的羟基红花黄色素A的含量检测模型中计算获得新的待测样本的羟基红花黄色素A含量Y；
在X波长范围下进行光谱扫描是指在200-600nm波长范围下进行光谱扫描；
所述待测品与新的待测样本均为红花注射液；
所述羟基红花黄色素A的含量检测模型为：
Y=-0.114*X1+0.0694*X2-0.0201*X3-0.0907*X4+1.059*X5+0.744*X6-0.110*X7 -0.272*X8 -0.278*X9-0.043。
6.根据权利要求5所述的测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，所述羟基红花黄色素A的含量检测模型的建立包括根据因变量和自变量，利用偏最小二乘线性回归法，得到回归系数及相应的羟基红花黄色素A的含量检测模型。
7.根据权利要求6所述的测定羟基红花黄色素A含量的方法，其特征在于，所述方法还包括进行模型的检验，所述模型的检验包括：取已知浓度的待测品用紫外分光光度计或紫外可见光分光光度计进行波长扫描，获得已知浓度的待测品在X波长下的吸光度，然后将所述已知浓度的待测品在X波长下的吸光度代入建立的羟基红花黄色素A的含量检测模型中进行计算得到实测值，比较实测值与已知浓度的相关性。
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