CN102028710B - 一种测定华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种测定华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱含量的方法。醇沉法是华蟾素注射液生产的关键单元操作，针对醇沉过程建立一种快速有效的含量分析方法尤为重要。该方法先收集具有代表性的醇沉液样本作为校正集，采用紫外可见分光光度法测定吲哚类生物碱含量，同时扫描其近红外原始光谱图，选择合适的光谱预处理方法、建模谱段和主因子数，利用化学计量学方法，构建醇沉液样本吲哚类生物碱的近红外定量校正模型，对未知含量的华蟾素醇沉液样本进行快速的含量测定。本发明的具有快速、无损、准确的优点，可有效解决醇沉过程中缺乏质量监控和批次差异的问题，为中药过程质量控制提供一种新的思路和手段。

Description

一种测定华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱含量的方法

技术领域

本发明属于中药生产过程的质量检测方法，涉及一种近红外光谱技术快速测定华蟾素注射液醇沉工艺过程中醇沉液吲哚类生物碱含量的检测方法。

背景技术

华蟾素注射液是干蟾皮经提取制成的灭菌水溶液，具有消肿、止痛、解毒的功效，主要用于治疗中、晚期肿瘤，慢性乙型肝炎等症，还可以用于急性血播型肺结核、流行性出血热、顽固性呃逆和小儿流腮并发脑膜炎等症。由于华蟾素注射液具有较好的抗癌作用，目前被列为国家基本医疗保险药品甲类和国家中药保护品种。

华蟾素注射液的生产工艺流程由提取、浓缩、醇沉等多个工艺组成。醇沉法是中药注射剂生产的关键单元操作，主要可以去除蟾皮提取液中多肽、脂肪酸、甾醇等大分子化合物，达到有效成分的纯化和富集。目前相关报道中，“华蟾素胶囊的制造方法”(专利申请号：98103562.0)和“一种新的华蟾素冻干粉针及其制备方法和质量控制方法”(专利申请号：200510061288.4)提出了水提醇沉的方法，最大程度的获得吲哚类总生物碱。但以上研究方法只是对工艺优化和最终醇沉产品进行含量测定，缺乏对生产过程的快速检测和优化控制。

中药部颁标准中采用分光光度法，以5-羟色胺为对照品，二甲氨基苯甲醛盐酸为显色剂的华蟾素注射液中吲哚类总生物碱的含量测定方法。“蟾皮总碱及其制备和分析方法以及其制剂”(专利申请号：200710020339.8)建立了反相高效液相法测定蟾皮总碱的方法。但是以上方法耗时、繁琐，远不能满足中药生产过程的实时分析和快速测定的要求。

近红外光谱技术是一种快速无损的绿色分析技术，其分析速度快、样品处理简单、无需消耗试剂等特点，广泛应用在中药生产的提取、浓缩、混合、大孔树脂纯化等多个单元操作中。作为适用于快速检测和在线分析的成熟手段之一，近红外光谱技术已经应用在多种中药制剂中。“一种中药六味地黄丸生产过程的近红外光谱在线检测方法”(专利申请号：200910195764.X)针对六味地黄丸水提和醇提工艺，建立了近红外在线检测的定量模型，解决了传统离线方法成本高、效率低等问题。“复方杜仲胶囊有效成分的近红外光谱在线检测方法”(专利申请号：201010118938.5)中建立近红外数学模型，对生产的工艺关键点如动态逆流提取、三效浓缩、喷雾干燥等进行有效成分的检测。但目前报道中，极少将近红外光谱技术应用在醇沉过程中有效成分的快速分析。本发明将近红外光谱技术应用于华蟾素注射液醇沉过程中吲哚类生物碱的测定，可以实现指标成分的实时监测，最大程度降低批次间的差异性，有助于提高中药产品的稳定性、安全性和有效性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种测定华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱含量的方法；本方法通过预先建立华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱的近红外数学模型，并将此模型用于醇沉过程中吲哚类生物碱的定量分析，实现对整个过程的快速分析，以提高过程单元的质量监测力度，达到保证最终产品质量的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

(1)校正集醇沉液样本的收集：

收集不同批次华蟾素醇沉过程中获取的不少于50份的华蟾素醇沉液样本；

(2)校正集醇沉液样本吲哚类生物碱含量参照值的测定：

采用紫外可见分光光度法测定华蟾素醇沉液样本中吲哚类生物碱(以5-羟色胺计)的含量，并将此含量作为对照值；

(3)校正集醇沉液样本的近红外透射光谱的采集：

使用近红外光谱仪在光谱扫描范围4000～10000cm^-1扫描采集的醇沉液样本，每份样本多次测量求其平均光谱；

(4)校正模型的建立：

模型建立前对校正集光谱进行异常点判别以提高模型精度，同时原始光谱在平滑、微分等合适的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，缩短建模时间；即筛选近红外光谱预处理方法，选择建模波段，确定最佳主因子数，运用化学计量学软件处理数据，应用偏最小二乘法(PLS)建立醇沉液样本吲哚类生物碱的近红外定量分析模型；

(5)未知样本的吲哚类生物碱的快速测定：

重新收集华蟾素醇沉过程中未知样本，使用近红外光谱仪在光谱扫描范围4000～10000cm^-1测量其近红外光谱数据，按照校正模型中相同的光谱预处理方法和波段处理，输入到已建立的近红外校正模型中，经过模型计算和预测即可得知未知样本中吲哚类生物碱的含量信息。

步骤(1)校正集醇沉液样本的收集，是将蟾皮水提得到的提取液浓缩至密度1.10-1.15g/mL，取该水提浓缩液置于保温40-60℃的醇沉罐中，在机械搅拌转速200-500rpm下，加入95％(v/v)乙醇直到使药液终点乙醇浓度70％-80％(v/v)，且边加乙醇边定时取样。

步骤(3)近红外光谱采集方式及条件为：以内置背景为参比，光谱扫描范围4000～10000cm^-1，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次。每个样品作3次平行扫描，取平均作为样品的近红外光谱。

步骤(4)所述光谱预处理方法包括一阶微分、二阶微分、Savitsky-Golay平滑和Norris导数滤波平滑，波段选择包括全波长、8745-8304cm^-1、7483-6227cm^-1和6020-5634cm^-1及其组合，最佳主因子数的讨论。

本发明采用的近红外光谱技术快速测定醇沉液吲哚类生物碱含量的方法，简便、无损、准确、快速。与传统的紫外可见分光光度法相比，测定时间由原来的40分钟缩短至2分钟，不需要对样品进行预处理，节省了人力物力，本发明有望能够解决华蟾素醇沉过程中传统离线检测成本高、耗时长、效率低的难题，减少最终产品批次间差异性，为华蟾素注射液及其相关制剂的质量提升提供保障。醇沉法是华蟾素注射液生产的关键单元操作，针对醇沉过程建立一种快速有效的含量分析方法尤为重要。可有效解决醇沉过程中缺乏质量监控和批次差异的问题，为中药过程质量控制提供一种新的思路和手段。

附图说明

图1是华蟾素醇沉液的近红外原始光谱图。

图2是经平滑后华蟾素醇沉液的近红外光谱一阶导数图。

图3是PLS定量校正模型中最佳主因子数和交叉验证结果图。

图4是华蟾素醇沉液吲哚类生物碱含量PLS定量校正模型的预测值和参考值之间的相关关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例作进一步的说明，但本发明并不限于此。

实施例1

1校正集醇沉液样本的收集

将蟾皮水提得到的提取液浓缩至密度为1.12g/mL，取该水提浓缩液1L置于醇沉罐中，在保温40℃下，保持机械搅拌转速为300rpm，以60mL/min的流速加入95％(v/v)乙醇直到使药液终点乙醇浓度70％(v/v)。醇沉过程持续50min，一边加入乙醇的同时，一边定时取样。收集4个批次的华蟾素醇沉过程样本共55份，作为校正集样本进行模型建立。

2校正集醇沉液样本吲哚类生物碱含量参照值的测定

(1)对照品溶液的制备：精密称取5-羟色胺对照品15mg，置于100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度作为储备液。又精密吸取10.0mL置于25mL容量瓶中，加水定容，备用。

(2)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置10ml容量瓶中，加水使成5ml，摇匀，加20％对二甲氨基苯甲醛盐酸(2→3)溶液至刻度，摇匀，显色30分钟。照紫外可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录VA)，以相应试剂为空白，在555nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得吸光度与浓度的回归方程为：Y＝16176.24X-101.96，R²＝0.9995，结果表明吲哚类生物碱在0.0412-1.030mg/mL范围内线性关系良好。

(3)吲哚类生物碱含量测定：精密量取醇沉液样品1ml稀释至相应倍数，按照对照品溶液显色方法依法测定吸光度，按照标准曲线计算吲哚类生物碱含量。测得的校正集样本中吲哚类生物碱含量分布范围在0.58-4.15mg/mL。

3校正集醇沉液样本的近红外透射光谱的采集

使用近红外光谱仪，以空气为参比，采集校正集样本近红外投透射光谱。

近红外光谱技术参数的选择：光谱扫描范围4000～10000cm^-1，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次。每个样品作3次平行扫描，取平均作为样品的近红外光谱。采集华蟾素醇沉液的原始近红外光谱参见图1。

4校正模型的建立

运用化学计量学软件(Thermo Nicolet公司Omnic软件)中的偏最小二乘法(PLS)建立醇沉液样本吲哚类生物碱近红外定量分析模型。模型建立前，首先对校正集中原始光谱进行平滑、微分等适宜的光谱预处理，选择最优的波段提取有效信息，确定最适主因子数，通过留一交互验证法判断最优模型参数。

(1)近红外光谱预处理方法筛选

对原始光谱分别进行了一阶微分、二阶微分、Savitsky-Golay平滑和Norris导数滤波平滑等、对比研究了各种光谱预处理方法对所得模型中R²和RMSECV的影响，结果参见表1。结果表明，原始光谱进行一阶微分和Norris导数滤波平滑处理，得到的模型性能最佳。

表1不同光谱预处理方法对模型预测结果的影响

(2)最优建模波段选择

华蟾素醇沉样本原始光谱进行一阶微分和Norris平滑后(参见图2)，在5300-5000cm^-1有较大的吸收峰，属于水分子和醇类的的伸缩与弯曲组合频吸收，对样品的透射光谱影响较大。为了减少该影响，选择8745-8304cm^-1、7483-6227cm^-1和6020-5634cm^-1处样品建模。

(3)最佳主因子数确定

用于定量分析用的最佳因子数对保证定量模型预测稳定性非常重要，当因子数选取过小时导致模型信息量不够，因子数选取过大时容易造成模型的“过拟合”现象。采用留一交叉验证法，考察了主因子数对内部交叉验证均方差(RMSECV)的影响(参见图3)。结果表明，当主因子数为6时RMSECV值最小，确定最佳主因子数为6。

(4)校正模型的建立

采用一阶微分和Norris导数滤波平滑处理，在8745-8304cm^-1、7483-6227cm^-1和6020-5634cm^-1波段内应用PLS法建立测定华蟾素醇沉样本吲哚类生物碱含量的定量校正模型，其中主因子数为6。PLS定量校正模型的R²达到0.9613，RMSEC为0.172，华蟾素醇沉液近红外特征光谱与吲哚类生物碱含量之间相关性良好。校正集中样本吲哚类生物碱含量的近红外模型预测值和分光法测得参考值建立相关关系图(参见图4)。

5未知样本的吲哚类生物碱的快速测定

选取按照本实施例中步骤1中获得新一批次华蟾素醇沉液样本12个，采用本实施例中步骤2测得吲哚类生物碱含量参考值，根据本实施例中步骤3获得近红外透射光谱，将光谱导入至本实施例中步骤4中建立的校正模型，计算得到样本吲哚类生物碱含量的预测值。预测值与参考值数据比较结果见表2。模型中预测误差均方根RMSEP则为0.169，模型可以满足预测的需要。

表2样本吲哚类生物碱含量参考值与预测值数据比较

实施例2

1不同醇沉工艺下醇沉液样本的收集

将蟾皮水提得到的提取液浓缩至密度为1.15g/mL，取该水提浓缩液1L置于醇沉罐中，在保温60℃下，保持机械搅拌转速为500rpm，以60mL/min的流速加入95％(v/v)乙醇直到使药液终点乙醇浓度75％(v/v)。一边加入乙醇的同时，一边定时取样。获得华蟾素醇沉样本16个。

2醇沉液样本吲哚类生物碱含量参照值的测定

用实施案例1中步骤2紫外分光光度法测定上述工艺过程中样本中吲哚类生物碱含量，以此含量值作为参考值。

3醇沉液样本的近红外透射光谱的采集

使用近红外光谱仪，按照用实施案例1中步骤3中扫描参数获得上述样本的近红外光谱。

4醇沉液样本的含量预测

将所得的近红外光谱数据导入至实施案例1中步骤4所建立的校正模型中，经计算得到各个样本中吲哚类生物碱含量的预测值。将预测值与参考值数据进行比较，结果参见表3。针对该批样本，模型中预测误差均方根RMSEP则为0.351，模型可以满足预测的需要。

表3样本吲哚类生物碱含量参考值与预测值数据比较

本发明提出华蟾素醇沉过程中吲哚类生物碱的近红外快速检测方法，研究结果表明，通过化学计量学方法建立PLS定量校正模型，近红外光谱分析技术可以对华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱成分含量进行快速分析。本方法省时、无损，提高生产效率，反映醇沉过程成分变化，为中药制药过程的质量控制提供了一种新方法。

Claims (1)

1.一种测定华蟾素醇沉液中吲哚类生物碱含量的方法，通过以下步骤实现：

(1)校正集醇沉液样本的收集：

收集不同批次华蟾素醇沉过程中获取的不少于50份的华蟾素醇沉液样本，是将蟾皮水提得到的提取液浓缩至密度1.10-1.15g/mL，取该水提浓缩液置于保温40-60℃的醇沉罐中，在机械搅拌转速200-500rpm下，加入v/v为95％的乙醇直到使药液终点乙醇浓度为70％-80％，且边加乙醇边定时取样；

(2)校正集醇沉液样本吲哚类生物碱含量参照值的测定：

采用紫外可见分光光度法测定华蟾素醇沉液样本中以5-羟色胺计的含量，并将此含量作为对照值；

(3)校正集醇沉液样本的近红外透射光谱的采集：

使用近红外光谱仪扫描采集的醇沉液样本，每份样本多次测量求其平均光谱，其中近红外光谱采集方式及条件为：以内置背景为参比，光谱扫描范围4000～10000cm^-1，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，每个样品作3次平行扫描，取平均作为样品的近红外光谱；

(4)校正模型的建立：

筛选近红外光谱预处理方法，选择建模波段，确定最佳主因子数，运用化学计量学软件处理数据，应用偏最小二乘法建立醇沉液样本吲哚类生物碱的近红外定量分析模型，所述光谱预处理方法为一阶微分、二阶微分、Savitsky-Golay平滑和Norris导数滤波平滑，波段选择包括全波长、8745-8304cm^-1、7483-6227cm^-1和6020-5634cm^-1及其组合，确定最佳主因子数；

(5)未知样本的吲哚类生物碱的快速测定：

重新收集华蟾素醇沉过程中未知样本，使用近红外光谱仪在光谱扫描范围4000～10000cm^-1测量其近红外光谱数据，按照校正模型中相同的光谱预处理方法和波段处理，输入到已建立的近红外校正模型中，经过模型计算和预测即可得知未知样本中吲哚类生物碱的含量信息。

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