CN102384896B - 近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法，首先收集不同批次苦参和白土茯苓药材渗漉液作为校正样本集，以传统方法测得渗漉液中多种成分的含量作为参考值，同时以一定的采集方式和采集参数扫描样本得到相应的近红外光谱图，应用化学计量学技术建立起渗漉液光谱与多种成分含量之间的多元校正模型。当检测未知各成分含量渗漉液时，只需按同样方法测得其近红外光谱，利用已建立的校正模型便可以快速地得到各成分的含量信息。本发明提供的方法操作简单、快速、准确性高，可有效解决复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的快速检测，使苦参制剂生产得到安全有效的保证。

Description

近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法

技术领域

本发明属于中药生产质量控制技术领域，涉及以近红外光谱测定成分含量的方法，具体地说是一种基于近红外光谱快速测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法。

背景技术

复方苦参注射液是由苦参和白土茯苓精制而成的纯中药制剂，具有抗癌、增强免疫、止血、止痛、抗肿瘤等功效，其主要成分为苦参碱、槐定碱及氧化苦参碱等生物碱类成分。部颁标准采用酸碱滴定法测定复方苦参注射液中总生物碱含量，而目前关于苦参及其制剂中生物碱类成分含量的测定方法仅见以薄层色谱扫描法和高效液相色谱法测定苦参碱的报道。这些方法操作繁琐、耗时、准确性不高，远远不能满足苦参制剂生产过程中多种成分的快速实时监测要求，严重阻碍了中药的产业化发展。因此，迫切需要发展一种快速分析方法，对中药生产过程进行实时监控，以便及时发现和解决问题，保证产品质量。

提取过程是中药生产的关键环节，溶剂提取法是最为常见的提取方式，常用的溶剂提取法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、同流法及连续回流提取法等。其中，渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉，溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，其浸出效果优于浸渍法。当渗滴液颜色极浅，或渗漉液的体积相当于原药材重量的10倍时，便可认为基本上提取完全。复方苦参注射剂采用1%醋酸液作溶剂，浸渍后进行渗漉，从而提取出大量的生物碱和黄酮类物质。渗漉过程中多种成分含量如何变化，以及如何判断完全提取终点是实际生产急需解决的问题，而解决此问题需要先建立一种快速测定提取过程中多种成分含量的方法。

近红外光谱（Near-Infrared Spectroscopy,NIRS）是可见光与中红外光谱之间的一段谱区，波长范围780nm-2526nm（12820cm^-1-3958cm^-1）。该段光谱区主要是含氢基团（C-H、N-H、O-H）的倍频与合频吸收。与其他光谱技术相比，近红外光谱具有吸收弱的特点，因此，使得样品不需要稀释等预处理，就可直接进行分析。该技术近年来随化学计量学而发展迅速，在石油化工、食品、药物等领域得到了很好的运用。这为我们将该技术用于中药制剂生产过程多种成分实时分析和监控成为一种可能。

发明内容

本发明的目的在于针对复方苦参注射液生产过程缺少有效的质量分析与控制技术，提供一种近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法，以有效满足复方苦参注射液生产过程中多种成分含量快速测定的需求，保证最终产品质量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

（1）建立校正模型，收集具有代表性的苦参和白土茯苓药材渗漉液作为校正样本集，以传统分析方法测得渗漉液中多种成分的含量作为参考值，同时使用近红外光谱仪采集得到校正样本集相应的近红外光谱图，选择合适的光谱波段和预处理方法，使用偏最小二乘法，建立被测样品中多种成分含量与特征光谱之间关系的数学模型；

（2）对建立的校正模型进行外部验证：取已知多种成分含量的苦参和白土茯苓药材渗漉液样品，在步骤（1）相同条件下测定其近红外吸收光谱，根据步骤（1）建立的数学模型计算样品中多种成分的含量预测值，并与已知含量进行比较，预测值的标准误差均值低于20%；

（3）校正模型的应用：按同样方法扫描得到待测样品的近红外光谱图，选用同样的光谱波段和预处理方法，将特征光谱信息输入步骤（1）建立的数学模型，计算预测出苦参和白土茯苓药材渗漉液中多种成分的含量。

其中，所述苦参和白土茯苓药材渗漉液中的多种成分含量包括氧化苦参碱、氧化槐果碱、黄酮三叶豆紫檀苷、总糖含量以及含固量。

所述校正样本集的收集方法是取不同批号的苦参和白土茯苓药材，按照苦参∶白土茯苓＝7∶3的重量比混合，粉碎成0.2mm-0.81mm的粗粉，加入粗粉重量10-15倍体积的1wt%醋酸水溶液，浸泡24h后，装入渗漉装置中，压实，以粗粉重量5-10倍的1wt%醋酸水溶液为漉液进行渗漉，渗漉时间24h，流速0.5ml/min，每隔一段时间收集样品，确保样品各成分含量分布具有一定的范围。

同时，校正样本集在采集光谱前需要先进行样品的前处理：将样品以四层滤纸过滤，于1000-1200rmp离心5-15min，取上清液进行光谱采集和含量测定。

本发明中，校正样本集中多种成分含量的测定方法分别是：

（1）采用HPLC法测定氧化苦参碱和氧化槐果碱含量：

HPLC色谱条件：C18柱；流动相：以含10mol/L戊烷磺酸钠的0.04wt%磷酸水溶液为水相A，乙腈溶液为有机相B，梯度洗脱步骤：0-34min为3.0%A相，35-50min为3.0%-7.0%A相，51-60min为7.0%-10%A相，60-70min为10%A相，70-71min为10%-50%A相；流速1.2mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；

（2）采用HPLC法测定黄酮三叶豆紫檀苷含量：

HPLC色谱条件：C18柱；流动相：乙腈∶水＝30∶70；流速：1.0mL/min；检测波长310nm；柱温35℃；

（3）采用苯酚硫酸法测定总糖含量：

配制一系列浓度已知的葡萄糖标准溶液，490nm处测定紫外吸收值，以吸收值对浓度作标准曲线，精密量取稀释一定倍数后的样品溶液1mL于具塞锥形瓶中，加入1ml苯酚溶液，沿瓶壁缓缓加入10ml浓硫酸，搅拌2min，静置1h，在490nm处测定紫外吸收值，代入标准曲线得到样品中总糖浓度；

（4）采用烘烤法测定含固量：

精密量取一定体积的样品于干燥至恒重的玻璃称量瓶中，置干烤箱中，于105℃烘至恒重。

光谱的采集方式及采集条件：采用透反射法采集近红外光谱，采集光谱相关参数：分辨率8cm^-1，扫描次数64次，增益4×，扫描光谱波长范围4000-10000cm^-1。

所述的光谱预处理方法包括多元散射校正、标准正则变换、微分和平滑及其组合。

本发明以一定的采集方式和采集参数，扫描得到校正样本集4000-10000cm^-1的近红外光谱图，并对得到的光谱进行波段选择和必要的预处理。同时采用HPLC法测定校正样本集的氧化苦参碱、氧化槐果碱和黄酮三叶豆紫檀苷含量，苯酚硫酸法测定其总糖含量和烘烤法测定其含固量，并将测量结果作为参考值。接着应用化学计量学技术，建立起渗漉液光谱与多种成分含量之间的多元校正模型。当检测未知各成分含量的渗漉液时，只需按照同样的方法测得其近红外光谱，利用已建立的校正模型便可以快速地得到各成分的含量信息。

本发明提供的近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法操作简单、快速、准确性高。与传统的HPLC、苯酚硫酸法和烘烤法相比，大大缩短了分析测量时间，不需要大量的反应试剂，节省了大量的人力和物力。结果显示当氧化苦参碱、氧化槐果碱、黄酮三叶豆紫檀苷、总糖含量和含固量分别在0-1.9mg/ml、0-0.5mg/ml、0.002-0.041mg/ml、0.6-15.6mg/ml和0.1-2.7%时，特征光谱与各成分含量线性关系良好。该检测法是复方苦参注射液生产过程对多种成分含量检测的一大创新，经济和社会效益巨大。

附图说明

图1为本发明建立多种成分校正模型的流程示意图。

图2为苦参和白土茯苓药材渗漉液近红外光谱原始谱图。

图3为渗漉液中氧化苦参碱含量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图4为渗漉液中氧化槐果碱含量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图5为渗漉液中三叶豆紫檀苷含量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图6为渗漉液中总糖含量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图7为渗漉液中含固量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图8为渗漉过程氧化苦参碱含量的变化趋势图。

图9为渗漉过程氧化槐果碱含量的变化趋势图。

图10为渗漉过程三叶豆紫檀苷含量的变化趋势图。

图11为渗漉过程总糖含量的变化趋势图。

图12为渗漉过程含固量的变化趋势图。

具体实施方式

本发明是通过以下具体实施方式实现的，其具体流程见图1。但本发明并不限于此。

实施例1。

1、校正样本集的收集及预处理。

取不同批号的苦参和白土茯苓药材，粉碎成0.2mm-0.81mm的粗粉后，分别称取苦参药粉70g和白土茯苓药粉30g混合，加入1%醋酸水溶液1200ml浸泡24h后，将药粉装入渗漉装置中，压实，开始渗漉。漉液为1%醋酸水溶液600ml，渗漉时间24h，流速0.5ml/min。在渗漉过程中每隔15min取样，确保样本各成分含量分布具有一定的范围，共收集到80个样本。对上述收集的样本首先采用四层滤纸过滤，然后于1000rmp离心10min，取上清液进行含量测定和光谱采集。

2、校正样本集氧化苦参碱含量的测定。

采用HPLC法测定校正样本集氧化苦参碱的含量：迪马C18分析柱；流动相：水相A为0.04%磷酸水溶液（含10mol/L戊烷磺酸钠），有机相B为乙腈溶液；优化后的梯度洗脱步骤：0-34min为3.0%A相，35-50min为3.0%-7.0%A相，51-60min为7.0%-10%A相，60-70min为10%A相，70-71min为10%-50%A相；进样体积5μL；流速1.2mL/min；检测波长210nm；柱温30℃。

测得的校正样品集氧化苦参碱含量分布范围为0.046-1.949 mg/ml。

3、校正样本集NIR光谱数据采集。

使用ANTARIS傅立叶变换近红外光谱仪(Thermo Nicolet Corporation，美国)，采用透射法采集近红外光谱，光谱采集条件：分辨率8cm^-1，扫描次数64次，增益4×，扫描光谱波长范围4000-10000cm^-1。采集到的苦参和白土茯苓药材渗漉液原始光谱见图2。

4、氧化苦参碱校正模型的建立。

使用Unscrambler9.6软件进行定量分析，对光谱进行预处理和波段选择，得到苦参和白土茯苓药材渗漉液特征光谱信息。利用偏最小二乘回归法建立氧化苦参碱含量回归模型，采用留一法全交叉进行内部验证。在建立渗漉液样本氧化苦参碱含量偏最小二乘回归模型过程中，首先以R2、RMSEC和RMSEP作为模型稳健性的判定依据，考察不同预处理方法对所建模型的性能影响，然后通过分析选择不同波段对模型性能的影响,确定各成分最优波段。最终确定选择SNV预处理， 5388-6572cm^-1波段所建立的偏最小二乘回归模型性能最佳。即相关系数最大为0.976，RMSEP最小为0.144mg/ml，最佳因子数为4。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图3。

5、氧化苦参碱校正模型的验证。

选取已知氧化苦参碱含量的16个苦参和白土茯苓药材渗漉液（氧化苦参碱含量分布范围为0.0787-1.895mg/ml）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本氧化苦参碱含量，与HPLC法测定的氧化苦参碱含量数据比较，结果见表1。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.110 mg/mL，为可接受的预测误差。

校正模型及验证模型的评价参数如下。

（1）相关系数 ：

式中，为标准法测定的参考值，为由校正模型预测的结果，为均值。值越接近1，表示校正模型的预测值与真实值越接近。

（2）交叉验证误差均方根（RMSECV，Root mean square error of cross validation）:

RMSECV=

式中，为校正模型交叉验证的分析结果，n为校正集样本数。此参数是评价内部交叉验证好坏的质量指标，RMSECV越小，模型的预测精度越高。

（3）预测误差均方根（RMSEP Root mean square of prediction）:

RMSEP =  

式中，m为用于检验模型的验证集样本数。此参数是外部验证评价模型好坏的质量指标，RMSEP越小，模型的预测性能越好。

6、氧化苦参碱回归模型的运用。

对于苦参和白土茯苓药材渗漉过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到渗漉液中氧化苦参碱含量，从而可以清楚地看到渗漉过程氧化苦参碱含量的变化趋势，见图8。

实施例2。

方法步骤与实施例1相同，区别在于建立氧化槐果碱的校正模型。

1、校正样本集的收集及预处理同实施例1。

2、校正样本集氧化槐果碱含量的测定同实施例1。

测得的校正样本集氧化槐果碱含量分布范围为0.026-0.522mg/ml。

3、校正样本集NIR光谱数据采集同实施例1。

4、氧化槐果碱校正模型的建立同实施例1。

选择SNV预处理，5388-6572cm^-1波段建立的PLS回归模型性能最佳，即相关系数最大为0.980，RMSECV最小为0.327mg/ml，最佳因子数为3。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图4。

5、氧化槐果碱校正模型的验证。

选取已知氧化槐果碱含量的16个苦参和白土茯苓药材渗漉液（氧化槐果碱含量分布范围为0.048-0.507mg/ml）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本氧化槐果碱含量，与HPLC法测定的氧化槐果碱含量数据比较，结果见表2。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.029mg/mL，为可接受的预测误差。

6、氧化槐果碱回归模型的运用。

对于苦参和白土茯苓药材渗漉过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到渗漉液中氧化槐果碱含量，从而可以清楚地看到渗漉过程氧化槐果碱含量的变化趋势，见图9。

实施例3。

方法步骤与实施例1相同，区别在于三叶豆紫檀苷含量的测定及其校正模型的建立。

1、校正样本集的收集及预处理同实施例1。

2、校正样本集三叶豆紫檀苷含量的测定方法。

HPLC色谱条件：Phenomenex Luna C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)；流动相：乙腈∶水＝30∶70；流速：1.0mL/min；检测波长310nm；柱温35℃。

测得的校正样本集三叶豆紫檀苷含量分布范围为0.002-0.041 mg/ml。

3、校正样本集NIR光谱数据采集同实施例1。

4、三叶豆紫檀苷校正模型的建立同实施例1。

选择SNV预处理，5388-6572cm^-1波段建立的PLS回归模型性能最佳，即相关系数最大为0.925，RMSECV最小为0.004mg/ml，最佳因子数为3。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图5。

5、三叶豆紫檀苷校正模型的验证。

选取已知三叶豆紫檀苷含量的15个苦参和白土茯苓药材渗漉液（三叶豆紫檀苷含量分布范围为0.006-0.041 mg/ml）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本三叶豆紫檀苷含量，与HPLC法测定的三叶豆紫檀苷含量数据比较，结果见表3。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.004mg/mL，为可接受的预测误差。

6、三叶豆紫檀苷回归模型的运用。

对于苦参和白土茯苓药材渗漉过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到渗漉液中三叶豆紫檀苷含量，从而可以清楚地看到渗漉过程三叶豆紫檀苷含量的变化趋势，见图10。

实施例4。

方法步骤与实施例1相同，区别在于总糖含量的测定及其校正模型的建立。

1、校正样本集的收集及预处理同实施例1。

2、校正样本集总糖含量的测定方法。

配制一系列浓度已知的葡萄糖标准溶液，490nm处测定紫外吸收值，以吸收值对浓度作标准曲线，精密量取稀释一定倍数后的样品溶液1mL于具塞锥形瓶中，加入1ml苯酚溶液，沿瓶壁缓缓加入10ml浓硫酸，搅拌2min，静置1h，在490nm处测定紫外吸收值，代入标准曲线得到样品中总糖浓度。

测得的校正集样总糖含量分布范围为0.6224-15.620mg/ml。

3、校正样本集NIR光谱数据采集同实施例1。

4、总糖含量校正模型的建立同实施例1。

选择SNV预处理，5388-6572cm^-1波段建立的PLS回归模型性能最佳，即相关系数最大为0.971，RMSECV最小为1.420mg/ml，最佳因子数为4。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图6。

5、总糖校正模型的验证。

选取已知总糖含量的15个苦参和白土茯苓药材渗漉液（总糖含量分布范围为0.660-15.140mg/ml）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本总糖含量，与测定的总糖含量数据比较，结果见表4。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.009mg/mL，为可接受的预测误差。

6、总糖回归模型的运用。

对于苦参和白土茯苓药材渗漉过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到渗漉液中总糖含量，从而可以清楚地看到渗漉过程总糖含量的变化趋势，见图11。

实施例5。

1、校正样本集的收集及预处理同实施例1。

2、校正样本集含固量的测定方法。

精密量取一定体积供试样本于干燥至恒重的玻璃称量瓶中，置干烤箱中，于105℃烘至恒重。

测得的校正集样含固量分布范围为0.148-2.660%。

3、校正样本集NIR光谱数据采集同实施例1。

4、含固量校正模型的建立同实施例1。

选择SNV预处理，5388-6572cm^-1波段建立的PLS回归模型性能最佳，即相关系数最大为0.981，RMSECV最小为0.186mg/ml，最佳因子数为4。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图7。

5、含固量校正模型的验证。

选取已知含固量的16个苦参和白土茯苓药材渗漉液（含固量分布范围为0.184-2.508 mg/ml）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本含固量，与测定的含固量数据比较，结果见表5。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.139mg/mL，为可接受的预测误差。

6、含固量回归模型的运用。

对于苦参和白土茯苓药材渗漉过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到渗漉液中含固量，从而可以清楚地看到渗漉过程含固量的变化趋势，见图12。

Claims (2)

1.一种近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法，其特征在于由以下步骤实现：

(1)建立校正模型：收集具有代表性的苦参和白土茯苓药材渗漉液作为校正样本集，以传统分析方法测得渗漉液中多种成分的含量作为参考值，同时使用近红外光谱仪采集得到校正样本集相应的近红外光谱图，选择合适的光谱波段和预处理方法，使用偏最小二乘法，建立被测样品中多种成分含量与特征光谱之间关系的数学模型；

(2)校正模型外部验证：取已知多种成分含量的苦参和白土茯苓药材渗漉液样品，在步骤(1)相同条件下测定其近红外吸收光谱，根据步骤(1)建立的数学模型计算样品中多种成分的含量预测值，并与已知含量进行比较，预测值的标准误差均值低于20％；

(3)校正模型的应用：按同样方法扫描得到待测样品的近红外光谱图，选用同样的光谱波段和预处理方法，将特征光谱信息输入步骤(1)建立的数学模型，计算预测出苦参和白土茯苓药材渗漉液中多种成分的含量；

所述的多种成分含量包括氧化苦参碱、氧化槐果碱、黄酮三叶豆紫檀苷、总糖含量以及含固量；

所述校正样本集的收集方法是取不同批号的苦参和白土茯苓药材，按照苦参∶白土茯苓＝7∶3的重量比混合，粉碎成0.2mm-0.81mm的粗粉，加入粗粉重量10-15倍体积的1wt％醋酸水溶液，浸泡24h后，装入渗漉装置中，压实，以粗粉重量5-10倍的1wt％醋酸水溶液为漉液进行渗漉，渗漉时间24h，流速0.5ml/min，每隔一段时间收集样品，确保样品各成分含量分布具有一定的范围；

校正样本集在采集光谱前先进行样品的前处理：将样品以四层滤纸过滤，于1000-1200rmp离心5-15min，取上清液进行光谱采集和含量测定；

光谱的采集方式及采集条件：采用透射法采集近红外光谱，采集光谱相关参数：分辨率8cm^-1，扫描次数64次，增益4x，扫描光谱波长范围4000-10000cm^-1；

所述的光谱预处理方法包括多元散射校正、标准正则变换、微分和平滑及其组合。

2.根据权利要求1所述的近红外光谱测定复方苦参注射液渗漉过程多种成分含量的方法，其特征在于校正样本集中多种成分含量的测定方法是：

(1)采用HPLC法测定氧化苦参碱和氧化槐果碱含量：

HPLC色谱条件：C18柱；流动相：以含10mol/L戊烷磺酸钠的0.04wt％磷酸水溶液为水相A，乙腈溶液为有机相B，梯度洗脱步骤：0-34min为3.0％A相，35-50min为3.0％-7.0％A相，51-60min为7.0％-10％A相，60-70min为10％A相，70-71min为10％-50％A相；流速1.2mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；

(2)采用的HPLC法测定黄酮三叶豆紫檀苷含量：

HPLC色谱条件：C18柱；流动相：乙腈∶水＝30∶70；流速：1.0mL/min；检测波长310nm；柱温35℃；

(3)采用苯酚硫酸法测定总糖含量：

配制一系列浓度已知的葡萄糖标准溶液，490nm处测定紫外吸收值，以吸收值对浓度作标准曲线，精密量取稀释一定倍数后的样品溶液1mL于具塞锥形瓶中，加入1ml苯酚溶液，沿瓶壁缓缓加入10ml浓硫酸，搅拌2min，静置1h，在490nm处测定紫外吸收值，代入标准曲线得到样品中总糖浓度；

(4)采用烘烤法测定含固量：

精密量取一定体积的样品于干燥至恒重的玻璃称量瓶中，置干烤箱中，于105℃烘至恒重。