CN101780141A - 一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法，先收集具有代表性的丹参提取液作为校正样本集，扫描得到校正样本集的近红外光谱图，选择合适的光谱波段和预处理方法得到丹参提取液特征光谱信息，以磷钼钨酸/干酪素法测得的样本集鞣质含量结果为参照值，应用化学计量学技术，构建丹参提取液近红外特征光谱信息与其鞣质含量之间关系的多元校正模型，对未知含量的丹参提取液样本进行近红外光谱扫描和得到特征光谱信息，利用已构建的定量校正模型快速计算鞣质的含量。本发明具有方法简单、快速、准确性高的特点，可有效解决丹参提取液中鞣质含量监控问题，使丹参注射液质量得到保证，可在中药制剂生产中推广应用。
Description
技术领域
本发明属中药生产质量监测方法，更具体地说涉及一种近红外光谱快速测定丹参提取液中鞣质含量的检测方法。
背景技术
鞣质是中药材中广泛存在的一类水溶性多元酚类化合物，具有沉淀蛋白的作用。鞣质在中药制剂中不仅会影响制剂的稳定性和澄明度，还可能会引起一系列严重的生理反应，例如，某些鞣质注入体内会引起黄疸和肝坏死等一系列临床症状。因此，鞣质在中药制剂过程中常作为杂质除去。近年来中药注射剂的安全性问题已引起人们的广泛关注，中药注射剂中鞣质能与血红蛋白形成药物性沉淀；局部组织多次注射可能导致组织坏死，造成无菌炎症。鞣质检查是中药注射剂的特殊检查项目之一。
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，是我国传统医药学中应用最早且最广泛的药物之一，丹参注射液是国家基本医疗保险药品乙类品种，对治疗冠心病等心血管疾病具有较好的疗效。丹参注射液的生产流程包括提取、浓缩、醇沉等精制工序，各工序中的鞣质监测是丹参注射液生产质量控制的重要手段。
中国药典2005年版一部附录XB制定了以磷钼钨酸为显色剂，以没食子酸为对照品，以干酪素为吸附剂的鞣质含量测定法。该分析法操作繁琐、耗时。远不能满足对丹参注射液生产过程进行鞣质含量分析与监控的要求。因此，迫切需要建立简便、快速的丹参提取液鞣质含量检测方法，以满足生产企业对生产过程鞣质含量进行快速监测、优化控制的需求，从而保证最终产品质量。
近红外光谱(Near-Infrared Spectroscopy，NIRS)是可见光与中红外光谱之间波长范围为780nm～2526nm(12820cm-1～3958cm-1波数)的光谱区。该光谱区主要是含氢基团(C-H、N-H、O-H)的倍频与合频吸收。与其他光谱技术相比，近红外光谱具有吸收弱的特点，因此，使得样品不需要稀释等预处理，就可直接进行分析。该技术需要与化学计量学结合，其中，常用的化学计量学技术主要有主成分回归(PCR)和偏最小二乘回归(PLS)等。近红外光谱测量方法是一种较好的快速检测方法，可发展成为一种中药制剂生产过程在线检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法，可有效地解决丹参注射液生产过程中提取液鞣质含量快速测定的难点，以提高过程单元的精确控制，从而保证最终产品质量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现：
1.校正集样本的收集：
收集不同批次丹参第1～3次提取过程中获取的丹参提取液样本；
2.校正集样本鞣质含量参照值的测定：
采用2005版中国药典附录XB中磷钼钨酸/干酪素法测定校正集样本鞣质含量，
(1)试剂、溶液配置：
磷钼钨酸试剂的配制 取Na2WO4 100g，Na2MoO4 25g，加水700ml使其溶解，加100ml HCl，50ml H3PO4，加热回流10h，放冷，再加150g Li2SO4，50ml水和0.2ml溴水，煮沸约15min除去残留的Br，冷却，加水稀释至1000ml，过滤，即得，
对照品溶液的配制 精密称取没食子酸50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解，定容，混匀后，精密吸取5.0ml置于50ml棕色量瓶中，加水定容，备用(每ml含没食子酸0.05mg)，
供试品溶液的配制 精密量取丹参提取液适量于棕色量瓶中，加水稀释15～35倍，摇匀，滤过，弃去初滤液，备用；
(2)标准曲线测定 分别精密量取对照品溶液0.5ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml置于25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别精密量取蒸馏水适量，补足体积至13ml，加29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，照中国药典2005年版一部附录VA紫外一可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)总酚含量测定 精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，在760nm波长处测定吸光度A，按标准曲线法计算总酚含量。
(4)不被吸附多酚含量测定 精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml锥形瓶中，密塞，置30℃水浴中保温1h，时时振摇，取出放冷，摇匀，滤过。弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1ml，加水10ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应试剂为空白，在760nm波长处测定吸光度A′，按标准曲线法计算不被吸附多酚含量。
(5)鞣质含量计算
丹参提取液中鞣质含量＝提取液中总酚含量-提取液中不被吸附多酚含量
3.校正集样本光谱数据采集：
使用近红外光谱仪扫描得到校正样本集4000～10000cm-1范围近红外光谱数据。
4.校正模型的建立：
应用化学计量学技术，建立鞣质含量多元校正回归模型，采用留一法全交叉进行内部验证。本发明采用的化学计量学多元校正包括偏最小二乘PLS法或主成分回归PCR法。在建立校正模型前，首先需要对光谱进行预处理和波段选择，得到丹参提取液特征光谱信息。采样不同预处理方法对光谱进行预处理可以去掉高频噪音对信号的干扰，消除样品颗粒分布不均匀产生的散射影响，消除光谱中平直的基线漂移。而通过对光谱波段进行筛选，可以避免引入过多冗余信息，改善模型性能，提高计算速度。常用的光谱预处理方法有平滑算法、标准正则变换(Standard Normal Variate，SNV)、多元散射校正(MultiplicativeScatter Correction，MSC)和求导数法。不同预处理方法的特点如下：
(1)平滑算法：是应用最广泛的光谱平滑方法，主要去掉高频噪音对信号的干扰，可以避免光谱峰形的失真。
(2)标准正则变换：主要用于消除固体颗粒大小、表面散射以及光程变化对近红外光谱的影响，还可以减小光谱漂移现象。
(3)多元散射校正：主要用于消除样品颗粒分布不均匀产生的散射影响。
(4)求导数法：是近红外光谱预处理常用的一个方法，用来增进复杂光谱中低分辨率组分的分辨率。对光谱求一阶导数可以消除光谱中平直的基线漂移，对光谱求二阶导数可以消除光谱中倾斜的基线漂移，提高信噪比。
5.校正模型的验证
选取已知鞣质含量的10个丹参提取液(鞣质含量需要落在校正集鞣质含量范围之内)作为验证集，按校正集相同近红外光谱采集参数进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入定量校正模型，计算得到验证集样本鞣质含量。
上述校正模型可以根据实际需要，增加校正集和验证集，对模型进行不断的更新与完善，操作步骤同前。
6.丹参提取液鞣质含量测定
取未知鞣质含量的丹参提取液，按校正集样本相同近红外光谱采集参数采集样本近红外光谱数据，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可快速计算得到提取液中鞣质含量值。
本发明通过收集具有代表性的丹参提取液样品作为校正样本集，以一定的采集方式和采集参数，扫描得到校正样本集的近红外光谱图，并对得到的光谱进行波段选择和必要的预处理。以磷钼钨酸/干酪素法测定的提取液鞣质含量结果作为参照值，应用化学计量学技术，建立丹参提取液的近红外光谱与其鞣质含量之间关系的多元校正模型。将未知鞣质含量的丹参提取液，按同样的方法测得其近红外光谱，利用已构建的校正模型即可快速计算得到其鞣质含量。
本发明提供的近红外光谱快速测定丹参提取液中鞣质含量的方法，操作简单、快速、准确性高。与传统的比色法相比，缩短测定时间50倍以上，不需要大量的反应试剂，节省了大量的人力和物力。特征光谱与鞣质含量之间存在较好的相关性，可有效解决丹参提取液中鞣质含量监控问题，使丹参注射液质量得到保证，可用于丹参注射液生产过程鞣质含量监测，可在中药制剂生产中推广应用。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
图2为丹参提取液的近红外原始光谱图。
图3为丹参提取液的近红外光谱平滑图。
图4为丹参提取液的近红外光谱一阶导数图。
图5为丹参提取液的近红外光谱二阶导数图。
图6为丹参提取液鞣质含量PLS定量模型的参比值与预测值之间的相关关系图。
图7丹参提取液鞣质含量PCR定量模型的参比值与预测值之间的相关关系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例作进一步的说明，但本发明并不限于此。
实施例1：
方法流程参见图1。
1.校正集样本的收集：
收集22个批次丹参第1次提取的提取液20份、第二次提取的提取液17份、第三次提取的提取液14份共计丹参提取液样本51份，作为校正集样本；
2.校正集样本参照值的测定：
按2005版中国药典附录XB中的磷钼钨酸/干酪素法配制供试品溶液和对照品溶液，依法测定鞣质含量，并将显色反应时间统一控制为30min。测得的样品集鞣质含量分布范围为11.2-197.1μg/ml。
3.校正集样本光谱数据采集：
使用ANTARIS傅立叶变换近红外光谱仪(美国Thermo NicoletCorporation)采集校正集样本近红外光谱。采集光谱的相关参数：分辨率8cm-1，扫描次数32次，增益为4x，扫描光谱波长范围4000-10000cm-1，每个样品作3次平行扫描，取平均作为样品的近红外光谱。采集方式为透射法。采集到的丹参提取液原始光谱图参见图2。
4.校正模型的建立：
在建立校正模型前，首先使用计算机定制软件(Unscrambler9.6)对光谱进行预处理方法和波段选择优化，以最优的波段范围和样本预处理方法处理原始数据得到丹参提取液特征光谱信息。利用偏最小二乘PLS法建立鞣质定量回归模型，采用留一法全交叉进行内部验证。
(1)不同波段近红外光谱数据建模优化：
分别以样本集全波长、4327-4898cm-1、5546-6861cm-1、7093-7563cm-1和4327-4898cm-1、7093-7563cm-1二个波段组合进行PLS法建模，结果见表1。结果表明：选择4327-4898cm-1和7093-7563cm-1二个波段组合建立鞣质定量模型性能最优，即相关系数最高(R2＝0.935)，交叉验证误差均方根(RMSECV＝18.93μg/ml)最小。选择该组合波段近红外光谱数据进行光谱预处理方法优化。
表1不同波段范围进行PLS法建模优化结果
(2)不同光谱预处理方法建模优化：
选择4327-4898cm-1和7093-7563cm-1二个波段组合的样本集近红外光谱数据，分别采用MSC、13点平滑(图3)、一阶导数(图4)、二阶导数(图5)预处理方法处理该波段的近红外原始光谱，并以PLS法建立鞣质定量模型，以R2、RMSECV作为模型稳健性的判定依据，结果见表2。结果表明，使用原始数据与平滑处理后数据所建鞣质定量模型性能相当。
表2不同光谱预处理方法PLS法建模优化结果
(3)校正模型建立：对4327-4898cm-1和7093-7563cm-1二个波段组合的样本集近红外光谱数据，进行13点平滑法处理，使用PLS法建立丹参提取液特征光谱信息和鞣质含量之间的校正模型，采用内部全交叉法进行验证。PLS定量校正模型的相关系数为0.937，RMSECV为18.82μg/ml。丹参提取液特征光谱与其鞣质含量之间存在较好的相关性。以该定量校正模型预测的丹参提取液鞣质含量与磷钼钨酸/干酪素法测定的参照值之间的相关关系图参见附图6。
5.校正模型的验证
选取已测知鞣质含量的10个丹参提取液(鞣质含量需要落在校正集鞣质含量范围之内)作为验证集，按校正集相同近红外光谱采集参数进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本鞣质含量。该数据与磷钼钨酸/干酪素法测定的鞣质含量数据比较，结果见表3。鞣质含量预测值与参照值的预测误差均方根RMSEP为12.30μg/ml，为可接受的预测误差。
表3 PLS法鞣质定量校正模型预测值与参照值比较
| 样品编号 | 参照值(μg/ml) | PLS模型预测值(μg/ml) |
| 1 | 40.91 | 33.06 |
| 2 | 66.81 | 88.59 |
| 3 | 88.57 | 71.47 |
| 4 | 90.92 | 100.9 |
| 5 | 123.9 | 134.1 |
| 6 | 127.4 | 110.7 |
| 7 | 129.6 | 149.1 |
| 8 | 151.3 | 163.8 |
| 9 | 171.1 | 165.7 |
| 10 | 183.9 | 177.2 |
6.丹参提取液鞣质含量测定
取待测鞣质含量的丹参提取液，按校正集样本相同近红外光谱采集参数采集样本近红外光谱数据，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入定量校正模型，便可快速计算得到提取液中鞣质含量值。
实施例2：
按照实施例1的方法，区别之处在于使用主成分回归(PCR)法建立鞣质定量校正模型。
1.选用与实施例1相同的校正集样本数据。
2.校正模型的建立
在建立校正模型前，首先使用计算机定制软件(Unscrambler9.6)对光谱进行预处理方法和波段选择优化，以最优的波段范围和样本预处理方法处理原始数据得到丹参提取液特征光谱信息。利用主成分回归法建立鞣质定量校正模型，采用留一法全交叉进行内部验证。
(1)不同波段近红外光谱数据建模优化：
分别以样本集全波长、4327-4898cm-1、5546-6861cm-1、7093-7563cm-1和4327-4898cm-1、7093-7563cm-1二个波段组合进行PCR法建模，结果见表4。结果表明：选择全波段范围建立鞣质定量模型性能最优，即相关系数最高(R2＝0.943)，交叉验证误差均方根(RMSECV＝17.85μg/ml)最小。选择全波段近红外光谱数据进行光谱预处理方法优化。
表4不同波段范围进行PCR法建模优化结果
(2)不同光谱预处理方法建模优化：
选择全波段的样本集近红外光谱数据，分别采用不同预处理方法处理该波段的近红外原始光谱，并以PCR法建立鞣质定量模型，以R2、RMSECV作为模型稳健性的判定依据，结果见表5。结果表明，使用样品预处理方法处理后建模与原始光谱数据建模其所建鞣质定量模型性能相当。
表5不同光谱预处理方法PCR法建模优化结果
(3)校正模型建立：对样本集原始近红外光谱数据使用PCR法建立丹参提取液特征光谱信息和鞣质含量之间的校正模型，采用内部全交叉法进行验证。PCR定量校正模型的相关系数为0.943，RMSECV为17.85μg/ml。丹参提取液特征光谱与其鞣质含量之间存在较好的相关性。以该定量校正模型预测的丹参提取液鞣质含量与磷钼钨酸/干酪素法测定的参照值之间的相关关系图参见附图7。
3.校正模型的验证
选取已测知鞣质含量的10个丹参提取液(鞣质含量需要落在校正集鞣质含量范围之内)作为验证集，按校正集相同近红外光谱采集参数进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本鞣质含量。该数据与磷钼钨酸/干酪素法测定的鞣质含量数据比较，结果见表6。鞣质含量预测值与参照值的预测误差均方根RMSEP为15.22μg/ml，为可接受的预测误差。
表6 PCR法鞣质定量模型预测值与参照值比较
| 样品编号 | 参照值(μg/ml) | PCR模型预测值(μg/ml) |
| 1 | 40.91 | 30.59 |
| 2 | 66.81 | 76.94 |
| 3 | 88.57 | 69.62 |
| 4 | 90.92 | 84.76 |
| 5 | 123.9 | 134.5 |
| 6 | 127.4 | 108.9 |
| 7 | 129.6 | 159.6 |
| 8 | 151.3 | 150.1 |
| 9 | 171.1 | 168.7 |
| 10 | 183.9 | 165.2 |
4.丹参提取液鞣质含量测定
取待测鞣质含量的丹参提取液，按校正集样本相同近红外光谱采集参数采集样本近红外光谱数据，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入定量校正模型，便可快速计算得到提取液中鞣质含量值。
Claims (5)
1.一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)校正集样本的收集：收集不同批次丹参第1～3次提取过程中获取的丹参提取液样本；
(2)校正集样本鞣质含量的测定：按2005版中国药典附录XB中的磷钼钨酸/干酪素法测定丹参提取液中鞣质含量；
(3)校正集样本近红外光谱的测定：使用近红外光谱仪扫描样本，获取近红外光谱数据，选择合适的光谱波段和预处理方法，获取特征光谱数据；
(4)校正模型的建立：使用多元校正方法，构建校正集样本鞣质含量与近红外特征光谱之间关系的数学模型，用于样本鞣质含量的预测；
(5)校正模型的验证：取已测知鞣质含量的丹参提取液，在相同条件下扫描获取其近红外光谱数据，根据已建立的多元校正数学模型计算样品中的鞣质含量，要求测量误差小于25％；
(6)校正模型的应用：采集待测样本的近红外光谱数据，选用同样的光谱波段和光谱预处理方法，获取特征光谱信息，将该光谱信息输入构建的鞣质定量校正模型中，计算丹参提取液中鞣质的含量。
2.根据权利要求1所述的一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法，其特征在于，光谱的采集方式及采集条件为：使用透射法采集近红外光谱，采集光谱的相关参数：分辨率8cm-1，扫描次数32次，扫描光谱波长范围4000～10000cm-1，每个样品作3次平行扫描，取平均扫描数据作为样品的近红外光谱数据。
3.根据权利要求1所述的一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法，其特征在于，光谱预处理方法包含多元散射校正、标准正则变换、求导数和平滑，波段优化包含全波段、4327-4891cm-1、5546-6861cm-1、7093-7563cm-1及其组合的选择。
4.根据权利要求1所述的一种近红外光谱测定丹参提取液中鞣质含量的方法，其特征在于，所述采用的化学计量学多元校正方法为偏最小二乘法或主成分回归法。
5.根据权利要求1所述的方法在丹参注射液提取过程中提取液的鞣质含量测定中的应用。
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