CN102323236A

CN102323236A - 近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法

Info

Publication number: CN102323236A
Application number: CN201110230032A
Authority: CN
Inventors: 瞿海斌; 程翼宇; 黄红霞; 陈晨; 王旭文; 李安平; 郝润才; 菅晓勇
Original assignee: Shandong Zhendong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Zhendong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-08-12
Also published as: CN102323236B

Abstract

近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，首先收集不同批次苦参药材提取液作为校正样本集，以传统方法测得提取液中多种成分的含量作为参考值，同时以一定的采集方式和采集参数扫描样本得到相应的近红外光谱图，应用化学计量学技术建立起提取液光谱与多种成分含量之间的多元校正模型。当检测未知各成分含量提取液时，只需按同样方法测得其近红外光谱，利用已建立的校正模型便可以快速地得到各成分的含量信息。本发明提供的方法操作简单、快速、准确性高，可有效解决苦参提取液中多种成分含量的快速检测，使苦参制剂生产得到安全有效的保证。

Description

近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法

技术领域

本发明属于中药生产质量控制技术领域，涉及以近红外光谱测定成分含量的方法，具体地说是一种基于近红外光谱快速测定苦参提取过程多种成分含量的方法。

背景技术

苦参，别名苦骨、川参、草槐、地槐等，为豆科植物槐属苦参(Sophora flavescens Alt)的干燥根，具有清热燥湿，杀虫，利尿的作用。苦参的化学成分中含多种生物碱，主要包括苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱等。近年来发现苦参生物碱有着广泛的药理作用，在中枢神经系统、心血管系统、抗病毒、抗炎、免疫及抗肿瘤等方面有重要的药理活性和应用前途。同时有文献报道这些生物碱不稳定，有的可以在一定条件下相互转化，从而影响含苦参复方制剂的质量标准研究。

苦参的提取主要是要尽量提高其生物碱的转移率，实验室可采用醇提法、氨水-氯仿法、树脂法等多种方法，而工业生产中直接采用水提或醇提方法。目前对苦参药材提取过程多种成分含量的测定多采用传统的重量法、酸碱滴定法、酸性染料分光光度法和高效液相色谱法，但这些方法操作繁琐、耗时、准确性不高，远远不能满足对苦参制剂生产过程进行多种成分含量快速测定与监控的要求。

近红外光谱（Near-Infrared Spectroscopy,NIRS）是可见光与中红外光谱之间的一段谱区，波长范围780nm-2526nm（12820cm^-1-3958cm^-1）。该段光谱区主要是含氢基团（C-H、N-H、O-H）的倍频与合频吸收。与其他光谱技术相比，近红外光谱具有吸收弱的特点，因此，使得样品不需要稀释等预处理，就可直接进行分析。该技术近年来随化学计量学而发展迅速，在石油化工、食品、药物等领域得到了很好的运用。这为我们将该技术用于中药制剂生产过程多种成分实时分析和监控成为一种可能。

发明内容

本发明的目的在于针对苦参提取过程缺少有效的质量分析与控制技术，提供一种近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，以有效满足苦参制剂生产过程中多种成分含量快速测定的需求，保证最终产品质量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

（1）建立校正模型，收集具有代表性的苦参提取液作为校正样本集，以传统分析方法测得提取液中多种成分的含量作为参考值，同时使用近红外光谱仪采集得到校正样本集相应的近红外光谱图，选择合适的光谱波段和预处理方法，使用偏最小二乘法，建立被测样品中多种成分含量与特征光谱之间关系的数学模型；

（2）校正模型外部验证：取已知多种成分含量的苦参提取液，在步骤（1）相同条件下测定其近红外吸收光谱，根据步骤（1）建立的数学模型计算样品中多种成分的含量预测值，并与已知含量进行比较，预测值的标准误差均值低于20%；

（3）校正模型的应用：按同样方法扫描得到待测样品的近红外光谱图，选用同样的光谱波段和预处理方法，将特征光谱信息输入步骤（1）建立的数学模型，计算预测出苦参提取液中多种成分的含量。

其中，所述苦参提取液中多种成分含量包括氧化苦参碱、氧化槐果碱含量以及含固量。

同时，校正样本集在采集光谱前需要先进行样品的前处理：将样品以四层滤纸过滤，于1000-1200rmp离心5-15min，取上清液进行光谱采集和含量测定。

本发明中，校正样本集中多种成分含量的测定方法分别是：

（1）采用HPLC法测定氧化苦参碱和氧化槐果碱含量：

HPLC色谱条件：C18柱；流动相：以含10mol/L戊烷磺酸钠的0.04wt%磷酸水溶液为水相A，乙腈溶液为有机相B，梯度洗脱步骤：0-34min为3.0%A相，35-50min为3.0%-7.0%A相，51-60min为7.0%-10%A相，60-70min为10%A相，70-71min为10%-50%A相；流速1.2mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；

（2）采用烘烤法测定含固量：

精密量取一定体积的样品于干燥至恒重的玻璃称量瓶中，置干烤箱中，于105℃烘至恒重。

光谱的采集方式及采集条件：采用透反射法采集近红外光谱，采集光谱相关参数：分辨率8cm^-1，扫描次数64次，增益4×，扫描光谱波长范围4000-10000cm^-1。

所述的光谱预处理方法包括多元散射校正、标准正则变换、微分和平滑及其组合。

本发明以一定的采集方式和采集参数，扫描得到校正样本集4000-10000cm^-1的近红外光谱图，并对得到的光谱进行波段选择和必要的预处理。同时采用HPLC法测定校正样本集的氧化苦参碱、氧化槐果碱含量，烘烤法测定其含固量，并将测量结果作为参考值。接着应用化学计量学技术，建立起提取液光谱与多种成分含量之间的多元校正模型。当检测未知各成分含量的提取液时，只需按照同样的方法测得其近红外光谱，利用已建立的校正模型便可以快速地得到各成分的含量信息。

本发明提供的近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法操作简单、快速、准确性高。与传统的HPLC和烘烤法相比，大大缩短了分析测量时间，不需要大量的反应试剂，节省了大量的人力和物力。结果显示当氧化苦参碱、氧化槐果碱和含固量分别在0.3-3.6mg/ml、0.9-12.1mg/ml和1.4-13.8%时，特征光谱与各成分含量线性关系良好。该检测法是苦参制剂生产过程对多种成分含量检测的一大创新，经济和社会效益巨大。

附图说明

图1为本发明建立多种成分校正模型的流程示意图。

图2为苦参提取液近红外光谱原始谱图。

图3为苦参提取液中氧化苦参碱含量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图4为苦参提取液中氧化槐果碱含量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

图5为苦参提取液中含固量PLS回归模型的参比值与预测值之间的相关关系图。

具体实施方式

本发明是通过以下具体实施方式实现的，其具体流程见图1。但本发明并不限于此。

实施例1。

1、校正样本集的收集及预处理。

取不同批号的苦参药材水提取过程样本32份作为校正样本集，确保样本各成分含量分布具有一定的范围。对上述收集的样本首先采用四层滤纸过滤，然后于1000rmp离心10min，取上清液进行含量测定和光谱采集。

2、校正样本集氧化苦参碱含量的测定。

采用HPLC法测定校正样本集氧化苦参碱的含量：迪马C18分析柱；流动相：水相A为0.04%磷酸水溶液（含10mol/L戊烷磺酸钠），有机相B为乙腈溶液；优化后的梯度洗脱步骤：0-34min为3.0%A相，35-50min为3.0%-7.0%A相，51-60min为7.0%-10%A相，60-70min为10%A相，70-71min为10%-50%A相；进样体积5μL；流速1.2mL/min；检测波长210nm；柱温30℃。

测得的校正样品集氧化苦参碱含量分布范围为0.319-3.635mg/ml。

3、校正样本集NIR光谱数据采集。

使用ANTARIS傅立叶变换近红外光谱仪(Thermo Nicolet Corporation，美国)，采用透射法采集近红外光谱，光谱采集条件：分辨率8cm^-1，扫描次数64次，增益4×，扫描光谱波长范围4000-10000cm^-1。采集到的苦参提取液原始光谱见图2。

4、氧化苦参碱校正模型的建立。

使用Unscrambler9.6软件进行定量分析，对光谱进行预处理和波段选择，得到苦参提取液特征光谱信息。利用偏最小二乘回归法建立氧化苦参碱含量回归模型，采用留一法全交叉进行内部验证。在建立提取液样本氧化苦参碱含量偏最小二乘回归模型过程中，首先以R²、RMSEC和RMSEP作为模型稳健性的判定依据，考察不同预处理方法对所建模型的性能影响，然后通过分析选择不同波段对模型性能的影响,确定各成分最优波段。最终确定适合各个成分的最优模型。

表1为采用PLS回归结合不同预处理方法建立氧化苦参碱含量模型，从表中分析结果得知，不同的预处理方法对氧化苦参碱含量模型的性能影响均不显著。因此对于苦参样品氧化苦参碱含量使用原始光谱建立PLS回归模型。

表2为不同建模波段范围对苦参氧化苦参碱含量模型性能的影响。由表中数据可以看出，7293.5-10001.0cm^-1波段范围所建氧化苦参碱模型性能最优，即相关系数较高，RMSEC和RMSECV较小。

综上所述，苦参氧化苦参碱含量选择7293.5-10001.0cm^-1波段的原始近红外光谱建立的偏最小二乘回归模型性能最佳。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图3。

5、氧化苦参碱校正模型的验证。

选取已知氧化苦参碱含量的10个苦参提取液（氧化苦参碱含量需要落在校正集氧化苦参碱含量分布范围之内）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本氧化苦参碱含量，与HPLC法测定的氧化苦参碱含量数据比较，结果见表3。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.127mg/mL，为可接受的预测误差。

校正模型及验证模型的评价参数如下。

（1）相关系数

：

式中，

为标准法测定的参考值，

为由校正模型预测的结果，

为

均值。

值越接近1，表示校正模型的预测值与真实值越接近。

（2）交叉验证误差均方根（RMSECV，Root mean square error of cross validation）:

RMSECV=

式中，

为校正模型交叉验证的分析结果，n为校正集样本数。此参数是评价内部交叉验证好坏的质量指标，RMSECV越小，模型的预测精度越高。

（3）预测误差均方根（RMSEP Root mean square of prediction）:

RMSEP =

式中，m为用于检验模型的验证集样本数。此参数是外部验证评价模型好坏的质量指标，RMSEP越小，模型的预测性能越好。

6、氧化苦参碱回归模型的运用。

对于苦参提取过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到提取液中的氧化苦参碱含量。

实施例2。

方法步骤与实施例1相同，区别在于建立氧化槐果碱的校正模型。

1、校正样本集的收集及预处理同实施例1。

2、校正样本集氧化槐果碱含量的测定同实施例1。

测得的校正样本集氧化槐果碱含量分布范围为0.926-12.066mg/ml。

3、校正样本集NIR光谱数据采集同实施例1。

4、氧化槐果碱校正模型的建立同实施例1。

表4为采用PLS回归结合不同预处理方法建立氧化槐果碱含量模型，从表中分析结果得知，不同的预处理方法对氧化槐果碱含量模型的性能影响也均不显著。因此对于苦参样品氧化槐果碱含量也使用原始光谱建立PLS回归模型。

表5为不同建模波段范围对苦参氧化槐果碱含量模型性能的影响。由表中数据可以看出，7293.5-10001.0cm^-1波段范围所建氧化槐果碱模型性能最优，即相关系数较高，RMSEC和RMSECV较小。

综上所述，苦参氧化槐果碱含量也是选择7293.5-10001.0cm^-1波段的原始近红外光谱建立的PLS回归模型性能最佳。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图4。

5、氧化槐果碱校正模型的验证。

选取已知氧化槐果碱含量的10个苦参提取液（氧化槐果碱含量需要落在校正集氧化槐果碱含量分别范围之内）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本氧化槐果碱含量，与HPLC法测定的氧化槐果碱含量数据比较，结果见表6。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.037mg/mL，为可接受的预测误差。

6、氧化槐果碱回归模型的运用。

对于苦参提取过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到提取液中的氧化槐果碱含量。

实施例3。

1、校正样本集的收集及预处理同实施例1。

2、校正样本集含固量的测定方法。

精密量取一定体积供试样本于干燥至恒重的玻璃称量瓶中，置干烤箱中，于105℃烘至恒重。

测得的校正集样含固量分布范围为1.362-13.788%。

3、校正样本集NIR光谱数据采集同实施例1。

4、含固量校正模型的建立同实施例1。

表7为采用PLS回归结合不同预处理方法建立含固量模型，从表中分析结果得知，不同的预处理方法对含固量模型的性能影响也均不显著。因此对于苦参样品含固量也使用原始光谱建立PLS回归模型。

表7为不同建模波段范围对含固量模型性能的影响。由表中数据同样选择7293.5-10001.0cm^-1波段所建含固量模型性能最优。

综上所述，苦参含固量也是选择7293.5-10001.0cm^-1波段的原始近红外光谱建立的PLS回归模型性能最佳。其模型的参比值与预测值之间的相关关系见图5。

5、含固量校正模型的验证。

选取已知含固量的10个苦参提取液（含固量需要落在校正集含固量分布范围之内）作为外部验证集，按上述条件进行近红外光谱扫描。选择相同的光谱波段，进行相同的光谱预处理后，将光谱特征值输入校正模型，计算得到验证集样本含固量，与测定的含固量数据比较，结果见表5。NIR预测值与参考值的预测误差均方根RMSEP为0.130mg/mL，为可接受的预测误差。

6、含固量回归模型的运用。

对于苦参提取过程中待测提取液，按上述的条件扫描得到其近红外光谱，经过相同的光谱预处理和波段的选择，把特征光谱输入校正模型，便可计算得到提取液中含固量。

Claims

1.一种近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，其特征在于由以下步骤实现：

（1）建立校正模型：收集具有代表性的苦参提取液作为校正样本集，以传统分析方法测得提取液中多种成分的含量作为参考值，同时使用近红外光谱仪采集得到校正样本集相应的近红外光谱图，选择合适的光谱波段和预处理方法，使用偏最小二乘法，建立被测样品中多种成分含量与特征光谱之间关系的数学模型；

2.根据权利要求1所述的近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，其特征在于所述的多种成分含量包括氧化苦参碱、氧化槐果碱含量和含固量。

3.根据权利要求1所述的近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，其特征在于校正样本集在采集光谱前先进行样品的前处理：将样品以四层滤纸过滤，于1000-1200rmp离心5-15min，取上清液进行光谱采集和含量测定。

4.根据权利要求2所述的近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，其特征在于校正样本集中多种成分含量的测定方法是：

（1）采用HPLC法测定氧化苦参碱和氧化槐果碱含量：

（2）采用烘烤法测定含固量：

5.根据权利要求1所述的近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，其特征在于光谱的采集方式及采集条件：采用透反射法采集近红外光谱，采集光谱相关参数：分辨率8cm^-1，扫描次数64次，增益4x，扫描光谱波长范围4000-10000cm^-1。

6.根据权利要求1所述的近红外光谱测定苦参提取过程多种成分含量的方法，其特征在于所述的光谱预处理方法包括多元散射校正、标准正则变换、微分和平滑及其组合。