CN104359853B - 利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法及应用，包括以下步骤：(1)选取已知水分、浸出物、钩藤碱和异钩藤碱含量的鸡血藤药材粉碎过筛，备用；(2)采集钩藤药材粉末的近红外光谱数据；(3)选取特征波段下的光谱信息与已知的所述钩藤药材的水分含量、浸出物、钩藤碱和异钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立定量校准模型；(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的水分、浸出物、钩藤碱和异钩藤碱的含量值。本发明通过引入近红外光谱技术实现了对钩藤药材快速的、全面的检测，并且该方法具有操作简单、准确性高和精确度高的优势。
Description
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法及应用。
背景技术
钩藤为茜草科植物钩藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.exHavil.、大叶钩藤Uncariarhynchophylla Wall.、毛钩藤UncariahirsutaHavil.、华钩藤Uncariasinensis(Oliv.)Havil或无柄果钩藤UncariasessilifructusRoxb.的干燥带钩茎枝。钩藤的有效成分主要为钩藤碱和异钩藤碱，具有很高的药用价值。2010版《中国药典》中记载钩藤具有息风定惊、清热平肝的功能，在肝风内动，惊痫抽搐，高热惊厥，感冒夹惊，小儿惊啼，妊娠子痫，头痛眩晕等方面均具有良好的药效。近年来国内外学者对钩藤的药理作用、化学成分进行了大量研究，钩藤在镇静、抗惊厥和治疗高血压等方面都表现出较好的疗效。
原药材检查是过程质量分析和控制的源头。由于地理位置、气候条件和生长环境等因素差异，不同产地的同一类药材在活性成分的含量和种类上往往差异较大，因此对原药材进行质量评价十分必要。但是传统的钩藤药材质量检测方法费时、费力，难以广泛的应用于生产实践，不能适应中药制剂的现代化发展的需要，并且往往采用单一指标成分控制药材的质量，不能体现中药成分的复杂性，因此迫切需要一种能够快速的、全面的检测钩藤药材的方法，以满足对大批量的钩藤药材进行筛选和质量的全面控制的要求。
近红外光谱(Near Infrared Spectrum Instrument，NIRS)是介于可见光(Vis)和中红外(MIR)之间波长范围为780nm-2526nm(12820cm-1-3598cm-1)的电磁辐射波，是人们在吸收光谱中发现的第一个非可见光区。近红外光谱区与有机分子中含氢基团(O-H、N-H、C-H)振动的合频和各级倍频的吸收区一致，通过扫描样品的近红外光谱，可以得到样品中有机分子含氢基团的特征信息，而且利用近红外光谱技术分析样品具有方便、快速、高效、准确和成本较低，不破坏样品，不消耗化学试剂，不污染环境等优点，因此该技术受到越来越多人的青睐,已经陆续用于药效成分的含量测定、制药过程的在线检测和监控、天然药物鉴别和中药材的产地鉴别等领域。因此，本发明提供了一种利用近红外光谱快速检测钩藤的方法及应用，将近红外光谱技术应用于钩藤药材的质量快速检测，从钩藤制剂生产的源头上控制其质量，从而保证最终产品质量的安全性、稳定性和有效性，达到快速、高效质量控制的目的。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供了一种利用近红外光谱法快速检测钩藤的方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，包括如下水分含量测定、浸出物含量测定及钩藤碱和异钩藤碱含量测定步骤中的至少一项：
A、水分含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知水分含量的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的水分含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的水分含量值；
B、浸出物含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知浸出物含量的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的浸出物含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的浸出物含量值；
C、钩藤碱含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知钩藤碱的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的钩藤碱含量值；
D、异钩藤碱含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知异钩藤碱含量的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的异钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的异钩藤碱含量值。
所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，所述水分含量测定、所述浸出物含量测定以及所述钩藤碱和异钩藤碱含量测定步骤的所述步骤(2)中，采用漫反射法进行所述钩藤药材粉末的近红外光谱采集，具体条件为以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-12000cm-1。
所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，所述水分含量测定、所述浸出物含量测定以及所述钩藤碱和异钩藤碱含量测定步骤的所述步骤(2)中，还包括对采集到的所述近红外光谱采用一阶导数、二阶导数、多元散射校正、Norris平滑、减去一条直线和SNV中的至少一种方法进行预处理的步骤。
所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，所述水分含量测定的步骤中，采用减去一条直线光谱法对采集到的所述近红外光谱进行预处理；所述浸出物含量测定的步骤中，采用一阶导数和多元散射矫正(MSC)光谱法对采集到的所述近红外光谱进行预处理；所述钩藤碱和异钩藤碱含量的测定步骤中，采用一阶导数和减去一条直线光谱法对采集到的所述近红外光谱进行预处理。
所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，所述水分含量测定、所述浸出物含量测定以及所述钩藤碱和异钩藤碱含量测定步骤的所述步骤(3)中，还包括对建立的所述定量校准模型的预测性能进行评价的步骤，所述评价指标包括相关系数R、相对分析误差RPD、交叉验证均方根RMSECV、主成分数Factor、验证集均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)，若R值接近于1，RPD值大于2.5，且RSEP值小于10％时，所述定量校准模型适用于所述钩藤药材的检测；反之，则不适用。
所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，所述水分含量测定的步骤(1)中，采用烘干法测定所述钩藤药材中的水分含量作为标准含量；所述浸出物含量测定的步骤(1)中，采用热浸法测定所述钩藤药材中的浸出物含量作为标准含量；所述钩藤碱和所述异钩藤碱含量测定的步骤(1)中，采用高效液相色谱法测定所述钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱含量作为标准含量。
其中，采用高效液相色谱法测定所述钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱含量的具体步骤为：
a取钩藤原药材粉碎过筛，精密称定细粉2g，加入25mL的75％甲醇，置4℃冰箱中冷浸2h，超声提取60min，用75％甲醇补足失重；取提取液于13000r·min-1离心10min，取续滤液为供试品；
对照品制备：分别精密称取钩藤碱对照品5.05mg、异钩藤碱对照品5mg加75％甲醇溶解，并用定量瓶定容至5mL，即得钩藤碱、异钩藤碱混合对照品供试液，其中钩藤碱为1.01mg·mL-1,异钩藤碱为1.00mg·mL-1，置4℃冰箱避光保存,临用前用75％甲醇稀释至所需浓度；
b按照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以浓度为0.01mol·L-1并以冰醋酸调pH7.5的水为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：0-10min，流动相A：流动相B的体积比由20％：80％→65％：35％；10-40min，流动相A：流动相B的体积比由65％：35％→70％：30％；40-50min，流动相A：流动相B的体积比由70％：30％→80％：20％；控制检测波长245nm，流速为0.8mL·min-1；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
所述钩藤药材的合格指标为：水分含量≤10.0％，浸出物含量≥6.0％。
本发明提供了一种由上述的快速检测钩藤药材的方法在钩藤药材质量检测及控制领域中的用途
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，将近红外分析技术引入到钩藤药材的质量检测中，能够对钩藤药材各质控指标(水分、浸出物、钩藤碱和异钩藤碱)的快速测定，实现了对钩藤药材快速的、全面的检测，并且具有操作简单，准确性、精确度高等优点，能快速判断药材质量是否合格，确定药材是否能进入后续生产工艺环节，满足生产中快速、高效的要求，具有现场药材筛选和质量全面评价的应用前景，并且在中药生产中从源头上控制了钩藤原材料的质量，缩短检测时间，节约生产成本，提高生产效率和经济效益，保证了钩藤制剂成品质量的安全、有效；
(2)本发明所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，通过选择钩藤药材的近红外光谱中的各质控指标的光谱波段，提取有效的特征光谱波段，该特征光谱波段与按照现有常规方法测定的各质控指标具有良好的相关性，可有效的监控钩藤药材的水分、浸出物、钩藤碱和异钩藤碱含量；
(3)本发明所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，采用一阶导数、二阶导数、多元散射校正、Norris平滑、减去一条直线、SNV中至少一种方法对剔除了光谱异常值的钩藤药材近红外原始光谱进行预处理，以筛选信息，减少噪音，提高该方法检测钩藤药材的准确性和精确度。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是实施例1所述钩藤药材粉末近红外原始吸收光谱图；
图2是实施例1所述钩藤药材粉末水分含量实测值与近红外预测值的相关图；
图3是实施例1所述钩藤药材粉末浸出物含量实测值与近红外预测值的相关图；
图4是实施例1所述钩藤药材粉末钩藤碱含量实测值与近红外预测值的相关图；
图5是实施例1所述钩藤药材粉末异钩藤碱含量实测值与近红外预测值的相关图；
图6是实施例1所述钩藤药材粉末水分实测值与近红外预测值的柱状比较图；
图7是实施例1所述钩藤药材粉末浸出物实测值与近红外预测值的柱状比较图；
图8是实施例1所述钩藤药材粉末钩藤碱含量实测值与近红外预测值的柱状比较图；
图9是实施例1所述钩藤药材粉末异钩藤碱含量实测值与近红外预测值的柱状比较图。
具体实施方式
本发明所使用的主要设备如下：
近红外光谱仪的型号为MATRIX-Fibre-based Emission、生产厂家为Brukeroptik GmbH。
高效液相色谱仪的型号为Agilent 1200、生产厂家为Agient，USA。
本发明下述实施例提供了一种利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，包括如下水分含量测定、浸出物含量测定、钩藤碱含量测定和异钩藤碱含量测定步骤中的至少一项。
实施例1
A、水分含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知水分含量的来源于不同产地的钩藤药材共110份粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的钩藤药材粉末，备用；其中所述钩藤药材粉末按照烘干法测定所述钩藤药材的水分的含量，获得所述钩藤药材的水分的标准含量，具体步骤如下：
钩藤药材的水分测定根据2010年版《中国药典》中记载的烘干称重法，取烘干至恒重(连续两次称重差异小于5mg)的扁形瓶(X0)，取2g所述钩藤药材粉末，精密称重(X1)，置真空烘箱中105℃烘5h，取出置干燥器中冷却30min，称重，再置真空烘箱中烘1h，称重(X2)，重量差异5mg以上者继续置烘箱中烘，直至差异小于5mg。根据减失的重量，据计算公式水分含量(％)＝(X1－X2+X0)/X1×100计算钩藤药材中含水量(％)。
(3)精密称取所述钩藤药材粉末2g置称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，光谱采集条件为以空气为参比，扫描范围为4000-12000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，每批样品扫描重复3次，取平均光谱，所述钩藤药材粉末近红外原始吸收光谱图见附图1；为提高模型精度，同时将原始光谱在平滑、微分等适宜的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，缩短建模时间，将所述近红外光谱采用减去一条直线光谱法预处理；
(3)选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的水分含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
剔除异常样本后，随机选择80-94个样本作为校正集，14-19个样本作为验证集(用于预测)。所述定量校准模型采用相关系数(R)、相对分析误差(RPD)、交叉验证均方根(RMSECV)和主成分数(Factor)四个参数考察模型性能，同时采用验证集均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)来评价模型对未知样品的预测能力，当R值接近于1，当RPD值大于2.5且越大，评价模型性能越好，预测准确度高，当RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够满足钩藤快速检测的要求，所述定量校准模型适用于所述钩藤药材的检测。如下表1为所述钩藤药材水分的近红外模型的建模结果比较，从表1可以看出近红外模型的线性良好，相关系数均在0.92以上，RPD值在2.5以上，说明所建立的近红外定量校正模型效果较好。水分含量按照烘干方法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图2。
表1钩藤药材水分含量模型参数汇总
| 模型 | R | RPD | RMSECV | Factors |
| 水分含量模型 | 0.9439 | 3.03 | 0.28 | 10 |
另选取验证集的14-19个所述钩藤药材为样品，将所述钩藤药材的7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息导入所述定量校准模型，将定量校准模型用于预测14-19个验证集样品中水分的含量，验证所述定量校准模型的预测性能。所述钩藤药材的水分含量按照烘干常规方法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图6，可以看出水分含量的实测值与近红外预测值接近。如下表2为近红外定量校准模型预测结果的参数汇总，从表2可看出RMSEP均在1.0以下，RSEP在10％以内，说明所建立的定量校准模型具有较好的预测能力和稳定性。
表2钩藤藤药材水分含量的模型预测结果
| 模型 | RMSEP | RSEP(％) |
| 水分含量模型 | 0.50 | 4.74 |
(4)将未知钩藤药材样品按照步骤(2)进行处理得到的所述钩藤药材的7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息导入所述定量校准模型中，然后计算所述待测钩藤药材的水分含量，采用所述利用近红外光谱快速检测钩藤药材的方法计算得到的所述待测钩藤药材水分含量≤10.0％。
实施例2
B、浸出物含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知浸出物含量的来源于不同产地的钩藤药材共110份粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的钩藤药材粉末，备用；其中所述钩藤药材粉末按照热浸法测定所述钩藤药材的浸出物的含量，获得所述钩藤药材的水分浸出物的标准含量，具体步骤如下：
取所述钩藤药材粉末1g，精密称定(X1)，置100mL的锥形瓶中，精密加乙醇25mL，密塞，称定重量，静置1h后超声提取1h。放冷后，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，置于15mL离心管中离心30min，转速为3800r/min，精密量取上清液10mL，置已干燥至恒重的扁形瓶中(X0)，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量(X2)。依据公式浸出物的含量(％)＝(X2－X0)×2.5/X1×100计算所述钩藤药材粉末中浸出物的含量(％)。
(2)精密称取所述钩藤药材粉末2g置称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，光谱采集条件为以空气为参比，扫描范围为4000-12000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，每批样品扫描重复3次，取平均光谱，所述钩藤药材粉末近红外原始吸收光谱图见附图1；为提高模型精度，同时将原始光谱在平滑、微分等适宜的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，缩短建模时间，将所述近红外光谱采用一阶导数和多元散射矫正(MSC)光谱法预处理；
(3)选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的浸出物含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
剔除异常样本后，随机选择80-94个样本作为校正集，14-19个样本作为验证集(用于预测)。所述定量校准模型采用相关系数(R)、相对分析误差(RPD)、交叉验证均方根(RMSECV)和主成分数(Factor)四个参数考察模型性能，同时采用验证集均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)来评价模型对未知样品的预测能力，当R值接近于1，当RPD值大于2.5且越大，评价模型性能越好，预测准确度高，当RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够满足钩藤快速检测的要求，所述定量校准模型适用于所述钩藤药材的检测。如下表3为所述钩藤药材浸出物的近红外模型的建模结果比较，从表3可以看出近红外模型的线性良好，相关系数均在0.92以上，RPD值在2.5以上，说明所建立的近红外定量校正模型效果较好。浸出物含量按照热浸法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图3。
表3钩藤药材浸出物含量模型参数汇总
| 模型 | R | RPD | RMSECV | Factors |
| 浸出物含量模型 | 0.9439 | 3.03 | 0.28 | 10 |
另选取验证集的14-19个所述钩藤药材为样品，将所述钩藤药材的7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息导入所述定量校准模型，将定量校准模型用于预测14-19个验证集样品中浸出物的含量，验证所述定量校准模型的预测性能。所述钩藤药材的浸出物含量按照热浸法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图7，可以看出浸出物含量的实测值与近红外预测值接近。如下表4为近红外定量校准模型预测结果的参数汇总，从表4可看出浸出物的RMSEP均在1.0以下，RSEP在10％以内。
表4钩藤藤药材浸出物含量的模型预测结果
| 模型 | RMSEP | RSEP(％) |
| 浸出物含量模型 | 0.94 | 6.57 |
(4)将未知钩藤药材按照步骤(2)进行近红外光谱扫描，选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息导入所述定量校准模型中，然后计算所述待测钩藤药材的浸出物的含量，采用所述利用近红外光谱快速检测钩藤药材的方法计算得到的所述待测钩藤药材浸出物含量≥6.0％。
实施例3
C、钩藤碱含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知水分含量的来源于不同产地的钩藤药材共110份粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的钩藤药材粉末，备用；其中所述钩藤药材粉末按照高效液相色谱法测定所述钩藤药材的钩藤碱的含量，获得所述钩藤药材的钩藤碱的标准含量，具体步骤如下：
a.预处理方法为：
取所述钩藤药材粉末约2g，精密称定，精密加25mL的质量浓度为75％甲醇，置4℃冰箱中冷浸2h，超声提取60min，用75％甲醇补足失重，然后将提取液转移至1.5mL的离心管中离心10min，转速为13000r·min-1，取上清液，既得供试品；
对照品制备：分别精密称取钩藤碱对照品5.05mg、异钩藤碱对照品5mg加75％甲醇溶解，并用定量瓶定容至5mL，即得钩藤碱、异钩藤碱混合对照品供试液，其中钩藤碱为1.01mg·mL-1,异钩藤碱为1.00mg·mL-1，置4℃冰箱避光保存,临用前用75％甲醇稀释至所需浓度；
b.液相色谱条件：
色谱柱：Aglient ZORBAX 80A Extend-C18分析柱(4.6×250mm，5μm)；以浓度为0.01mol·L-1并以冰醋酸调pH7.5的水为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：0-10min，流动相A：流动相B的体积比由20％：80％→65％：35％；10-40min，流动相A：流动相B的体积比由65％：35％→70％：30％；40-50min，流动相A：流动相B的体积比由70％：30％→80％：20％；控制检测波长245nm，流速为0.8mL·min-1，进样量为10μL，出峰时间为24min，收集含有钩藤碱的流份，检测钩藤碱的含量。
(2)精密称取所述钩藤药材粉末2g置称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，光谱采集条件为以空气为参比，扫描范围为4000-12000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，每批样品扫描重复3次，取平均光谱，所述钩藤药材粉末近红外原始吸收光谱图见附图1；为提高模型精度，同时将原始光谱在平滑、微分等适宜的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，缩短建模时间，将所述近红外光谱采用一阶导数和减去一条直线光谱法预处理；
(3)选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
剔除异常样本后，随机选择80-94个样本作为校正集，14-19个样本作为验证集(用于预测)。所述定量校准模型采用相关系数(R)、相对分析误差(RPD)、交叉验证均方根(RMSECV)和主成分数(Factor)四个参数考察模型性能，同时采用验证集均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)来评价模型对未知样品的预测能力，当R值接近于1，当RPD值大于2.5且越大，评价模型性能越好，预测准确度高，当RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够满足钩藤快速检测的要求，所述定量校准模型适用于所述钩藤药材的检测。如下表51为所述钩藤药材钩藤碱的近红外模型的建模结果比较，从表5可以看出近红外模型的线性良好，相关系数均在0.92以上，RPD值在2.5以上，说明所建立的近红外定量校正模型效果较好。钩藤碱含量按照高效液相色谱法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图4。
表5钩藤药材钩藤碱含量模型参数汇总
| 模型 | R | RPD | RMSECV | Factors |
| 钩藤碱含量模型 | 0.9402 | 2.94 | 0.01 | 9 |
另选取验证集的14-19个所述钩藤药材为样品，将所述钩藤药材的6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息导入所述定量校准模型，将定量校准模型用于预测14-19个验证集样品中水分的含量，验证所述定量校准模型的预测性能。所述钩藤药材的钩藤碱含量按照高效液相色谱法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图8。如下表6为近红外定量校准模型预测结果的参数汇总，从表6可看出钩藤药材中钩藤碱的含量较低，实际预测效果欠佳。
表6钩藤藤药材钩藤碱含量的模型预测结果
| 模型 | RMSEP | RSEP(％) |
| 钩藤碱含量模型 | 0.05 | 53.85 |
(4)将未知钩藤药材按照步骤(2)进行近红外光谱扫描，选取6101.8-4597.6cm-1的光谱波段下的光谱信息导入所述定量校准模型中，然后计算所述待测钩藤药材的钩藤碱的含量。
实施例4
D、异钩藤碱含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知异钩藤碱含量的来源于不同产地的钩藤药材共110份粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的钩藤药材粉末，备用；其中所述钩藤药材粉末按照高效液相色谱法测定所述钩藤药材的异钩藤碱的含量，获得所述钩藤药材的异钩藤碱的标准含量，具体步骤如下：
a.预处理方法为：取所述钩藤药材粉末约2g，精密称定，精密加25mL的质量浓度为75％甲醇，置4℃冰箱中冷浸2h，超声提取60min，用75％甲醇补足失重，然后将提取液转移至1.5mL的离心管中离心10min，转速为13000r·min-1，取上清液，既得供试品；
对照品制备：分别精密称取钩藤碱对照品5.05mg、异钩藤碱对照品5mg加75％甲醇溶解，并用定量瓶定容至5mL，即得钩藤碱、异钩藤碱混合对照品供试液，其中钩藤碱为1.01mg·mL-1,异钩藤碱为1.00mg·mL-1，置4℃冰箱避光保存,临用前用75％甲醇稀释至所需浓度；
b.液相色谱条件：色谱柱：Aglient ZORBAX 80A Extend-C18分析柱(4.6×250mm，5μm)；以浓度为0.01mol·L-1并以冰醋酸调pH7.5的水为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：0-10min，流动相A：流动相B的体积比由20％：80％→65％：35％；10-40min，流动相A：流动相B的体积比由65％：35％→70％：30％；40-50min，流动相A：流动相B的体积比由70％：30％→80％：20％；控制检测波长245nm，流速为0.8mL·min-1，进样量为10μL，出峰时间为21.4min，收集含有异钩藤碱的流份，检测异钩藤碱的含量。
(2)精密称取所述钩藤药材粉末2g置称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，光谱采集条件为以空气为参比，扫描范围为4000-12000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，每批样品扫描重复3次，取平均光谱，所述钩藤药材粉末近红外原始吸收光谱图见附图1；为提高模型精度，同时将原始光谱在平滑、微分等适宜的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，缩短建模时间，将所述近红外光谱采用一阶导数和减去一条直线光谱法预处理；
(3)选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的异钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
剔除异常样本后，随机选择80-94个样本作为校正集，14-19个样本作为验证集(用于预测)。所述定量校准模型采用相关系数(R)、相对分析误差(RPD)、交叉验证均方根(RMSECV)和主成分数(Factor)四个参数考察模型性能，同时采用验证集均方根(RMSEP)和预测相对偏差(RSEP)来评价模型对未知样品的预测能力，当R值接近于1，当RPD值大于2.5且越大，评价模型性能越好，预测准确度高，当RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够满足钩藤快速检测的要求，所述定量校准模型适用于所述钩藤药材的检测。如下表7为所述钩藤药材水分的近红外模型的建模结果比较，从表7可以看出近红外模型的线性良好，相关系数均在0.92以上，RPD值在2.5以上，说明所建立的近红外定量校正模型效果较好。异钩藤碱含量按照高效液相色谱方法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图5。
表7钩藤药材异钩藤碱含量模型参数汇总
| 模型 | R | RPD | RMSECV | Factors |
| 异钩藤碱含量模型 | 0.9333 | 2.78 | 0.01 | 9 |
另选取验证集的14-19个所述钩藤药材为样品，将所述钩藤药材的6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息导入所述定量校准模型，将定量校准模型用于预测14-19个验证集样品中异钩藤碱的含量，验证所述定量校准模型的预测性能。所述钩藤药材的异钩藤碱含量按照高效液相色谱方法测定的实测值(标准含量)和利用所述定量校准模型计算得到的预测值之间的相关图见附图9。如下表8为近红外定量校准模型预测结果的参数汇总，从表8可看出钩藤药材中异钩藤碱的含量较低，实际预测效果欠佳。
表8钩藤药材异钩藤碱含量的模型预测结果
| 模型 | RMSEP | RSEP(％) |
| 异钩藤碱含量模型 | 0.05 | 58.58 |
(4)将未知钩藤药材按照步骤(2)进行近红外光谱扫描，选取6101.8-4597.6cm-1的光谱波段下的光谱信息导入所述定量校准模型中，然后计算所述待测钩藤药材的异钩藤碱的含量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (7)
1.一种利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，包括如下水分含量测定、浸出物含量测定及钩藤碱和异钩藤碱含量测定步骤中的至少一项：
A、水分含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知水分含量的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的水分含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的水分含量值；
B、浸出物含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知浸出物含量的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的浸出物含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取7501.9-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的浸出物含量值；
C、钩藤碱含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知钩藤碱的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的钩藤碱含量值；
D、异钩藤碱含量的测定包括如下步骤：
(1)选取已知异钩藤碱含量的钩藤药材，粉碎过筛，得所述钩藤药材粉末，备用；
(2)将上述处理后的钩藤药材粉末进行近红外光谱扫描，采集所述钩藤药材的近红外光谱；
(3)选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，应用化学计量学软件与已知的所述钩藤药材的异钩藤碱含量进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与标准含量之间的定量校准模型；
(4)按照所述步骤(2)的方法对未知钩藤药材样品进行近红外光谱扫描，并选取6101.8-4597.6cm-1特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校准模型获得所述未知钩藤药材样品的异钩藤碱含量值；
还包括采用高效液相色谱法测定所述钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱含量的具体步骤为：
a取钩藤原药材粉碎过筛，精密称定细粉2g，加入25mL的75％甲醇，置4℃冰箱中冷浸2h，超声提取60min，用75％甲醇补足失重；取提取液于13000r·min-1离心10min，取续滤液为供试品；
对照品制备：分别精密称取钩藤碱对照品5.05mg、异钩藤碱对照品5mg加75％甲醇溶解，并用定量瓶定容至5mL，即得钩藤碱、异钩藤碱混合对照品供试液，其中钩藤碱为1.01mg·mL-1,异钩藤碱为1.00mg·mL-1，置4℃冰箱避光保存,临用前用75％甲醇稀释至所需浓度；
b按照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以浓度为0.01mol·L-1并以冰醋酸调pH7.5的水为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：0-10min，流动相A：流动相B的体积比由20％：80％→65％：35％；10-40min，流动相A：流动相B的体积比由65％：35％→70％：30％；40-50min，流动相A：流动相B的体积比由70％：30％→80％：20％；控制检测波长245nm，流速为0.8mL·min-1；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定；
所述水分含量测定、所述浸出物含量测定以及所述钩藤碱含量测定和所述异钩藤碱含量测定步骤的所述步骤(3)中，还包括对建立的所述定量校准模型的预测性能进行评价的步骤，所述评价指标包括相关系数R、相对分析误差RPD、交叉验证均方根RMSECV、主成分数Factor、验证集均方根RMSEP和预测相对偏差RSEP，若R值接近于1，RPD值大于2.5，且RSEP值小于10％时，所述定量校准模型适用于所述钩藤药材的检测；反之，则不适用。
2.根据权利要求1所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，所述水分含量测定、所述浸出物含量测定、所述钩藤碱含量测定和所述异钩藤碱含量测定步骤的所述步骤(2)中，采用漫反射法进行所述钩藤药材粉末的近红外光谱采集，具体条件为以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-12000cm-1。
3.根据权利要求1或2所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，所述水分含量测定、所述浸出物含量测定、所述钩藤碱含量测定和所述异钩藤碱含量测定步骤的所述步骤(2)中，还包括对采集到的所述近红外光谱采用一阶导数、二阶导数、多元散射校正、Norris平滑、减去一条直线和SNV中的至少一种方法进行预处理的步骤。
4.根据权利要求3所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，所述水分含量测定的步骤中，采用减去一条直线光谱法对采集到的所述近红外光谱进行预处理；所述浸出物含量测定的步骤中，采用一阶导数和多元散射矫正光谱法对采集到的所述近红外光谱进行预处理；所述钩藤碱和所述异钩藤碱含量的测定步骤中，采用一阶导数和减去一条直线光谱法对采集到的所述近红外光谱进行预处理。
5.根据权利要求1或2或4所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，所述水分含量测定的步骤(1)中，采用烘干法测定所述钩藤药材中的水分含量作为标准含量；所述浸出物含量测定的步骤(1)中，采用热浸法测定所述钩藤药材中的浸出物含量作为标准含量；所述钩藤碱和异钩藤碱含量测定的步骤(1)中，采用高效液相色谱法测定所述钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱含量作为标准含量。
6.根据权利要求1或2或4所述的利用近红外光谱法快速检测钩藤药材的方法，其特征在于，所述钩藤药材的合格指标为：水分含量≤10.0％，浸出物含量≥6.0％。
7.权利要求1或2或4所述的快速检测钩藤药材的方法在钩藤药材质量检测及控制领域中的用途。
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