CN108627581B - 一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法 - Google Patents

一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节pH值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；(3)高效液相色谱法测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：乙腈(A):0.02‑0.07％二乙胺‑(7‑10)mM醋酸铵(B)＝40‑60:60‑40V/V；流速：0.8‑1.2mL/min；洗脱时间：35‑60分钟；柱温：25‑35℃；检测波长：240‑250nm；该含量测定方法操作简单、准确反映产品的真实含量，适合产业化日常生产检验。

Description

一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法
技术领域
本发明涉及一种中药的检测方法，尤其是涉及小儿七星茶颗粒的质量控制方法。
背景技术
小儿七星茶颗粒作为民间传统的小儿消滞凉茶，其主要功能为开胃消滞、清热定惊，用于小儿积滞化热、消化不良、不思饮食、烦躁易惊、夜寐不安、大便不畅、小便短赤。本品种被收录于2015年版《中国药典》一部，标准中的鉴别项下对山楂和甘草进行鉴定；含量测定项下对甘草酸进行含量测定，并不能全面评价本品种的质量，标准有待进行提高。其中，钩藤具有清热镇惊、平肝熄风功能，是本品起定惊作用的主药。钩藤碱和异钩藤碱是钩藤的主要生物碱之一，二者占钩藤总碱的40％以上，主要作用于心血管系统和中枢神经系统，具有降低血压、扩张血管、减慢心率和抑制心肌收缩力等生物效应。因此评价钩藤及其制剂质量多以钩藤总生物碱或钩藤碱含量为指标。
在钩藤的质量控制方面，中国药典对钩藤的药材性状、异钩藤碱的薄层色谱鉴别作相关规定，尚未收录钩藤碱的TLC薄层鉴别，也没有钩藤生物碱的含量测定项。由于药品成分复杂，关于小儿七星茶颗粒中钩藤生物碱的检测方法极少，已报道的方法主要测定钩藤碱含量，且灵敏度低、分离度差，尚未有同时测定钩藤碱和异钩藤碱的方法报道，无法全面评价成份中钩藤的质量，较难应用于小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的检测。
综上所述，采用HPLC色谱分离技术对小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱同时进行准确的定量测定，能提高对小儿七星茶颗粒产品质量的全面评价，对产品的质量管控具有重要的意义。
发明内容
鉴于上述技术问题，本发明的目的在于提供一种高效液相测定小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量的方法。该含量测定方法操作简单、准确反映产品的真实含量，适合产业化日常生产检验。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：
(1)混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；
(2)供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，加入热水溶解，超声处理，放冷，用氨水调节pH值，再用乙酸乙酯振摇提取，回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇溶解，即可；
(3)高效液相色谱法测定：
色谱条件为：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈(A):(0.02-0.07)％二乙胺-(7-10)mM醋酸铵(B)＝40-60:60-40V/V；
流速：0.8-1.2mL/min；
洗脱时间：35-60分钟；
柱温：25-35℃；
检测波长：240-250nm；
测定法：分别将步骤(1)的混合对照品溶液和步骤(2)的供试品溶液进行高效液相色谱测定。
进一步优选，本发明步骤(2)供试品溶液的制备：
准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3-5倍量(g/ml)60-80℃热水使溶解，超声处理30-90min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3-5倍量(g/ml)乙酸乙酯振摇提取1-3次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。
进一步优选，步骤(2)供试品溶液的制备：
准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3.6倍量60℃热水使溶解，超声处理60min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3.6倍量乙酸乙酯振摇提取2次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。
本发明所述的步骤(3)进一步优选流动相为乙腈(A):(0.02-0.05)％二乙胺-(7-9)mM醋酸铵(B)＝40-60:60-40V/V。
最佳流动相：乙腈(A):0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(B)，梯度洗脱如表1
表1梯度洗脱
时间 A相 B相
0-26min 42％ 58％
26-31min 60％ 40％
31-38min 60％ 40％
38-43min 42％ 58％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器：DAD，检测波长为247nm。
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶的碱性柱，优选Zorbax Extend C18柱。
本品每1g以钩藤碱和异钩藤碱总和计，不得少于6.0μg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
中药组方成份复杂，提取富集目标成份，使用合适的色谱条件进行分析是两个难点。
一、本研究通过考察比较不同溶剂的提取率，找到了适用于钩藤生物碱的萃取溶液。
供试品的制备：1、本发明所选择60℃-80℃热水，能够加速有效成分在颗粒中的溶出，尤其是60℃效果最明显。钩藤药材溶液中生物碱在60～80℃长时间加热条件下稳定性较差，钩藤碱、异钩藤碱相互转化。本发明人发现钩藤碱、异钩藤碱超声提取时间短，则提取不完全，若低于30分钟，超声加样回收率过低；超过90分钟，钩藤碱、异钩藤碱不稳定。因此，只有在本发明的超声提取范围内，才能将钩藤中钩藤碱与异钩藤碱完全提取出来且提取物放置24h均稳定，超声加样回收率合格。2、钩藤碱、异钩藤碱易溶解于氨水中，但是氨水在超声提取中的添加过程是非常重要的。氨水挥发性强，超声过程发热使氨水挥发导致pH不稳定，影响目标成份的萃取效率及准确率。因此氨水必须在超声之后冷置室温后才能加入。3、考察多种萃取溶剂如甲醇、乙醚、氯仿和乙酸乙酯的提取率。结果表明，乙酸乙酯的提取率明显高于其他几种溶剂，因此选择乙酸乙酯作为提取剂。详细见实验例部分。
二、由于成份复杂，色谱条件使用的有机相、pH调节剂、梯度等都会影响色谱分析效果。通过对不同有机相、pH调节剂以及梯度等进行了考察，最终得到适用于小儿七星茶中钩藤生物碱成分的分析测定。与现有报道的小儿七星茶中钩藤生物碱测定方法相比，分离效果有明显提高。
1、现有技术公开流动相有甲醇-三乙胺-冰醋酸调PH5-7、氨水、磷酸等，本发明筛选流动相时发现三乙胺碱性强，液相基线很难跑平。并且由于三乙胺在柱子的高残留性，对柱子寿命影响较大。二乙胺残留性相对没有那么强，作为离子抑制剂，对生物碱拖尾改善很明显。综合考虑采用二乙胺代替三乙胺。
2、经研究，小儿七星茶颗粒在液相条件中使用磷酸时，导致目标成份的出峰时间过早，受干扰峰影响较多，不利于分离与分析目标成份。另外，不用磷酸还考虑到磷酸为非挥发性酸，残留性也较强，对柱子伤害会比较大。
3、氨水挥发性强，使用氨水的条件稳定性没有醋酸铵的稳定性好。对液相条件的重复度有影响。而使用醋酸铵时的出峰时间适中，不受干扰峰影响。
4、本发明液相条件的pH约为8，在普通色谱柱的pH范围(1-8)的上限。为了保护液相色谱柱，本发明根据色谱流动相条件选择有针对的碱性柱，如使用Zorbax Extend C18(2-11.5)类似的耐碱柱。
三、本发明采用反相高效液相色谱法同时测定小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的含量，钩藤碱含量的定量限(S/N＝10)为0.012μg/mL，平均回收率为80％-115％，相对标准偏差小于6％；异钩藤碱含量的定量限(S/N＝10)为0.007μg/mL，平均回收率为80％-115％，相对标准偏差小于6％。采用本发明的方法同时检测小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的含量，前处理简单，分离度好且准确度高，能适用于小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量的准确测定，也非常适合小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱的批量检测；为小儿七星茶颗粒产品质量控制、产品安全监测提供重要技术支持，具有良好的经济与社会效益。
附图说明
图1为钩藤碱标准曲线；
图2为异钩藤碱的标准曲线；
图3为钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液色谱图；
图4为小儿七星茶颗粒供试样品色谱图；
图5为小儿七星茶颗粒阴性样品溶液色谱图；
图6考察不同温度纯化水对钩藤生物碱提取效果的影响；
图7考察超声时间对钩藤生物碱提取效果的影响；
图8为流动相：甲醇:0.04％二乙胺-9mM醋酸铵(65:35)的色谱图；
图9为流动相：乙腈:0.04％二乙胺-9mM醋酸铵(42:58)的色谱图；
图10为流动相：乙腈-0.02％三乙胺(45:55)的色谱图；
图11为流动相：乙腈:0.04％二乙胺(42:58)的色谱图；
图12为流动相：乙腈:0.04％二乙胺-9mM醋酸铵(42:58)的色谱图；
图13为流动相：乙腈:0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(42:58)的色谱图；
图14为流动相：乙腈:0.04％二乙胺-0.04％磷酸(25:75)的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
1、含量测定方法：按照高效液相色谱法(中国药典2015年版通则0512)进行测定。
药品及仪器见表2、3
表2：本次实验所用的仪器
Figure GDA0002941211080000051
表3：本次实验所用的试剂
Figure GDA0002941211080000061
2、高效液相色谱法测定小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量的色谱条件与系统适应性试验如下所述。
(1)混合对照品溶液的制备
称取钩藤碱(纯度大于99.0％，上海同田生物技术股份有限公司)和异钩藤碱(纯度大于99.0％，中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液。
(2)供试品溶液的制备
准确称取小儿七星茶颗粒28g，置于具塞椎形瓶中，加入60℃热水100mL使溶解，超声处理60min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用100mL乙酸乙酯振摇提取2次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。
(3)阴性样品溶液的制备
取除钩藤外的其他药材，按样品处方比例及制备工艺制成缺钩藤的制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
(4)高效液相色谱测定
精密吸取步骤(1)的混合对照品溶液、步骤(2)的供试品溶液和步骤(3)的阴性样品溶液各20μL，分别进行高效液相色谱测定，条件如下：
流动相：乙腈(A):0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(B)，梯度洗脱
Figure GDA0002941211080000062
Figure GDA0002941211080000071
色谱柱：安捷伦Zorbax Extend-C18柱，规格为4.6×250mm，粒径为5μm；
流速：1mL/min；
洗脱时间43分钟；
柱温：30℃；
检测器：安捷伦二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为247nm。
本品每1g以钩藤碱和异钩藤碱总和计，不得少于6.0μg。
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。钩藤碱和异钩藤碱的理论板数应不低于4000；分离度应大于1.5；灵敏度：信噪比应大于10。
(5)系统适应性
吸取混合对照品溶液20μL，注入液相色谱议，连续进样5次，考察混合对照品溶液主色谱峰面积的RSD值，RSD值应≤2.0％。表4
表4系统适应性数据
Figure GDA0002941211080000072
(6)绘制钩藤碱和异钩藤碱的标准曲线
以甲醇为溶剂，分别配制浓度为82.6mg/L，150.3mg/L，330.4mg/L，495.6mg/L，660.8mg/L，826.0mg/L，991.2mg/L的钩藤碱标准溶液，按浓度由低到高精密吸取20μL，按照步骤(2)的高效液相色谱条件依次进行检测，以色谱峰面积为纵坐标，以钩藤碱标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得R2值，所述标准曲线如图1所示。钩藤碱浓度在82.6-991.2mg/L范围内，浓度与其对应的峰面积值呈良好线性关系，求得线性回归方程为y＝29678x+731599，R2为0.9991。
以甲醇为溶剂，分别配制浓度为0.11mg/L，0.21mg/L，0.43mg/L，0.64mg/L，0.86mg/L，1.07mg/L，1.29mg/L的异钩藤碱标准溶液，按浓度由低到高精密吸取20μL，按照步骤(2)的高效液相色谱条件依次进行检测，以色谱峰面积为纵坐标，以异钩藤碱标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得R2值，所述标准曲线如图2所示。异钩藤碱浓度在0.11-1.29mg/L范围内，浓度与其对应的峰面积值呈良好线性关系，求得线性回归方程为y＝26555x+1000000，R2为0.9999。
(7)重复性：
对一批次产品按照步骤(2)制备方法处理，分别制备6份样品溶液。吸取上述混合对照品和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分别计算6份供试品含量，表5，结果RSD应≤6％。
表5重复性实验
Figure GDA0002941211080000081
(8)中间精密度：
由两名检验人员分别独立对同三批次产品按照步骤(2)制备方法处理，分别制备6份样品溶液。吸取上述混合对照品和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，分别计算6份供试品含量，表6、7，结果RSD应≤11％。
表6钩藤碱中间精密度实验
Figure GDA0002941211080000082
Figure GDA0002941211080000091
表7异钩藤碱中间精密度实验
Figure GDA0002941211080000092
(9)准确度：
在已知含量的样品中分别加入高、中、低质量浓度的钩藤碱和异钩藤碱对照溶液，再按照步骤(2)制备方法处理。吸取上述混合对照品和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，计算加样回收率，回收率范围应在80％～115％。表8
表8回收率实验
Figure GDA0002941211080000093
(10)定量限：
移取上述混合对照品最低浓度的稀释溶液适量，不断稀释，精密量取各溶液20μL，分别注入液相色谱仪，信噪比(S/N)＝10，即为定量限。样品中钩藤碱的定量限为0.012μg/mL，异钩藤碱的定量限为0.007μg/mL。
(11)耐用性
吸取混合对照品和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，选择两种不同的品牌的色谱柱分别进样，测得的2份结果含量RSD≤6％。
表9色谱柱比较
Figure GDA0002941211080000101
表9可见，优选Agilent Zorbax Extend-C18为本发明的色谱柱。
(12)样品含量测定
按供试品溶液制备项下方法分别制得3批供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液20μL，依次进样，测定。计算出钩藤碱和异钩藤碱的含量和总含量。
表10含量测定结果
Figure GDA0002941211080000102
实施例2
(1)混合对照品溶液的制备
称取钩藤碱(纯度大于99.0％，上海同田生物技术股份有限公司)和异钩藤碱(纯度大于99.0％，中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液。
(2)供试品溶液的制备
准确称取小儿七星茶颗粒28g，置于具塞椎形瓶中，加入70℃热水84mL使溶解，超声处理30min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用84mL乙酸乙酯振摇提取1次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。
(3)高效液相色谱测定
精密吸取步骤(1)的混合对照品溶液、步骤(2)的供试品溶液和步骤(3)的阴性样品溶液各20μL，分别进行高效液相色谱测定，条件如下：
色谱柱：安捷伦Zorbax Extend-C18柱，规格为4.6×250mm，粒径为5μm；
流动相：乙腈(A):0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(B)，梯度洗脱
时间 A相 B相
0-26min 42％ 58％
26-31min 60％ 40％
31-38min 60％ 40％
38-43min 42％ 58％
；
流速：1mL/min；
洗脱时间43分钟；
柱温：30℃；
检测器：安捷伦二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为247nm。
本品每1g以钩藤碱和异钩藤碱总和计，不得少于6.0μg。
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。钩藤碱和异钩藤碱的理论板数应不低于4000；分离度应大于1.5；灵敏度：信噪比应大于10。
实施例3
(1)混合对照品溶液的制备
称取钩藤碱(纯度大于99.0％，上海同田生物技术股份有限公司)和异钩藤碱(纯度大于99.0％，中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液。
(2)供试品溶液的制备
准确称取小儿七星茶颗粒28g，置于具塞椎形瓶中，加入80℃热水140mL使溶解，超声处理90min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用140mL乙酸乙酯振摇提取3次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。
(3)高效液相色谱测定
精密吸取步骤(1)的混合对照品溶液、步骤(2)的供试品溶液和步骤(3)的阴性样品溶液各20μL，分别进行高效液相色谱测定，条件如下：
色谱柱：安捷伦Zorbax Extend-C18柱，规格为4.6×250mm，粒径为5μm；
流动相：乙腈(A):0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(B)，梯度洗脱
时间 A相 B相
0-26min 42％ 58％
26-31min 60％ 40％
31-38min 60％ 40％
38-43min 42％ 58％
；
流速：1mL/min；
洗脱时间43分钟；
柱温：30℃；
检测器：安捷伦二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为247nm。
本品每1g以钩藤碱和异钩藤碱总和计，不得少于6.0μg。
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。钩藤碱和异钩藤碱的理论板数应不低于4000；分离度应大于1.5；灵敏度：信噪比应大于10。
为了更好的阐述本发明的有益效果，通过下述试验例加以说明
试验例一供试品溶液筛选试验
(一)供试品超声提取实验：
考察了超声提取温度对钩藤生物碱提取效果的影响，结果：热水的提取效果比冷水提取效果好，尤其是60-90℃。见图6、从左至右分别为1：小儿七星茶(60℃热水提取)；2：小儿七星茶(90℃热水提取)；3：小儿七星茶(室温(15℃)水提取)；4：钩藤对照药材；5：异钩藤碱；6：钩藤碱；7：钩藤阴性对照；考察不同超声时间对钩藤生物碱提取效果的影响。结果可知，30min与60min的提取效果较好。图7从左至右分别为1：小儿七星茶(提取时间：15min)；2：小儿七星茶(提取时间：30min)；3：小儿七星茶(提取时间：60min)；4：钩藤对照药材；5：异钩藤碱；6：钩藤碱；7：钩藤阴性对照。
(二)乙酸乙酯萃取试剂的筛选试验
考察不同萃取试剂的提取效果，由下表11可知，乙酸乙酯对钩藤生物碱的提取效果最好。
表11各萃取溶剂的钩藤碱、异钩藤碱峰面积
Figure GDA0002941211080000131
试验例二流动相选择
(一)流动相有机相筛选
考察甲醇和乙腈作为流动相有机相的分离度，结果见图8(流动相：甲醇:0.04％二乙胺:9mM醋酸铵(65:35))、图9(流动相：乙腈:0.04％二乙胺:9mM醋酸铵(42:58))。
结果：甲醇条件下两峰分离度好，但是异钩藤碱出峰早，受杂质峰干扰严重。乙腈虽然主峰分离度稍差，但保留时间适当，不受杂质峰干扰。后期通过水相调整改进分离度。因此有机相选用乙腈。
(二)流动相pH调节剂的筛选
1、考察了三乙胺溶液作为流动相水相。图10流动相：乙腈-0.02％三乙胺(45:55)，
结果：三乙胺的基线飘移较严重。
2、考察了二乙胺溶液作为流动相水相。图11流动相：乙腈:0.04％二乙胺(42:58)。结果：基线飘移比使用三乙胺好，但在主峰出峰时间之后还是有一些飘移，再通过加入醋酸铵，解决了基线飘移问题，如图12，流动相：乙腈:0.04％二乙胺-9mM醋酸铵(42:58)。但需要改进主峰的分离度，在提高二乙胺的量到0.05％后，主峰分离度达到要求。图13
流动相：乙腈:0.05％二乙胺-9mM醋酸铵(42:58)
3、考察了磷酸-二乙胺溶液作为流动相水相，结果见图14流动相：乙腈:0.04％二乙胺-0.04％磷酸(25:75)，异钩藤碱的拖尾比较严重；且由于出峰时间早，杂质峰干扰严重。
4、考察了氨水溶液作为流动相，实验过程中发现主峰的出峰时间不稳定，可能与氨水易挥发性有关。
通过以上(1)-(4)对比试验结果的比较，乙腈:0.05％二乙胺:9mM醋酸铵(42:58)的分离效果好，受杂质峰的干扰少等优点，故选用之。
(三)流动相梯度筛选
使用梯度流动相是为了把残留在色谱柱的成分清洗干净，不对后续样品测定造成影响。本方法的关键技术点是在梯度变化前的流动相。后段的梯度变化是先提高有机相比例将残留成分洗出，然后再回到初始比例。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，其包括如下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：称取钩藤碱和异钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；
（2）供试品溶液的制备：准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3-5倍量60-80℃热水使溶解，超声处理30-90min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3-5倍量乙酸乙酯振摇提取1-3次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；
（3）高效液相色谱法测定：
色谱条件为：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈 (A):（0.02%-0.07%）二乙胺-（7-10）mM醋酸铵 (B)；
流速：0.8-1.2mL/min；
洗脱时间：35-60分钟；
柱温：25-35℃；
检测波长：240-250nm；
测定法：分别将步骤（1）的混合对照品溶液和步骤（2）的供试品溶液进行高效液相色谱测定；
步骤（3）中流动相梯度洗脱，
时间 A相 B相 0-26min 42% 58% 26-31min 60% 40% 31-38 min 60% 40% 38-43 min 42% 58%
。
2.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤（2）供试品溶液的制备：
准确称取小儿七星茶颗粒，置于具塞椎形瓶中，加入3.6倍量60℃热水使溶解，超声处理60min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用3.6倍量乙酸乙酯振摇提取2次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。
3.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述步骤（3）中色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的碱性柱；
流动相：乙腈 (A):0.05%二乙胺-9mM醋酸铵 (B)，梯度洗脱
时间 A相 B相 0-26min 42% 58% 26-31min 60% 40% 31-38 min 60% 40% 38-43 min 42% 58%
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测器： DAD，检测波长为247nm。
4.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 混合对照品溶液的制备
称取钩藤碱适量，精密称定，加甲醇配制成钩藤碱和异钩藤碱的混合对照溶液；
(2) 供试品溶液的制备
准确称取小儿七星茶颗粒28g，置于具塞椎形瓶中，加入热水100mL使溶解，超声处理60min，放冷，用氨水调节pH值至9-10，再用100mL乙酸乙酯振摇提取2次，合并回收乙酸乙酯液，残渣加甲醇1mL使溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；
(3) 阴性样品溶液的制备
取除钩藤外的其他药材，按样品处方比例及制备工艺制成缺钩藤的制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
(4) 高效液相色谱测定
精密吸取步骤(1)的混合对照品溶液、步骤(2)的供试品溶液和步骤(3)的阴性样品溶液各20μL，分别进行高效液相色谱测定，条件如下：
色谱柱：C18柱，
流动相：乙腈 (A):0.05%二乙胺-9mM醋酸铵 (B)，梯度洗脱
时间 A相 B相 0-26min 42% 58% 26-31min 60% 40% 31-38 min 60% 40% 38-43 min 42% 58%
；
流速：1mL/min；
洗脱时间43分钟；
柱温：30℃；
检测器： DAD，检测波长为247nm；
本品每1g以钩藤碱和异钩藤碱总和计，不得少于6.0μg；
钩藤碱和异钩藤碱的理论板数应不低于4000；分离度应大于1.5；灵敏度：信噪比应大于10。
5.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，钩藤碱含量的定量限S/N=10为0.012μg/mL，平均回收率为80%-115%，相对标准偏差小于6%；异钩藤碱含量的定量限S/N=10为0.007μg/mL，平均回收率为80%-115%，相对标准偏差小于6%。
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